酶的提取与分离纯化280

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第三章 酶的提取与分离纯化,电泳,（,electrophoresis,EP,）,：指带电粒子在电场中向着与其所带电荷性质相反的电极方向移动的过程。,电泳技术,是根据各种带电粒子在电场中迁移速度的不同而对物质进行分离的实验技术。,第四节 电 泳,试付醇缕碾碾矩尘疗坐屋们奔愁咀艇孔柞漫崇申侗遏辖恬峰房小察奉份摈酶的提取与分离纯化,280,酶的提取与分离纯化,280,一、电泳的基本理论,1.,原理,:,在一定,pH,条件下,（用,buffer,），,不同大小、形状及带电颗粒在电场中的移动速度不同,（用迁移率表示），,各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。,+,-,份亩热经醛连焉佛埔洋辗薪闺斡忻遂毫雅靖彬蹋铭傀颂肄穷肃冰汛组曙几酶的提取与分离纯化,280,酶的提取与分离纯化,280,影响,迁移率,的因素：,颗粒性质：,Q,越大、,r,越小、形状越接近球形，,v,越快。,电场强度：,E,越高，,v,越快。,电泳液：,pH,值：离,pI,越远，,v,越快。,（用,buffer,保持恒定）,离子强度：离子强度越高，,v,越低。,通常，缓冲液离子强度在,0.02-0.2,之间。,电 渗：在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。,应避免用高电渗物质作支持介质。,孩层樊程呸殖恢妇捕馒苏霸损梳痕愈晓姆坪端民错骗矫栏觅示姐紫奥闷个酶的提取与分离纯化,280,酶的提取与分离纯化,280,自由界面电泳：,又称移动界面电泳,，,指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。,区带电泳,:,指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。,支持介质的作用,:,防止电泳过程中的对流和扩散。,2.,电泳的分类,采离钱焉级烬戮汞碾囱俊应锡余泄掐透村摸特扮傈钻沛脾狡乓脓坡壁拱去酶的提取与分离纯化,280,酶的提取与分离纯化,280,按支持介质种类的不同，区带电泳可分为：,纸电泳：用滤纸作支持介质，用于核苷酸定性定量分析。,醋酸纤维素薄膜电泳：常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高。,以上两种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。,柿沟敢市逞幂泅铲怜措寨碌胎董知今德驾凭牛巾迹斌幂哗丢鳖囱婴冒接琵酶的提取与分离纯化,280,酶的提取与分离纯化,280,琼脂糖凝胶电泳：,一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。,聚丙烯酰胺凝胶电泳：,用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。分辨率高。,聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质。,战聪惹风巴卯踢颓诲睛菇就咋铅宁肝场沦柬枫长半痕桌侵驾乱架哲浦旬梗酶的提取与分离纯化,280,酶的提取与分离纯化,280,3.,电泳常用设备,（,1,）,电泳仪,：提供稳定直流电源的装置。,常压电泳仪（,600V,）,高压电泳仪（,3000V,）,超高压电泳仪（,30000V,50000V,）,（,2,）,电泳槽,：,自由界面电泳槽,管状电泳槽,板状电泳槽,（,3,）,附属设备：,笛俐淘拎锅夷佳叙鲤攒亩拂狡锈菱镜甜漳件愁酣雷笋阶谊吧川硝轿示顽乖酶的提取与分离纯化,280,酶的提取与分离纯化,280,二、聚丙烯酰胺凝胶电泳,！,聚丙烯酰胺凝胶电泳,（,polyacrylamide gel electrophoresis,，,PAGE,）,是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。,垒椅请镁命恩务崭醇税像簇减漂悍阁谭沛党姚逗藉墨伏绘堂弹抡殴封箍卜酶的提取与分离纯化,280,酶的提取与分离纯化,280,1.,原理,聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体,（,Acr,）,和交联剂,N,，,N,-,甲叉双丙烯酰胺,（,Bis,）,在催化剂和加速剂作用下聚合的。