EGFR荧光原位杂交与免疫组化检测比较分析课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,EGFR,荧光原位杂交与免疫组化检测的比较分析,广州医科大学附属第一医院 病理科,林毅妍,EGFR荧光原位杂交与免疫组化检测的比较分析广州医科大学附属,前言,近年来，以表皮生长因子受体（,epidermal growth factor receptor,，,EGFR,）为治疗靶标的分子靶向治疗在非小细胞肺癌（,non-small cell lung cancer,，,NSCLC,）治疗中越显突出。,EGFR,基因的检测不仅可以为分子靶向药物的使用提供有效指导，也可以为肺癌治疗措施的制定以及肺癌预后的判定提供重要信息。目前临床病理工作中，对,EGFR,基因扩增的检测使用较多的方法有荧光免疫原位杂交（,FISH,）技术、免疫组化（,IHC,）检测技术、,PCR,扩增检测技术等。本文将对荧光原位杂交与免疫组化两种检测进行比较分析。,前言 近年来，以表皮生长因子受体（epidermal,材料,标本来源：广州医科大学第一附属医院,2010,年,1,月,2011,年,1,月行支纤镜及手术切除的,NSCLC,病例，其中男性,21,例，女性,19,例；年龄,30,85,岁，中位年龄,58,岁。所有标本均经,10%,中性缓冲福尔马林液固定，常规石蜡包埋。,40,例标本行连续切片，同时行,FISH,检测与免疫组化检测。,材料,主要试剂与仪器,蛋白酶,K,，探针：,GLP EGFR/CSP7,探针（北京金菩嘉公司），胃蛋白酶消化液，人抗,EGFR,单克隆抗体（即用型）购于福州迈新生物公司。,Dako,杂交仪、观察用,Olympus BX51,型显微镜和,Nikon H600L,荧光显微镜。,主要试剂与仪器,检测方法,（,1,）,FISH,检测：,3m,组织切片,TO,脱蜡至水,煮沸去离子水处理,15min,室温下,2SSC,中漂洗,2,次，每次,5min,在组织上滴加蛋白酶,K,工作液，在,37,预热的孵育盒中消化,3,5min,室温下用,2SSC,溶液中洗涤,2,次，每次,5min,，乙醇梯度脱水，自然干燥,避光环境中，探针混合液滴于玻片杂交区域,在温度,80,的自动杂交仪中变性,5 min,，,42,杂交,16,小时,第二天,46,水浴箱中,2SSC10min,，,0.1%NP40,溶液洗涤,5min,，室温,70%,乙醇,3min,暗处自然干燥玻片后加,DAPI,复染液，放于暗盒中复染,5min,Olympus BX51,型荧光显微镜在,DAPI/FIFC/RHOD,三色滤光镜激发下观察间期细胞荧光杂交信号,检测方法（1）FISH检测：3m组织切片TO脱蜡至水煮,检测方法,（,2,）,IHC,检测：,3m,组织涂胶片，,57,烤片过夜，浸于二甲苯中脱蜡至水,在组织上滴加胃蛋白酶消化液，在,37,预热的孵育盒中消化,30min,采用,EnVision,二步法，严格按照说明书操作,检测方法（2）IHC检测：3m组织涂胶片，57烤片过夜,结果判断,（,1,）,FISH,结果判定：红色信号代表检测的靶基因，绿色信号代表靶基因所在的染色体着丝粒。检测,EGFR,基因计数,100,个细胞，统计,Ratio,值（,100,个细胞核中红色信号数,/100,个细胞核中绿色信号数）。,FISH,阳性分为：,EGFR,基因扩增：,Ratio2,为阳性结果；,15,个红色信号的细胞数占细胞总数的,10%,以上；,出现成团红色信号的细胞；高多体性：,Ratio,2,，但,4,个红色信号的细胞数占细胞总数的,40%,以上。,FISH,阴性：,Ratio,2,为无扩增。,结果判断（1）FISH结果判定：红色信号代表检测的靶基因，,结果判断,（,2,）,IHC,结果判定：染色结果根据细胞膜着色的阳性细胞百分率和阳性染色程度评价。