第四章：抗生素效价 的微生物检定法

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第四章：抗生素效价的微生物检定法教学目标：,.,解释抗生素概念、叙述医疗用抗生素特点、了解抗生素的主要作用机制,.,叙述抗生素的效价和单位及其表示方法,.,熟知抗生素效价检定操作与基本要求,.,述说测定原理,教学重点：,抗生素概念、医疗用抗生素特点、抗生素的效价和单位及其表示方法,抗生素效价检定操作方法与基本要求,教学难点：,抗生素效价检定操作方法,二剂量法效价计算公式,抗生素的主要作用机制,讲授新课：第一节 概述,一、抗生素的概念,:,抗生素主要是由微生物所产生的极微量便具有选择性地杀死或抑制它种生物或肿瘤、细胞生长的一类天然有机化合物。,二、医药用抗生素的特点具备以下,4,个特点才能应用到临床。,(1),有较大的差异毒力,是由抗生素的作用机制决定的,如青霉素类抗生素能抑制细菌细胞壁的合成，而对人与哺乳动物没有影响,因而该类抗生素具有明显的差异毒力。,(2),抗菌活性强,抗菌活性的强弱常用最低抑菌浓度,(MIC),来衡量，,MIC,值越小，表示活性越强。,(3),抗菌谱广,即指各种抗生素所能抑制或杀灭微生物的范围，范围广谱者称为广谱抗生素，即对多种病原菌都有抑制和杀灭作用；范围窄的为窄谱抗生素，如青霉素主要抑制革兰阳性菌，多粘菌素只能抑制革兰阴性菌，而具有抗肿癌作用的抗生素则称为抗肿瘤抗生素。,(4),不产生副作用和不良反应,良好的抗生素应对机体无毒性，不引起变态反应，不易使病原菌产生耐药性。,三、抗生素效价微生物测定技术,（一）概述,效价测定技术方法,物理、化学法,微生物法,简便、快速，本身纯度不高，采用该法会引起偏差，因此只有在纯度较高情况下可采用,原理和临床应用的要求相一致，直接反映出抗生素的疗效，且灵敏度较高，需用量较小，因此被广泛使用。,微生物法,依据抗生素最小抑菌浓度而设计的稀释法；根据不同浓度的抗生素对微生物生长速度的不同影响程度而设计的比浊法,中国药典,称之为浊度法并收载,；有依据抗生素渗透到含敏感菌的琼脂培养基中产生抑菌圈而设计的管碟法,(,又称扩散法，杯碟法或垂直扩散法,),；,根据对微生物呼吸抑制程度而设计的呼吸度量法；根据对微生物代谢产物的影响而设计的快速法，对微生物体内酶系统产生影响的脱氢法。,浊度法系利用抗生素在液体培养基中对试验菌生长的抑制作用，通过测定培养后细菌浊度值的大小，比较标准品与供试品对试验菌生长抑制的程度，以测定供试品效价的种方法。,管碟法：是利用抗生素在含敏感试验菌的琼脂培养基中的球面扩散渗透作用，从而形成一定的抑菌圈。通过琼脂培养基，可观察并测量出抑菌圈的大小。在一定的抗生素浓度范围内，对数剂量,(,浓度,),与抑菌圈的表面积或直径成正比,（二）抑菌圈的形成,将不锈钢小管,(,俗称为牛津杯,),放置在含敏感试验菌的琼脂培养基上，将抗生素溶液注入小钢管中，抗生素分子随溶剂向培养基内呈球面状放射状扩散。同时将培养基置入适宜试验菌生长的培养箱中，琼脂培养基中的试验菌开始生长。抗生素分子在琼脂培养基中的浓度，随离开小钢管的距离增大而降低，离小钢管愈远，琼脂培养基中抗生素分子愈少，相应的抗生素浓度愈低。当抗生,素分子扩散到一定时间，在,小钢管周围形成一个能有效,的抑制试验菌生长的范围，,也就是通常所说的抑菌圈。,抗生素溶液的浓度不同，抑,菌圈的大小亦不同,(,图,4,1),。,按设计原理不同分,管碟法,一剂量法（标准曲线法）,二剂量法（,22,法）,三剂量法（,33,法）,日常使用多采用二剂量法，对于有争议结果，必须使用三剂量法测定的结果仲裁。另外再介绍浊度法；考虑到一剂量法（标准曲线法）在研制新药的使用和美国药典、日抗基均有收载，本教材以选讲形式进行介绍。,第二节,抗生素的效价和单位,一、抗生素的效价和单位,抗生素的含量用效价和单位表示。该词有时不加区别统称为效价单位。,效价（,otency,）,指检品的实际单位数与其标示量的比值。