基因工程的基本操作程序最终课件

,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,#,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,#,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,#,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,#,1-2,：基因工程的基本操作程序,专题,1,：基因工程,1-2：基因工程的基本操作程序专题1：基因工程,原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与,RNA,聚合酶结合位点,启动子,终止子,不能转录,为信使,RNA,，,不能编码,蛋白质,：能,转录,相应的信使,RNA,，能,编码,蛋白质,编码区,非编码区,有,调控,遗传信息表达的,核苷酸序列：,启动子、,一段有特殊结构的,DNA,片断，基因的首端，是,RNA,聚合酶识别和结合部位,，,驱动基因转录,启动子,终止子,一段有特殊结构的,DNA,片断，基因的尾端，使,转录终止,终止子,原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游 编码区下,2,真核细胞的基因结构,编码区,非编码区,非编码区,与,RNA,聚合酶,结合位点,内含子,外显子,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,编码区,非编码区,能,编码,蛋白质的序列,非编码序列：,包括非编码区和内含子,不能编码,蛋白质的序列,内含子：,外显子：,不能转录,为信使,RNA,，,不能编码,蛋白质,有,调控,遗传信息表达的,核苷酸序列：,启动子、,终止子,真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶内含子,3,原核细胞,真核细胞,不同点,编码区是,_,的,编码区是间隔的、,_,的,相同点,都由能够编码蛋白质的,_,和具有调控作用的,_,区组成的,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,思考,编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？,连续,不连续,编码区,非编码,原核细胞真核细胞不同点编码区是编码区是间隔的、_的都,4,基因工程基本操作的四个步骤,1,、目的基因的获取,2,、基因表达载体的构建,3,、将目的基因导入受体细胞,4,、目的基因的检测与鉴定,基因工程基本操作的四个步骤1、目的基因的获取2、基因表达载体,一、目的,基因,的获取,主要是,编码蛋白质的结构基因,基因工程基本操作的步骤,如苏云金芽孢杆菌的,抗虫基因,，还有植物的,抗病（抗病毒、抗细菌）基因,、,种子贮藏蛋白的基因,，以及人的,胰岛素基因、干扰素基因,等。,二、获取目的基因的常用方法有哪些,?,（一）从基因文库中获取,（二）利用,PCR,技术扩增,（三）人工合成,一、目的基因的获取主要是编码蛋白质的结构基因基因工程基本操作,6,（一）从基因文库中获取目的基因,将含有某种生物不同基因的许多,DNA,片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为,基因文库,。,1,、分类,基因文库,（,gene library,）,基因组文库,部分基因文库,（如,cDNA,文库）,基因组文库,:,包含了一种生物,所有的,基因的基因文库,部分基因文库,:,包含了一种生物的,一部分,基因的基因文库,（一）从基因文库中获取目的基因 将含有某种生物不同基因,部分基因组文库,cDNA(,互补,DNA),：,是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的,mRNA,经体外反转录后形成的互补,DNA,片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群就叫做这种生物的,cDNA,文库,如,cDNA,文库,(cDNA library,),基因重组,反转录酶,mRNA,cDNA,部分基因组文库cDNA(互补DNA)：如cDNA文库,cDNA,文库和基因组文库的对比,cDNA文库和基因组文库的对比,2.,基因文库的构建方法,1.,从生物中直接获取,2.,人工合成,（真核生物）,(1),反转录法,(2),化学合成法：根据已知的氨基酸序列合成,DNA,法,：鸟枪法，,多用于原核生物,2.基因文库的构建方法1.从生物中直接获取2.人工合成(,1.,直接分离基因,鸟枪法（散弹射击法）,运载体,供体细胞中,DNA,许多,DNA,片段,载入,导入,受体细胞,产生特定性状,目的基因,分离,外源,DNA,扩增,该法最大的缺点是,带有很大的盲目性，工作量大，成功率低。,用,限制酶,切断成许多片段,。,1.直接分离基因鸟枪法（散弹射击法）运载体供体细胞中DN,11,目的基因的,mRNA,单链,cDNA,反转录酶,双链,DNA,（即目的基因双链,cDNA,）,DNA,聚合酶,(1),反转录法,蛋白质的氨基酸序列,mRNA,的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,目的基因,推测,化学合成,推测,2.,人工合成基因法,(2),化学合成法：根据已知的氨基酸序列合成,DNA,法,合成的基因中均无内含子和启动子,杂交双链（,RNA-DNA),核酸酶,H,目的基因的mRNA单链cDNA反转录酶双链DNADNA聚合酶,上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？,优点,缺点,鸟枪法,反转录法,根据已知氨基酸合成,DNA,法,操作简便广泛使用,工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因,专一性强,操作过程麻烦，,mRNA,很不稳定，要求的技术条件较高,专一性强,仅限于合成核苷酸对较少的简单基因,上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？优点缺点鸟枪法反转录法,如何从基因文库中得到所需要的基因？,依据：目的基因的有关信息,如：根据,基因的核苷酸序列,基因的功能,基因在染色体上的位置,基因的转录产物,mRNA,基因翻译产物蛋白质,等特性。,3,、基因文库的目的,为了在,不知目的基因序列,的情况下，便于获得所需的目的基因。,如何从基因文库中得到所需要的基因？依据：目的基因的有关信息如,已知,目的基因序列时,2,、人工合成：,基因比较小，核苷酸序列已知,DNA,合成仪,3,、,PCR,技术扩增目的基因：,PCR,聚合酶链式反应,是一项生物,体外复制,特定,DNA,片段的核酸合成,技术,。