,着色细胞占计数细胞百分率,5%,为,0,分；,6,25%,阳性细胞为,1,分；,26,50%,阳性细胞为,2,分；,50%,阳性细胞为,3,分。,再结合染色强度，无色为,0,分，浅黄色,1,分，棕黄色,2,分，棕褐色,3,分。将每张切片着色细胞百分率得分与着色程度得分相乘，为其最后得分。,同一视野如有染色强度不一，取其平均值作最后得分。,0,1,分为阴性（），,2,3,分为弱阳性（,1+,），,4,6,分为中等阳性（,2+,），,6,分以上为强阳性（,3+,）。,结果判断（2）IHC结果判定：染色结果根据细胞膜着色的阳性细,统计学处理,采用,SPSS 17.0,统计软件进行描述性分析。,FISH,技术与,IHC,法检测结果的比较使用,x,2,检验。,统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件进行描述性分析。,结果,FISH,图,1.EGFR FISH,（,+,）,（高多体）,图,2.EGFR FISH,（,+,）（,点簇状,）,图,3.EGFR FISH,（,-,）,结果 FISH图1.EGFR FISH（+）图2.EGFR,结果,IHC,+,+,+,-,结果 IHC+-,结果,FISH,技术与,IHC,法检测,EGFR,的结果比较见表,1,。,FISH,IHC,合计,（,-,）,（,1+,）,（,2+,）,（,3+,）,（,+,）,6,5,2,2,15,（,-,）,19,5,1,0,25,合计,20,10,3,2,40,表,1 FISH,技术与,IHC,法检测,EGFR,的结果比较,40,例,NSCLC,标本中，,FISH,显示为阳性的,15,例，其中,IHC,检测,EGFR,表达为（,）的,6,例（,40%,），阳性的,9,例（,60%,）；,FISH,显示为阴性的,25,例，其中,IHC,检测,EGFR,表达为（,）的,19,例（,76%,），阳性的,6,例（,24%,）。,IHC,检测阳性例数高于,FISH,检测阳性例数，差异无统计学意义（,x2=5.184,，,P,0.05,）。,结果 FISH技术与IHC法检测EGFR的结果比较见表1。F,讨论,表皮生长因子受体,(EGFR),是一种蛋白酪氨酸激酶受体，位于第,7,号染色体,p13,22,区,全长,200kb,由,28,个外显子组成，编码,1186,个氨基酸,1,广泛分布于除成熟骨骼肌细胞、体壁内胚层和造血组织以外的所有组织细胞。,EGFR,的异常高表达可见于多种恶性肿瘤，其活化可激活多种转录因子,引起细胞的增殖、分化、迁移、黏附、抗凋亡和细胞转化等效应，在肿瘤进展、血管生成、转移扩散、凋亡受抑等方面起重要作用,2,。,EGFR,酪氨酸激酶抑制剂可抑制激活,EGFR,的酪氨酸激酶活性，从而阻断,EGFR,的功能，阻碍肿瘤的发生发展,3,。多数文献提示，分子靶向治疗晚期,NSCLC,疗效明显，而且治疗明显的患者中，,EGFR,基因突变的发生率明显高于治疗无效的患者，,EGFR,基因检测可以作为患者应用分子靶向治疗的一个预测指标，在,NSCLC,个性化治疗过程中提供重要信息。,讨论 表皮生长因子受体(EGFR)是一种蛋白酪氨酸激,讨论,FISH,技术检测的敏感性和特异性较高，操作过程中标本受影响较少，可以定量判读结果。,IHC,法是临床常用的,EGFR,蛋白表达的方法。该方法操作简便，可重复性高，对仪器、材料的要求不高，是国内检测,EGFR,蛋白表达的主要方法。但,IHC,法在标本固定和处理中可能会使蛋白质变性破坏而影响检测结果，易造成假阴性或假阳性，且结果判断人为主观性较强。由于免疫组化方法因抗体类型与来源不同，以及所使用的评分系统的差异而导致结果差异，不同抗体可使结果范围从,12,变至,14,4,。