基因文库的构建

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第六章：基因文库的构建,主要内容：,1,、,基因组文库,2,、,cDNA,文库,3,、,特殊序列文库,4,、,酵母人工染色体（,PAC,）,基因文库就是随机克隆的集合。,一个,生物体,的,基因组,DNA,用,限制性内切酶,部分酶切后，将酶切片段插入到载体,DNA,分子,中，所有这些插入了基因组,DNA,片段的载体分子的集合体，将包含这个生物体的整个基因组，也就是构成了这个生物体的,基因文库,。将这些载体导入到受体细菌或细胞中，这样每个细胞就包含了一个基因组,DNA,片段与载体重组,DNA,分子，经过繁殖扩增，许多细胞一起包含了该生物全部基因组序列，我们将这一个集合体叫做基因文库。,基因组文库,是由一种生物的所有基因组,DNA,构建而成的,。,cDNA,文库,是利用从,RNA,序列反转录形成的,cDNA,序列构建的。,特殊序列文库,是针对某些特殊基因或序列而建立的。,构建文库所使用的,载体主要,有：,噬菌体,(,噬菌斑,),粘粒,(,菌落,),质粒,酵母人工染色体,(,构建高等真核生物基因文库设计,),基因组文库（,Genomic Libraries）,指把某种细胞的整个基因组,DNA,，,按一定长短要求，酶解成若干片段，在与适当的载体分子重组后，引入相应宿主细菌的细胞中，形成一大批含有重组体,DNA,分子的细胞克隆群体。,即：含有某种生物全部遗传信息的重组,DNA,分子的,克隆总和,建立基因组文库，取决于两项技术系统,一是具有包装能力的,载体系统,，,二是,离体包装系统,。,（,1,）载体系统,具有包装能力的载体系统主要有两类：,噬菌体和粘粒,A,噬菌体载体,插入型,载体，只有一个可供外源,DNA,插入的酶切位点。,取代型,载体，具有两个酶切位点，两个位点之间的,DNA,片段可以被外源,DNA,取代。,取代型载体应用最广泛,如,EMBL1-4,是一类取代型载体系列,B,粘粒,粘粒作为载体的特点是：,一般质粒的特性外还能装载大片段的外源,DNA,，,有可以识别噬菌体包装的,“,cos,”,位点,。,包装时，,只有,能够达到所需片段的分子量标准的重组子才能被装入噬菌体的外壳内，形成有感染能力的颗粒。,然后，经过转导将外源,DNA,克隆化，达到建库目的。,质粒噬菌体,（2,）离体包装系统,A,对带有外源,DNA,的杂合分子有直接筛选和富集的作用。,B,提高重组,DNA,分子产生克隆的频率,离体包装系统由,两种,具有,突变,的溶源化的,大肠杆菌,组成。,溶源化菌株是指具有形成和释放噬菌体的潜在能力的菌株。,基因组文库的规模,N,基因组文库克隆总数,P,所需机率,N=,f,插入片段与基因组,DNA,长度之比,建立基因组文库的一般程序,1,载体,DNA,片段的制备,DNA,分离纯化 限制酶切 脱磷酸化反应,2,供体,DNA,片段的制备,总,DNA,分离纯化 机械剪切法 分离特定大小,DNA,片段 酶法 部分酶切 分离特定大小,DNA,片段,完全酶切,ln,（1-P）,ln,（1-f）,3.,供体与载体,DNA,连接,要提高重组频率，应注意连接反应体系中的总,DNA,浓度和两种,DNA,分子的克分子比率。,4.,重组,DNA,分子的转移和基因组文库的扩增,利用转化或感染方法将连接,DNA,分子导入宿主细胞，让其自主复制，重组,DNA,分子被扩增（重组子比率可能发生变化）,5.,基因组文库质量的评价,1,）文库规模,-,随机挑取一些转化子或重组子，提取质粒,DNA，,电泳测定插入片段大小，然后根据上述公式计算文库大小。,2,）重组频率,-,频率越高，质量越高，可大大减轻后续筛选基因工作量。,2、,cDNA,文库,定义：,从一定生长阶段或条件的某种细胞分离到的全部,mRNA,经反转录成,cDNA,后再重组和增殖所产生的无性繁殖系的总和。,1.,基因特异性,常来自结构基因，仅代表某种生物的一小部分遗传信息，且只代表那些正在表达的基因的遗传信息：,15%,mRNA，8085%,rRNA,，1015%,tRNA,2.,器官特异性,不同器官或组织的功能不一样，因而有的结构基因的表达就具有器官特异性，故由不同器官提取的,mRNA,所组建的,cDNA,文库也就不同,cDNA,文库的特点,4.,不均匀性,在同一个,cDNA,文库中，不同类型的,cDNA,分子的数目是大不相同的，尽管它们都是由单拷贝基因转录而来的。这与基因组文库中的单拷贝基因均具有相同的克隆数相较，这是两种文库的另一差别。,5.各,cDNA,均可获得表达（一般选用的载体都是表达型的）,3.,代谢或发育特异性,处于不同代谢阶段（或发育阶段）的结构基因表达亦不相同,2,cDNA,文库,(1),原理：,RNA,cDNA,克隆,真核基因：内含子和特定的调控结构,采用构建,cDNA,文库是为了对某些真核基因进行研究,N=,f,为某一特定,cDNA,（mRNA）,的分子数目与全部,cDNA,(mRNA）,分子数目之比,ln(1p),ln(1f),cDNA,文库的规模,建立,cDNA,文库的一般程序,1.,载体,DNA,片段的制备,2.,多聚（,A）RNA,的分离与纯化,3.,双链,cDNA,的合成,1,）单链,cDNA,的合成：反转录法,2,）第二条,cDNA,的合成：碱解或酶解（,RNaseH,）,法除去,RNA,分子,2,）同聚物加尾：可大大减少载体,DNA,自身连接,3,）,cDNA,的定向插入,5.,重组,cDNA,分子的转移和文库的建立,选用载体为质粒，可直接转化,E.,coli,；,若为,载体，则需进行体外包装、感染等。,4.,ds,-,cDNA,与载体,DNA,相连,1,）人工接头：要求具平端,ds,-,cDNA,，,酶切时可能导致某些,cDNA,链断裂,cDNA,的定向插入,3,特殊序列文库,架式库,染色体分类库,显微切割法建库,4,酵母人工染色体,(,YAC),构建高等真核生物基因文库,YAC,容纳的,DNA,片段可达,10,6,YAC,的组成,端粒(,TEL),序列,着丝粒,(,CEN),自主复制序列,SUP-4(,外源,DNA,插入失活的选择标记,),URA3,和,TRP1,（2,）程序,A,经大肠杆菌扩增后的载体,DNA，,用,Bam,H,I,切去载体的填充部分,B,用,Bam,H,I,或,Not,I,切开克隆位点然后使两臂分别与经部分酶解的,DNA,大片段两端连接，形成带有外源片段的,YAC,C,通过转染方式将重组后的,YAC,导入受体细胞,D,筛选：利用互补方式将带有,YAC,的酵母细胞营养缺陷型筛选出来。,1,什么是基因组文库？,2,什么是,cDNA,文库？,3,用于构建基因文库的载体有几种？各自的特点是什么？,4,酵母人工染色体由哪几部分组成？各自的功能如何？,画图说明,RNaseH,法合成,cDNA,的过程,