超分辨率显微技术课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,超分辨率显微技术,Super-resolution Microscopy,超分辨率显微技术Super-resolution Micr,超分辨率显微技术,SSIM,2,STED,3,GSD,4,STORM,5,总结,6,NSOM,1,超分辨率显微技术SSIM2STED3GSD4STORM5总结,近场扫描光学显微镜,Near-field Scanning Optical Microscope(NSOM),远场：从近场区域起至无穷远处,近场：距离物理表面仅几个波长的区域,辐射场：可向外传输的场成分,非辐射场：被限制在样品表面并且随离开表面的距离增加而迅速衰减，不能在自由空间存在,探测束缚在物体表面的非辐射场,丰富的亚微米光学信息,近场扫描光学显微镜 Near-field Scannin,利用,孔径小于,50 nm,的光纤探针，并且精确地在样品表面几十纳米以内稳定、可靠地进行光学信息的扫描成像，即扫描近场光学显微镜，其光学分辨率达到波长的几十分之一。,物镜：孔径小于波长的小孔装置，如光纤探针,探针与样品间距的测控,光源和照明光路、收集光路和光探测器,关键组件,利用孔径小于50 nm的光纤探针，并且精确地在样品表面几十纳,成像原理,成像原理,优点,超越光学衍射极限的分辨率，甚至可达到亚纳米量级；,光学显微技术，无侵入性，可在生物的自然状态环境下进行观测研究；,能够观测吸收、反射、荧光、偏振对比度，透视生物样品内部光学性质；,光谱学分析，对化学状态具有高分辨率；,局域,(,纳米级,),光与样品的相互作用；,单分子水平观测灵敏度，,1 photon/sec,；,纳米空间分辨率，高时间分辨率,(,飞秒,),；,能在室温条件下工作,缺点,贵,NSOM,优缺点,优点NSOM优缺点,应用,生物学：有静态的形貌像的观察研究，如细胞的有丝分裂，染色体的分辨与局域荧光，原位,DNA,，,RNA,的测序，基因识别等，还有利用观察形貌像随时间变化的动力学过程的研究。,微电子：信息的高密度存储,应用生物学：有静态的形貌像的观察研究，如细胞的有丝分裂，染色,工作原理：非线性结构性光学照明部件引入到传统的显微镜，多重相互衍射的光束照射到样本上，然后从收集到的发射光模式中提取高分辨率的,信息。,饱和结构光照明显微技术,Saturated structure illumination microscopy,(SSIM),工作原理：非线性结构性光学照明部件引入到传统的显微镜，,优点：,1,、光源只需使用一个廉价的激光。,2,、可以突破分辨率的界限，很大程度上提高分辨率，理论上可以实现无穷大的分辨率。二位点分辨率实现,50nm,。,缺点：,1,、跟通常的光照强度相比，饱和状态会使得荧光分子的漂白率加快，同传统的单一图像相比，饱和结构光显微镜所观察到的光子数需要很高的信噪比。,2,、饱和结构光显微镜实现高分辨率是在样品静止不动的假设上进行的，对于有着高速度的胞内生命活动，成像会被限制成滞缓的结构。,3,、对于活标本的观察，饱和结构光显微技术会大大增加光毒性。,SSIM,优缺点,优点：1、光源只需使用一个廉价的激光。SSIM优缺点,受激发射损耗显微术,Stimulated,emi,s,sion depletion microscopy(STED),在STED中，有效荧光发光面积的减小是通过受激发射效应来实现的。一个典型的STED显微系统中需要两束照明光，其中一束为激发光，另外一束为损耗光。,受激发射损耗显微术 Stimulated 在STED中,装置图,装置图,优点：,1.,STED远场显微术，不仅具有共聚焦非接触三维成像的功能，而且成功突破了衍射极限的限制，使分辨率提高到了几十纳米。,2.,与近场扫描光学显微镜相比，不仅突破了衍射极限，而且使观察不仅局限在样品表面，而可以看到样品内部。,缺点：,1.,需要强光，能量利用率低；,2.,过强光会引起光致漂白；,3.,应用范围略窄；,4.,与其他的超分辨显微镜相比，成本较高，操作,PLAM/STORM,复杂。,STED,优缺点,优点：STED优缺点,基态损耗超高分辨率显微镜,Ground state Depletion(GSD),分子从基态,S,0,激发到第一激发态之后，有两种途径返回到基态；一种是通过进程（,2,）回到基态，还有一种就是经过一个次激发态回到基态，比如三重态。