,讨论 FISH技术检测的敏感性和特异性较高，操作过程中,讨论,以,FISH,为标准，,IHC,与之比较：,2,例,IHC,法强阳性（,3+,）标本中，,FISH,检测,EGFR,基因扩增均为阳性，阳性预测值为,100%,；,3,例,IHC,中等阳性（,2+,）标本中，,FISH,检测,EGFR,基因扩增阳性为,2,例，阳性预测值为,66.67%,；,10,例,IHC,弱阳性标本（,1+,），,FISH,检测,EGFR,基因扩增阳性为,5,例，阴性预测值为,50%,；,25,例,IHC,阴性（,-,）标本中，,FISH,检测,EGFR,基因扩增阴性为,19,例，阴性预测值为,76%,。,总体而言，两种方法的符合率较低。但其中,IHC,法,EGFR,表达（,3+,）及（,2+,）的标本，尤以强阳性（,3+,）标本与,FISH,检测,EGFR,基因阳性的一致性较高，与有关文献报到有所不同,5,，但该类标本例数较少，仅占总例数的,12.5%,，其一致性是否可靠需要进一步验证。,讨论以FISH为标准，IHC与之比较：,讨论,表,2.2963,例乳腺癌,HER-2,的,IHC,和,FISH,检测结果比较,以,FISH,作为标准,IHC,与之比较,，,其阳性预测值在,IHC,阳性,(+,以上,),标本中为,91.6%,，,阴性预测值在,IHC,阴性,(0,或,+),标本中为,97.2%,，,在,IHC,弱阳性和阳性,(,0或,+),标本中其敏感性为,92.6%,，,在,IHC,阳性标本中其敏感性为,98.8%,6,。,讨论表2.2963 例乳腺癌HER-2 的IHC和FISH检,讨论,综上所述，,免疫组化法对于评价患者是否使用,EGFR,酪氨酸激酶抑制剂治疗并非最佳的手段，,但可作为筛选检查。,讨论 综上所述，免疫组化法对于评价患者是否使用EGFR,参考文献,1 Reiter J L,T hreadgill D W,Eley G D,et al.Comparat ivegenomic sequence analysis and isolation ofhuman and mousealt ernative EGFR transcripts encoding truncated recept or isofornlsJ.Genomics,2001,71(1):1.,2,Jorissen RN,Walker F,Pouliont N,et al.Epidemal growth factor receptor,：,Mechanisms of activation and signalingJ.Exp Cell Res,2003,，,284,（,1,）,:31.,3 Cunningham D,Humblet Y,S iena S,et al.Cetuximab monotherapy and cetuximab plus irinotecan in irinotecan-refractory metastatic colorectal cancer J.N Engl J Med,2004,351(14):337-345.,4Buckley AF,。,Kakar s,comparison of the Dako EGFR pharmI)xkit and Zymed EGFR antibody for assessment of EGFR status incolorectal adenocarcinomaJ,Appllmmunohistochem Mol Mor_phol,，,2007,，,15(3),：,305309,5,周晓秋，王东关，孙希印，高摇虹，王琳琳，李新功,.,非小细胞肺癌耘郧云砸基因和蛋白检测的比较分析,J.,临床与实验病理学杂志，,2012,28,（,10,）：,1124-1132.,6,刘艳辉,.,乳腺癌组织,HER-2,的荧光原位杂交和免疫组化联合检测的评价,J.,循证医学，,2006,，,6(2),：,81-83.,参考文献 1 Reiter J L,T hreadgi,谢谢！,谢谢！,