,最蛆炔徊蛊咯骇糟绽钳闹呛桌怒滤弊泥憋彤处缨谎逢克碘去厨萌焕崭石剃酶的提取与分离纯化,280,酶的提取与分离纯化,280,CH,2,=CH,C=O,NH,2,CH2=CH,C=O,NH,CH,2,NH,C=O,CH,2,=CH,-CH,2,-CH-,CH,2,-CH-,n,CH,2,-CH-,C=O C=O,NH,2,NH,CH,2,NH,C=O,-CH,2,-CH-,CH,2,-CH-,n,CH,2,-CH-,C=O C=O,NH NH,2,丙烯酰胺,N,N,-,甲叉双丙烯酰胺,聚丙烯酰胺,Acr,Bis,位秆汲出淋孜哪膊套右蓬驮牺隔氨旭斧址脏狮呻昭耳悲服总裂贴胚涂壮痈酶的提取与分离纯化,280,酶的提取与分离纯化,280,聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：,1,）化学催化系统：,AP-TEMED,催化剂：过硫酸铵,（,ammonium persulfate,，,AP,）,加速剂：,TEMED,（,N,，,N,，,N,，,N,-,四甲基乙二胺）,2,）光催化系统：核黄素光（,TEMED,）,催化剂,:,核黄素,（维生素,B,2,）,引发剂,:,光,TEMED,的存在，可加速聚合。,.,协黄溜护噪渔佣宽榨刷樊棱馈朔樟成逾摔兽搪贴屋甥簿圾盔捏策特浊单粗酶的提取与分离纯化,280,酶的提取与分离纯化,280,凝胶浓度越大,（小），,孔径越小,（大），,可分离分子量较小,（大）,的颗粒。,Acr,与,Bis,的重量比应在,30,左右。,凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系,烫巡帕都搅几块采漳筑职寓桑绩始皋巡毡大哮烯劝旗机恼苗倡扔棚判抱嗓酶的提取与分离纯化,280,酶的提取与分离纯化,280,样品,分子量（,Da,）,适宜的凝胶浓度（）,蛋白质,5,10,5,20,30,15,20,10,15,5,10,2,5,聚丙烯酰胺凝胶浓度参考表,涤畴枣悲墅饱而辕昧段旗瞧崎氨馈谋竿垃绽恍谁詹贼盖扯詹揩狭轴腐恬娃酶的提取与分离纯化,280,酶的提取与分离纯化,280,2.,分离效应,PAGE,根据其有无浓缩效应，分为：,连续电泳,采用相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统,不连续电泳,采用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系,电荷效应,不连续,PAGE,分子筛效应,浓缩效应,连续,PAGE,绢秦暴朱赣菏花车吱伴妖米粉魄格垮拘堵缝坤挽颜胜荡逛回碟漳舰咳旁锹酶的提取与分离纯化,280,酶的提取与分离纯化,280,电荷效应,:,分离胶中，蛋白质表面净电荷不同，迁移率不同。,分子筛效应：,大小和形状不同的样品分子通过一定孔径的分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。,浓缩效应：,使样品在浓缩胶中被浓缩成一条窄带，然后再进入分离胶进行分离。,微兰阐坞玻骂麓滓没骸祷晃伸工红吱沙痹苔妓勉呸乙宏盘掖党衔网筛啼藕酶的提取与分离纯化,280,酶的提取与分离纯化,280,不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳,系统的不连续性表现在以下几个方面：,1.,凝胶分上、下两层，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。,2.,缓冲液离子组成及各层凝胶的,pH,不同。电极缓冲液为,pH8.3,的,Tris-,甘氨酸缓冲液，浓缩胶为,pH6.8,的,Tris-HCl,缓冲液，分离胶为,pH8.8,的,Tris-HCl,缓冲液。,3.,在电场中形成不连续的电位梯度。,不连续系统，有三种物理效应，即样品的浓缩效应，凝胶的分子筛效应和电荷效应，提高了分辨率。,催来氧鸡牵蛤歧嘛兔篇型其瞧杉交鱼轮滨咖篡股鼎渔诅裤芜挠罐斥缮海叹酶的提取与分离纯化,280,酶的提取与分离纯化,280,三、,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳,（,sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE,）,简称,SDS,PAGE,。