常表示为效价的百分数。效价是从比较检品与标准品的生物活性而得。在不同的微生物效价测定中，效价计算的公式见后述。,单位,（,unit,u,）,单位是衡量抗生素有效成分的具体尺度。各种抗生素的单位含义不同，在习惯上根据它们的实际发展情况而定，抗生素效价单位的具体表示方法见后述。,标准品与国际单位,(international,unit,iu,),抗生素微生物测定用的标准品，除国内的新品种外，凡已制备国际标准品的品种，在制备国家标准品时，均与国际标准品比较而定出效价。,二、抗生素的效价单位的表示方法,、质量单位,以抗生素的生物活性部分质量作单位，微克（）单位，毫克单位。,、类似质量单位,以特定的纯粹抗生素盐类的质量作为单位。如纯粹金霉素盐酸盐及四环素盐酸盐（包括无生物活性的盐酸根在内）微克（）单位，毫克个单位。这是根据国际使用习惯而来的。,、质量折算单位,以特定的纯抗生素盐的质量为单位而加以折算。,、特定单位,以特定的抗生素样品的某一质量定为一单位。,第三节,管碟法测定操作,1.,试验用菌液,(,见表,4-4),、,缓冲液,、,培养基的制备,按药典规定进行制备。,2.,标准品与供试品溶液的制备,按药典规定制备标准品与供试品高低不同浓度溶液。,(,见表,4-3,和,4-11),。,3.,双碟的制备,制备底层及含一定量试验菌的菌层，并安置小钢管。,4.,滴加药液到小钢管内,将标准品、供试品溶液滴入相应的小钢管中。,5.,培养,在恒温培养箱中培养至规定时间。,6.,测量抑菌圈,可用手工测量或仪器测量。,7.,计算结果,先进行可靠性测验,符合规定,再进行效价计算,标准品的称量,标准品的稀释标准品溶液,供试品的称量,供试品的稀释供试品溶液,缓冲液的制备,培养基的制备,底层,20 ml,菌层,5ml,平板的制备,凝固后,凝固后,菌液的制备,加菌液,加小钢管,-,可靠性测验，计算结果,测量抑菌圈培,养,抗生素效价检定管,碟法,操作流程,第三节,管碟法测定操作,加陶瓦园盖,二、影响因素的控制,1,直线斜率的控制斜率小，即抗生素浓度差异小，而抑菌圈的直径差异大，灵敏度的准确性高。,2,直线截距的控制直线截距决定于,C,、,D,、,T,、,H,诸因素，其中,D,、,T,值一般相当稳定，所以,C,、,H,是决定截距的主要因素。如将培养基厚度,H,减小，截距也随之减小，抑菌圈增大。据此可设计薄层培养基，可大大提高检验的灵敏度,3,抑菌圈大小的控制抑菌圈的大小受,L,、,H,、,C,、,D,、,T,及,A,等诸因素的影响。抗生素总量,M,CV,CAL,，（,A,为管底面积、,L,为高度、,V,为管内体积、,C,为抗生素浓度）,可见抗生素浓度是影响抑菌圈大小的，若,C,不变，则,r,随,V,而变化，那么,L,或,A,均影响抑菌圈大小。因此抗生素浓度应准确，包括称量、稀释均应准确，稀释用的仪器、容器均应标准。,4,培养基的厚度,H,、,试验菌敏感度,C,、,扩散系数,D,的影响,H,增大，,r,缩小；,H,减小，,r,增大,。,C,常受加菌量及对抗生素耐药性等因素的影响而有所改变，从而影响,r,大小。,T,受细菌生长快慢的影响而引起,r,改变。,D,扩散快慢亦可使,r,改变，因此应注意选用敏感性的试验菌并保持其不变异，特别要防止染菌，制备菌层时含菌浓度要适宜，可采用预试验来确定；向小钢管内滴加标准溶液和供试溶液时要交叉进行，以免偏向。,5.,剂量反应直线范围控制 直线范围在下列情况下会缩短：管径小、装量小；浓度低；因培养基或试验菌吸附或破坏抗生素等因素使小钢管中抗生素量下降，导致直线范围缩短，常使呈弧形。为此可用调整缓冲液的,pH,值，使抗生素稳定；调整培养基,pH,值；调整培养基的处方及除去杂质；选用更为敏感的试验菌加以控制。,6.,抑菌圈圆整及清晰度的控制抑菌圈常有破裂不圆，甚至无圈现象。这些情况的产生主要是由于向小钢管加抗生素溶液时有溅出或漏出；有时也可能因双碟或小钢管残留或污染有抗生素而造成的。