后者分子将会自由辐射回基态。,基态损耗原则表明，在给定的时间内将一部分分子保持在活跃状态，有利于单独记录单个分子的位置状态。,GSDIM,原理：,基态损耗超高分辨率显微镜Ground state Depl,基态损耗显微镜是通过荧光随机读出分子的位置，通过这种方法对图像上的每个位置进行识别标示，本质上，这种方法要依靠算法来确定每个分子的位置。,GSD,装置图,基态损耗显微镜是通过荧光随机读出分子的位置，通过这种方法对图,（参照,三维定位显微镜的超分辨率系统,Leica SR GSD 3D,）,1,、最大横向分辨率降至,20nm,2,、在线超分辨率图像投影,-,看到真实原样的结果,3,、在多功能活细胞成像系统上将超分辨率与,TIRF,和落射荧光相结合，提供了全面的应用灵活性,GSD,优缺点,（参照三维定位显微镜的超分辨率系统 Leica SR GSD,随机光学重建显微镜,(STORM)Stochastic Optical Reconstruction,Microscopy(STORM),两个关键技术：单分子定位和光控开关荧光分子,技术路线：,STORM,采用光转换荧光探针，在时间上分离相互重叠发光的荧光分子，重构得到高分辨率图像。,1.,单分子定位：对于荧光分子定位分析只要有足够的光子数,(N),被接收，分析荧光激发光子光强分布的中心可以实现高精度的粒子定位。,2.,荧光分子：荧光分子对Cy3和Cy5，在不同波长激光激发下，在荧光态和非荧光态间转换,随机光学重建显微镜(STORM)Stochastic O,成像过程,Initial configuration,1.Photoactive molecule,MicroscopyU Nikon,2.Image active molecule,3.Localize molecule,4.Photobleach,record position,Final STORM image,成像过程Initial configuration1.Pho,优缺点,优点：,超越光学衍射极限的分辨率,：与传统光学显微镜相比，空间分辨率可提高,10,倍，横向可达,20nm,；,缺点,:,成像速度慢，难以活细胞成像；荧光分子浓度要求；成像装置复杂昂贵；,STORM,优缺点,优缺点优点：STORM优缺点,应用与发展,应用：,细胞形态及亚细胞结构,蛋白相互作用,发展：,3D-STORM:Z,轴分辨率的提升,多色,STORM:,实现多色荧光成像分析,应用与发展应用：发展：,总结,总结,挑战,挑战：,xyz,方向分辨率提高；,活细胞内实时观测；,3D,分层扫描；,结果处理软件标准化；,荧光染料选择；,生物样品准备等。,挑战挑战：,QUESTION,QUESTION,补充材料,补充材料,工作原理：,经典分辨率限制条件确定了普通显微镜所能观察到的最大空间频率为,k,0,，,k,0,=2,NA,/,em.,如果将样品的频率扩展到,2,维空间，那这一限制可以定义成一个“观察区域”，是一个以,k,0,为半径的圆周，区域外的信息则无法被观察到。,对于饱和结构光照明显微镜则是通过将区域外的信息以莫尔条纹的形式移动到观察区域当中，莫尔条纹是由两个信号复合在一起的混合频率产生的,饱和结构光照明显微技术,补充材料,工作原理：经典分辨率限制条件确定了普通显微镜所能观察到的最大,如果激发光包含一个空间频率为,k,1,，每个频率为,k,的样品会产生一个频率为,k-k,1,的莫尔条纹，如果,|k-k,1,|k,0,那么这一条纹便可以由显微镜观察到。那么现在可以检测到的最大空间频率变为,k,0,+k,1,。,但是，由于产生空间频率集合的光场以及可观察到的频率的集合受到衍射的限制，因此，,k,0,不能大于,2NA/,exc,k,0,。所以，常见的线性结构光显微镜能够扩展分辨率的达到的因子约等于,2,。,如果激发光包含一个空间频率为k1，每个频率为k的样品,为了突破这一限制，可以通过使发射率取决于光照强度的非线性变化，这种非线性会产生有效的光照模式，该光照包含空间频率为,k,1,的的倍数的谐波。如果包含的谐波的频率为,2k,1,，,那么可以将分辨率扩展为线性方法的两倍，若频率为,3k,1,，则分辨率将扩展为原线性方法的三倍，如果这一非线性特征为,s,阶多项式，则会产生,s-1,个新的谐波。所以理论上可以达到无穷大的分辨率。但是由于受到信噪比和耐光性的影响，实际的分辨率是有限的。,为了突破这一限制，可以通过使发射率取决于光照强度的非线性变化,