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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,5.2.6,基因组文库的构建,基因文库(gene library),基因组文库(genomic library),cDNA文库,(cDNA library),1.起因：绝大多数基因难以直接分离得到,高等真核生物，基因组DNA十分庞大,基因可达数万个,基因组成结构复杂,编码序列,非编码序列,调控序列,间隔序列,重复序列,单个目的基因在整个基因组中所占比例极小,未知基因更难克隆,要分离的目的基因往往是未知基因,无法对它进行特异性扩增，,只能对所有的基因进行扩增，,构建基因文库,然后再根据不同的方法将所需的克隆筛选出来,最后分离得到目的基因。,2.克隆未知基因常用建库的方法,目的基因：,已知基因：,未知基因：构建基因文库,特定探针的制备,文库的筛选（筛库）,含目的基因的克隆,基因文库包括,基因组DNA文库,和,cDNA文库,cDNA,文库,(cDNA library),：以,mRNA,为模板，利用反转录酶合成与,mRNA,互补的,DNA,，,再复制成双链,cDNA,片段，与适当载体连接后转入受体菌，这些受体菌包含了所有,cDNA,信息，总称,cDNA,文库,。,常用于筛选编码蛋白质的结构基因。,基因组,DNA,文库,(genomic DNA library),：,利用限制性核酸内切酶将组织或细胞染色体,DNA,切割后，与适当载体连接后转入受体菌，这些受体菌包含了所有基因组,DNA,信息，总称基因组,DNA,文库,从特定组织提取的染色体基因组DNA，其目的是分离有用的目的基因和保存某种生物的全部基因，研究基因组成,从特定组织mRNA反转录成的cDNA拷贝，其目的是分离某一特定器官在特定发育时期细胞内的mRNA，研究基因表达,5.构建基因组文库常用人工染色体,载体,BAC,是以细菌大肠杆菌F因子(fetility factor)为基础构建的环形质粒，容量为300kb，,PAC,则以P1噬菌体(P1 phage)和F因子为基础构建的环形质粒，容量为130-150kb。它们不是严格意义上的人工染色体，因为它们不含着丝粒和端粒。,YAC,是酵母人工染色体，它含有着丝粒，复制原点和端粒，能稳定遗传，其容量在100-2000kb。在染色体区带构建YAC重叠群，促进了大规模基因组测序和致病基因的克隆。,MAC,哺乳动物染色体基本功能单位。如果研究成功，可能成为很好的基因治疗载体和转基因动物载体。,HAEC,是基于人类EB病毒而构建的环形DNA，含有EB病毒的复制原点(oriP)和潮霉素抗性基因。能以环形小染色体形式复制，并在有丝分裂中保持稳定。HAEC可能会成为基因治疗的重要载体。,6.基因组DNA文库的质量标准,一个理想的基因组DNA文库应具备下列条件：,重组克隆的,总数,不宜过大，以减轻筛选工作的压力,载体的装载量最好大于基因的,长度,，避免基因被分隔克隆,克隆与克隆之间必须存在足够长度的,重叠,区域，以利克隆排序,克隆片段易于从载体分子上完整,卸载,重组克隆能稳定保存、扩增、筛选等,后续操作,8.基因组DNA文库,构建的程序,载体,DNA的制备；,高纯度大相对分子质量基因组DNA的提取和,大片段,的制备；,高纯度大相对分子质量基因组DNA的部分酶切与,脉冲电泳,分级分离；,载体与外源片段的,连接与转化,或侵染宿主细胞；,重组克隆的挑选和保存。,4.DNA文库,构建的程序,载体,质粒,噬菌体,病毒,目的DNA（外源基因）,基因组DNA,cDNA,人工合成,PCR产物,限制酶消化,开环载体DNA,目的DNA,连接酶,重组体,转化,体外包装，转染,带重组体的宿主,筛选,表型筛选,酶切电泳鉴定,菌落原位杂交,转化子,1、利用质粒载体,构建小文库,该法简单、快速、易于操作，但仅适合一些,低等真核生物,和,原核生物,。,流程图,BamHI,MboI,OH,P,OH,HO,脱磷酸化,重组DNA,T4 连接酶,转化E coli,基因组文库,总DNA,HindIII,BamHI,SalI,EcoRI,PstI,ScaI,Tc,Amp,R,pBR322,(4.36 kb),Ori,HindIII,EcoRI,PstI,ScaI,R,Amp,R,Ori,SalI,利用YAC载体构建基因组文库,1.两臂DNA片段的制备:,pYAC4-,Bam,HI/,Eco,RI-脱磷酸化,2.供体DNA片段的制备:,琼脂糖凝胶-DNA样品的制备-,Eco,RI部分酶切-脉冲场凝胶电泳-片段回收和纯化,3.DNA的连接,4.重组DAN分子的转化:,原生质体转化法,5.转化子的保存:,单菌落保存于96孔平板,流程图,6.基因组DNA文库的保存,1、滤膜影印保存法-,已经不常用,盖章法,定位孔,细菌菌落,Whatman,3MM滤纸,带有细菌菌落的,硝酸纤维素滤膜,影印硝酸纤维素滤膜,无菌绒丝,略讲,3 保存单个克隆子于含有甘油的培养基中,方法：从平板上,挑选单个克隆,子接种于合适的含抗生素的培养基中，菌体生长到一定浓度后，加入终浓度为25%的甘油，于-70,o,C或-25,o,C下保存。,缺点：需保存的克隆子数过多，工作量大,略讲,表型筛选法：表达性状易于鉴别，如,互补,筛选,抗性筛选法：如二氢叶酸还原酶可以使三甲苄 二氨嘧啶降解，而该化学物可抑制大肠杆菌生长,分子杂交法：利用分子探针对文库进行筛选,免疫筛选法：利用多肽等作为抗原进行原位杂交筛选,PCR筛选法：根据保守序列合成引物，扩增特异性片段,7.基因组DNA文库的筛选 p189,略讲,
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