通过此技术，可获取大量的目的基因。,已知目的基因序列时2、人工合成：基因比较小，核苷酸序列已知D,循环,变性,退火,延伸,循环变性退火延伸,概念：,PCR,全称为,_,，是一项,在生物,_,复制,_,的核酸合成技术,条件：,_,前提条件,_,、,_,、,_.,原理：,_,方式：,以,_,方式扩增，即,_,（,n,为扩增循,环的次数）,结果：,多聚酶链式反应,体外,特定,DNA,片段,DNA,复制,一段已知目的基因的核苷酸序列,四种脱氧核苷酸,一对引物,热稳定,DNA,聚合酶（,Taq,酶）,指数,2,n,使目的基因的片段在,短时间,内成百万倍地扩增,(,二,),利用,PCR,技术扩增目的基因,概念：PCR全称为_，是一项,过程：,a,、,DNA,变性,（,90-95,）：双链,DNA,模板,在热作用下，,_,断裂，形成,_,b,、退火,（,复性,55-60,）：系统温度降低，引 物与,DNA,模板结合，形成局部,_,_,_,。,c,、延伸,（,70-75,）：在,Taq,酶的作用下，,合成与模板互补的,_,_,_,。,氢键,单链,DNA,双链,DNA,链,d,、循环,过程：a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板b、,1,、目的：,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用,。,二、基因表达载体的构建,基因工程的核心,1、目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一,2,、,基因表达载体的组成：,目的基因,+,启动子,+,终止子,+,标记基因,+,复制原点,目的基因：,外源,DNA,分子的有效片段,启动子：,RNA,聚合酶识别和结合部位，驱动基因转录出,mRNA,终止子：,提供转录终止信号,标记基因：,鉴别受体细胞中是否含有目的基因,复制原点：,DNA,复制的固定起始点,2、基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因,二、基因表达载体的构建,核心,质粒,DNA,分子,限制酶处理,两个切口,获得目的基因,DNA,连接酶,重组,DNA,分子（重组质粒）,同一种,一个切口,两个黏性末端,复制原点,+,启动子,+,目的基因,+,终止子,+,标记基因,二、基因表达载体的构建核心质粒DNA分子限制酶处理两个切,21,载体,与,表达载体,的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分,DNA,片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构,用到的工具酶：,既用到限制酶切割载体，又用到,DNA,连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键,启动子、终止子,对于目的基因表达必不可少,目的基因不能单独进入受体细胞，,必需以表达载体的方式携带进去。,注意,载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DN,22,三、将目的基因导入受体细胞,（一）转化：,将目的基因导入,植物细胞,将目的基因导入,动物细胞,将目的基因导入,微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞,目的基因进入,_,内，并且在 受体细胞内维持,_,_,和,_,的过程,受体细胞,稳定,表达,（二）方法,三、将目的基因导入受体细胞（一）转化：将目的基因导入将目的,23,1,、将目的基因导入植物细胞的方法：,（,1,）,农杆菌转化法,农杆菌特点：,易感染,双子叶植物和裸子植物,，对大多数单子叶植物没有感染能力,原理：,Ti,质粒上的,T-DNA,可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的,DNA,上。,1、将目的基因导入植物细胞的方法：易感染双子叶植物和裸子植物,24,过程：,优点,:,比较经济和有效,过程：优点:比较经济和有效,25,（,2,）,基因枪法,（,3,）,花粉管通道法,（2）基因枪法,2,、将目的基因导入动物细胞,方法：显微注射法,程序：,目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵）显微注射 受精卵 新性状动物胚胎早期培养,2、将目的基因导入动物细胞目的基因表达载体提纯 取卵,27,3,、将目的基因导入微生物细胞,原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少,方法：感受态细胞法（,Ca,2+,处理法）,用,Ca,2+,处理细胞 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收,DNA,分子,用Ca2+处理细胞 感受态细胞,28,四、目的基因的检测与鉴定,检查是否成功,四、目的基因的检测与鉴定检查是否成功,（一）、检测,1,、检测转基因生物染色体的,DNA,上是否插入了目的基因,.,首先取出转基因生物的基因组,DNA,.,将含目的基因的,DNA,片段用放射性同位素等作标记,以此做探针,.,使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体,DNA,中,（,1,）,方法,:,DNA,分子杂交,（,2,）过程,:,（一）、检测1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的,归纳步骤,归纳步骤,31,DNA,分子杂交示意图,采用一定的技术手段，将两种生物的,DNA,分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。,P,15,思考与探究,DNA分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物,4,、个体生物学水平鉴定,2,、检测目的基因是否转录出了,mRNA,3,、检测目的基因是否翻译成,蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法,:,分 子 杂 交,方法,:,抗原抗体杂交,过程,:,用上述探针和转基因生物的,mRNA,杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了,mRNA,4、个体生物学水平鉴定2、检测目的基因是否转录出了mRNA3,归纳步骤,归纳步骤,34,归纳,:,基因工程的基本操作程序,1,、获取目的基因,从基因文库,利用,PCR,化学方法人工合成,2