如果污染杂菌或因菌层培养基温度过高，试验菌被烫死，均会使抑菌圈不圆整或破裂。,(2),抗生素的培养基内抗散系数不一所引起抗生素的培养基内抗散系数不一，如混有几种类型的抗生素、抗生素受缓冲液或受培养基内的杂质影响，或使其形成某种化合物，致使抗生素浓度总量发生变化。因此对培养基的原材料如胨、牛肉膏、酵母膏及琼脂等的选用极为重要。这些都可影响仰菌圈的大小和清晰度。,在某些情况下出现抑菌圈边缘模糊、类似锯齿状或双圈等现象，主要由下列因素所引起：,(1),试验菌培养物不纯所引起当试验菌培养物不纯，几种菌株，如菌种中杂有耐药性菌，使,C,含有,C,，、,C,，、,C,，,等差异含有一同敏感度的，致使扩散系数紊乱。其次菌种中有不同生产时间的菌体，以致有不同的值，这些都能使抑菌圈边缘不清晰。,(3),小钢管内的抗生素浓度不断下降所引起当试验菌能吸附或破坏抗生素时，这种情况就更加严重，此时可出现双圈现象。,(4),不适当地延长培养时间所引起由于某些抗生素的抑菌圈边缘的菌群只是被抑制，当延长培养时限后，菌量增加，使抗生素敏感度降低。抑菌圈边缘菌群继续繁殖，导致抑菌圈变小或边缘模糊不清不整齐，如测定制霉菌素时，培养时间长，其抑菌圈边缘就不清晰或不整齐。要控制培养时限，使抗生素培养基的浓度，恰当抑制实验菌，而在抑菌圈边缘的浓度能刺激试验菌生长，就能形成清晰的抑菌圈。,此外，对抗生素标准品和供试品同质的要求至为重要。,因为效价测定设计是假定二者剂量反应直线是相互平行除操作影响外，无论是标准品中或供试品中若有其他抗菌性物质或影响抗菌活性的物质（加强或拮抗），均可使二者剂量反应直线不平行，对此必须注意。如供试品四环素制剂中含有维生素,C,时，在标准品中也应加入相应的维生素,C,，,以保持标准品供试品的同质性，这样检验结果才是可行的，也才能准确。,三、操作技术要求,（,1,）防止抗生素污染,由于管碟法是微量的微生物分析法，故称量稀释除应满足用容量分析及仪器分析进行定量分析的一般要求外，还应注意效价测定试验室内防止抗生素污染。效价测定滴加钢管的操作室内，地面，水平操作台，钢管放置器，钢管，墙壁以及各项玻璃用具，工作服，工作人员双手等，都要避免被抗生素污染。即使有微量抗生素的污染，往往使试验结果混乱。微量的抗生素还可以附着在尘埃上，随着空气流动散落在双碟培养基平板，钢管，钢管放置器上，有时可能是使抑菌圈破裂的原因。因此，要避免将抗生素溶液滴在地上或工作台上，如被污染时应及时清洁。在配制培养基或缓冲液时，亦应严防被抗生素污染。,（,2,）操作次数序安排上的误差在一剂量法制备标准曲线时，双碟数量较多，滴加抗生素溶液至钢管的时间，各个双碟的时间基本一致。如滴加,8,组稀释度双碟，可从中心浓度组开始向高，低二端交叉滴加。如稀释度为,C,1,，,C,2,，,C,3,，,C,4,，,C,5,，,C,6,，,C,7,及,C,8,，,滴加次序可,C,4,，,C,5,，,C,3,，,C,6,，,C,2,，,C,7,，,C,1,及,C,8,。,这样,，可减少各组间抗生素扩散时间及试验菌生长时间的差异。尤以枯草杆菌在室温较高时，这种影响更为明显。此外，标准品与供试品的称量，应在相近的时间内称取，稀释后的溶液尽量在相同的条件下放置，并使放置的时间也相同，以减少误差。,滴加双碟小钢管的次序所致的误差，受操作者的熟练程度的影响，而且在方法设计上也是无法抵消的。因此，要求滴加迅速，如一组三个双碟,18,个小钢管的滴加时间，控制在,1min,以内较好。在操作很多检品时，以分批操作为好，切勿同时放置几排双碟先滴好标准品溶液后滴加各批供试品溶液，这样使标准品与供试品溶液的扩散时间和细菌生长时间人为带来差异，引起误差。,（,3,）测量抑菌圈应避免误差测量抑菌圈是本法取得试验结果的重要环节，目前多已采用抑菌圈面积测量仪测量以克服使用游标卡尺容易产生的主观误差。现国产抑菌圈面积测量仪主要,有,ZY-300,IV,型智能抑菌圈测量仪（由北京先驱威锋技术开发公司生产经销，图