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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,SDS-PAGE,鉴定菠萝蛋白酶的纯度,一、实验目的,1,、学习和掌握电泳（,SDS-PAGE,）的基本原理及电泳技术。,2,、熟练配制,SDS-PAGE,相关各种,试剂。,二、实验原理,电泳,:,带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动，这种现象称为电泳。,影响电泳的主要因素,（,1,）,颗粒性质,：一般说来，颗粒带净电荷量越大，或其直径越小，或其形状越接近球形，在电场中的泳动速度就快。反之，则越慢。,（,2,）,电场强度,：电场强度越高，带电颗粒的泳动速度越快。反之，则越慢。,（,3,）,pH,值,（,4,）,离子强度,：溶液的离子强度一般在,0.02,0.2mol/kg,之间电泳较合适。,（,5,）,溶液粘度,（,6,）,电渗,（,7,）,焦耳热,（,8,）,筛孔,聚丙烯酰胺凝胶电泳,是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持物的一种电泳。,这种凝胶是由丙烯酰胺单体,(,简称,Acr),和交联剂,N,，,N-,甲叉双丙烯酰胺,(,简称,Bis),，在催化剂的作用下聚合而成的。,聚丙烯酰胺凝胶聚合的体系有两种,，即化学聚合和光聚合。,化学聚合,的引发剂是过硫酸铵,(NH4),2,S,2,O,3,(,简称,Ap),，催化剂是,N,，,N,，,N,，,N,-,四甲基乙二胺,(,TEMED,),。在催化剂,TEMED,的作用下，由过硫酸铵,(Ap),形成氧的自由基，后者又使单体形成自由基，从而引起聚合作用。,聚丙烯酰胺凝胶的质量主要由凝胶浓度和交联度决定。,每,100mL,凝胶溶液中含有的单体,(Acr),和交联剂,(Bis),总克数称为凝胶浓度，用,T,表示。,凝胶溶液中，交联剂,(Bis),占单体,(Acr),和交联剂,(Bis),总量的百分数称为交联度，用,C,表示。,不连续的聚丙烯酰胺凝胶电泳,，带电颗粒在电场中的泳动有,电荷效应,、,分子筛效应,还具有,浓缩效应,。,(l),浓缩效应,(2),电荷效应,(3),分子筛效应,Gel,5%,10%,15%,29,45,66,97,200,29,45,66,97,200,29,45,66,97,200,实验试剂配制,30%,凝胶贮液：,取,30g,丙烯酰胺（,Acr,）、,0.8g,甲叉双丙烯酰胺,(Bis),（先用约,50ml,蒸馏水溶解，如溶解不了,可加热,3050,溶解,再用量筒定容至,100ml,，然后过滤，后置于棕色瓶,4,下保存备用）,。,聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套,(2),10%,过硫酸铵,(AP),溶液：,取,2g,过硫酸铵溶解后，用,20ml dH,2,O,溶解，现配现用。,(3),1 mol/L HCl,500ml,：取浓,HCl 42 ml,，加蒸馏水至,500 ml(,在通风橱中操作,),。,(4),分离胶缓冲溶液（,1.5mol/L Tris-HCl,缓冲液，,pH8.8,）,:,取,18.15g Tris,溶解后，加,1mol/L HCl,溶液约,48ml,，调,pH,至,8.8,定容至,100ml,。,(5),浓缩胶缓冲液,(0.5mol/L Tris-HCl,缓冲液,pH6.8):,取,6g Tris,溶解后，加,1mol/L HCl,溶液,40ml,，调,pH,至,6.8,，定容至,100ml,。,(6)10%SDS(,十二烷基硫酸钠,),溶液,:,取,5g SDS,加水定容至,50ml,。（加热溶解）,(7),2,电极缓冲液,(0.1%SDS0.05mol/L Tris0.384mol/L,甘氨酸缓冲液，,pH8.3):,取,6gTris,，,28.8g,甘氨酸和,1g SDS,加水溶解后，定容至,000ml,（配好的溶液,pH8.3,）,(12,个组可配,2,升,使用时再稀释,2,倍,),。,(8),样品溶解液：,取,SDS,g,，,-,巯基乙醇,ml,，甘油,10ml,，溴酚蓝,0.1g,，,0.5mol/L pH6.8 TrisHCl,缓冲液,(,浓缩胶缓冲液,)10ml,，加蒸馏水,25ml,，,(,最后的总体积为,50 ml),装于棕色瓶。,(9),染色液（,0.1%,考马斯亮蓝,-45%,甲醇,-10%,冰乙酸溶液）：,1g,考马斯亮蓝,R250,，加入,450 ml,甲醇、,100ml,冰乙酸，用水定容至,1000 ml,。