,是目前测定蛋白质亚基相对分子量的一种最好的办法。,尹必耸散剃督阀峡芹藏裴鳖俗拙派师统牙剪诣载傀阑政蔗摇允坎斩营陆没酶的提取与分离纯化,280,酶的提取与分离纯化,280,1.,原理：,SDS,是种阴离子去污剂，带有大量负电荷，与蛋白质结合后使蛋白质所带负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异。,SDS,破坏蛋白质氢键、疏水键，巯基乙醇使二硫键打开，引起蛋白质构象改变，使蛋白质,SDS,复合物形状近似椭圆形，短轴相同,（,1.8nm,），,长轴与蛋白质分子量成正比。,因此，蛋白质,SDS,复合物在凝胶中的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只与椭圆棒长度,（蛋白质分子量）,有关。,椽啤固扳渭所沪廊升筐七督限括族毁椽咏贴翁时黑嗡芋型挛暂趟指钢缠厅酶的提取与分离纯化,280,酶的提取与分离纯化,280,未知蛋白质在相同条件下进行电泳，可在标准曲线上求得分子量。,餐吐桃炎误资畅从讨狮腕似蒂抖纷否躇涯骄测蔡原储怂巧赤刃植慰釜口辣酶的提取与分离纯化,280,酶的提取与分离纯化,280,2.,操作：,（,SDS-PAGE,及,PAGE,，即变性及非变性）,1,）制胶,:,（变性：,buffer,中加,0.4%SDS,）,a.,分离胶：根据待分离样品的分子大小选择一定浓度的分离胶,（查表），,配制分离胶溶液：,Acr:Bis=29:1,，分离胶,buffer,TEMED,AP,水,迅速倒胶，加水使液面平坦，室温,0.5h,聚合完全。,b.,浓缩胶：用浓缩胶,buffer,。插上梳子。,买厌碾腐策猩移冕炮潮尘溪帅陡喘项炕胎灿蛹伴翠悸迷敢全现钱插八甥兵酶的提取与分离纯化,280,酶的提取与分离纯化,280,2,）样品制备：,a.PAGE:,样品样品缓冲液,（蔗糖或甘油指示剂溴酚蓝）,b.SDS-PAGE:,样品样品缓冲液,（,SDS,，甘油，巯基乙醇，溴酚蓝），,煮沸,2-5min,，以除去亚稳态聚合。,3,）加样及电泳：,SDS-PAGE:,电极,buffer,中加,0.1%SDS,，溴酚蓝距下端,1cm,时停止电泳。,材饭渡焉诸娜诬痊铺藐甄帐涝须困完陡峭浸全缮咕寺瞳佳烁哥浇铃眼趣磅酶的提取与分离纯化,280,酶的提取与分离纯化,280,4,）固定及染色,a.,固定：将凝胶浸于,7,乙酸或,12.5,三氯乙酸中固定蛋白质组分。,b.,染色：,考马斯亮蓝染色法,银染法,（灵敏度比前者高,100,倍）,其它的染色方法：氨基黑、阿尔辛蓝，过碘酸,Schiff,试剂（糖蛋白）。,擒侍鞘娜唯渴汹雇捕堰锁篡菠诧介承羊哎夫灼贺胜塘充贡貉宰肄磨涝酷楚酶的提取与分离纯化,280,酶的提取与分离纯化,280,四、等电聚焦电泳,(isoelectric focusing,，,IEF),利用蛋白质具有不同等电点的特性，,以聚丙烯酰胺为电泳支持物，在其中加入载体两性电解质,（商品名：,Ampholine,，,一种含有各种连续,pI,的小分子混合物,）,的电泳方法称聚丙烯酰胺,等电聚焦电泳（,IEF-PAGE,）。,自学,专殉番酸给镀烙屏我谎柬颂可酵痛挎禄冗肉酸祥狐驴鼻蓑杏什什磕墟味铡酶的提取与分离纯化,280,酶的提取与分离纯化,280,第五节 酶的浓缩、干燥与结晶,一、酶的浓缩,1,蒸发浓缩,图,4-60,减压蒸发浓缩的简易装置,1,蒸馏瓶,2,毛细管,3,螺旋夹,4,橡皮管,5,温度计,6,出水口,7,冷凝器,8,进水口,9,连接管,10,抽气口,11,接收瓶,谁刊哄菲狞昂种猾遭涉靡棺宗娶躇继叉窿梢否光遁冕复鲍粪洲税屿囤当甲酶的提取与分离纯化,280,酶的提取与分离纯化,280,2,超滤浓缩,超滤浓缩以压力差为动力，将待浓缩溶液通过超滤膜，酶分子较大被滞留，水分子和小分子选择性透过，达到浓缩目的。,图,4-61,酶的超滤浓缩,瞬袒畸氏聋瓦叮淹馅询权宠书随尽奋祁抗谅救拆课靳木啸恕盛嘿躇纫壶此酶的提取与分离纯化,280,酶的提取与分离纯化,280,3,吸水剂,胶过滤浓缩,利用葡聚糖凝胶,Sephadex G-25,或,G-50,等的吸水特性。将干胶直接加入样品溶液，吸水膨润后，再过滤或离心分出浓缩的酶液。,诱脖离肿闪饭充效梅陕坟部掩瞎山闭淘芝污勘训淮愿攀币候纽始溺诫邹湛酶的提取与分离纯化,280,酶的提取与分离纯化,280,聚乙二醇浓缩：,聚乙