,(12,个组可配,2000 ml),(10),脱色液,高甲醇,1000ml,：甲醇,454ml,，冰醋酸,75ml,，,dH,2,O 471 ml,低甲醇,1000ml,：甲醇,50ml,，冰醋酸,75ml,，,dH,2,O 875 ml,七实验步骤,1.,清洗并吹干玻璃板。,2.,在塑料胶条的两面涂少量凡士林（注意不能涂多，以防弄脏玻璃板）。,3.,把玻璃板放入电泳槽中。,4.,用小烧杯加,6ml,蒸馏水，,2ml 30%,凝胶储液，,20 ul TEMED,，,100ul 10,过硫酸铵，混匀，迅速倒入封口槽处,(,一定要快！,),，静置约,10min,直到凝固。,聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套,5.,加,dH,2,O,于两层玻璃之间，检查玻璃底是否漏水；如果漏水，要重装。,6.,按下表用小烧杯配,12%,分离胶，混匀，灌胶，高度离梳子约,1,1.5cm,，然后覆盖一层水，凝胶时间为,15,30min,，胶与水分层，倾倒去水。,12%,分离胶,5%,浓缩胶,30%,凝胶贮液,4000l,810 l,上层胶缓冲液,pH6.8,1250 l,下层胶缓冲液,pH8.8,2500l,TEMED,（四甲基乙二胺,),30 l,20 l,10%SDS,100l,50l,dH,2,O,3270l,2820l,AP,（过硫酸氨）,100l,50 l,7.,凝好胶，垂直拔掉梳子（不要左右摇梳子）。,8.,上槽加入电泳缓冲液（电极缓冲液稀释,2,倍），液面需没过低玻璃板；下槽电泳缓冲液没过玻璃板封胶处,1cm,。,9.,用,1.5ml ep,管取,100l,粗酶样品与,100l,样品溶解液混合均匀，与蛋白质分子量标准一起置于,沸水浴,5min,）。,10.,微量注射器按下表,2,点样，隔孔点样，注意不要交叉污染（每点一个样都要清洗微量注射器）,。,表,2,点样方式,孔,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,加样,粗酶,标准蛋白,过柱,1,过柱,2,过柱,3,体积,L,30,40,30,35,35,35,*,微量注射器不可过低,以防刺破胶体；也不可过高,样品下沉时易发生扩散，溢出加样孔,11,.,上槽接负极，下槽接正极。,12,.,恒电流电泳：浓缩胶，,1012 mA,，待溴酚蓝迁移到浓缩胶与分离胶的界面调整电流至,20mA,。,13,.,待溴酚蓝迁移到距分离胶底部,0.51cm,处，结束电泳。,14.,染色（,20,30min,），回收染色液。,15.,脱色：高甲醇,6080ml,，,25min,；高甲醇,4060ml 20min,；低甲醇,80100ml,完全脱净,剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分,16.,拍照并画电泳图谱，计算标准蛋白、待测样品的相对迁移率（蛋白相对迁移率蛋白迁移距离,/,指示剂迁移距离）。,17.,用低分子量标准蛋白质所作的标准曲线，求待测样品亚基的相对分子量。,18.,以标准蛋白质电泳的相对迁移率为横坐标,(X),，标准蛋白质分子量的对数为纵坐标,(Y),，绘标准蛋白质的标准曲线，再根据样品相对迁移率在曲线上求出其蛋白质的分子量。,蛋白名称,迁移距离,相对迁移率,（,Y,）,蛋白分子量,(,D,),蛋白分子量对数,(,X,),兔磷酸化酶,B,牛血清白蛋白,牛碳酸酐酶,牛蛋白酶抑制剂,鸡蛋清溶菌酶,过柱的菠萝蛋白酶,指示剂,-,-,-,低分子量标准蛋白质的组分：,1),兔磷酸化酶,B,分子量,97,400,2),牛血清白蛋白 分子量,66,200,3),兔肌动蛋白 分子量,43,000,4),牛碳酸酐酶 分子量,31,000,5),牛蛋白酶抑制剂 分子量,20,100,6),鸡蛋清溶菌酶 分子量,14,400,八实验注意事项,1.,缓冲液的,pH,值、浓度要准确配置；,2.,AP,新鲜配置。,3.,SDS,在低温下析出，使用前水浴加热使之溶解。,九实验结果分析,1.,各实验组分析讨论实验结果，再由老师进行归纳总结。,2.,做好电泳图谱的绘制及数据记录。,3.,学生对该实验有哪些体会。,4.,思考题：,（,1,）电泳时，上下电泳槽产生的气体是什么？用过一次的电极缓冲液是否可以混合后再用？为什么？,（,2,）样品上样前为什么要沸水浴加热,3,5,分钟？,（,3,）,SDS-PAGE,是否需在低温下进行？为什么？,（,4,）做好本实验关键是什么？,（,5,）如果电泳图谱模糊，有些电泳带不出现或拖尾，试分析原因。,
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