微生物细胞工程

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第四节 微生物细胞工程,微生物是一个相当笼统的概念，既包括细菌、放线菌这样微小的原核生物，又涵盖菇类、霉菌等真核生物。,微生物细胞工程,是指应用微生物细胞进行细胞水平的研究和生产。具体,内容包括,各种微生物细胞的培养、遗传性状的改变、微生物细胞的直接利用以及获得微生物细胞代谢产物等。,本节仅从细胞工程的角度，概述通过原生质体融合的手段改造微生物种性、创造新变种的途径与方法。,一 微生物细胞融合,早在1958年，,冈田善雄,发现，用紫外线灭活的仙台病毒可以诱发艾氏腹水瘤细胞融合产生多核体。,1976年巨大芽抱杆菌、枯草杆菌、裂殖酵母等原生质体融合取得成功，构巢曲霉和烟曲霉、娄地青霉和产黄青霉等真菌种间原生质体融合也获得成功。,（一）微生物细胞,融合工艺,菌种选择,扩大培养,大量菌体细胞,高渗溶液,(SMM液、DP液),脱壁酶,(蜗牛酶、溶菌酶),原生质体,融合剂(PEG),原生质体融合,去融合剂,融合原生质体,培养基,细胞壁再生,菌落繁殖,融合体筛选,（二）影响微生物细胞融合的因素,微生物原生质体融合受下列因素的影响：,参与融合菌株的遗传性状,。,参与融合的菌株一般都需要,有选择标记,，标记主要通过,诱变,获得。在进行融合时，应先测定各个标记的自发回复突变率。若回复突变率过高，则不宜作为选择标记。,制备原生质体的菌龄。,制备细菌原生质体应取,对数生长中期菌龄的细胞,，因为此时的细胞壁中肽聚糖的含量最低，对溶菌酶也最敏感。,培养基成分。,细菌在不同的培养基中培养对溶菌酶的敏感程度不一。,培养用基本培养基,比用完全培养基效果更好。,细胞的前处理。,由于细胞壁结构的差异，同样是革兰氏阳性菌，对溶菌酶的敏感程度也不一样。芽孢杆菌对溶菌酶的敏感性大于棒状杆菌。在棒状杆菌制备原生质体前，菌体前培养需要,添加少量青霉素,以阻止肽聚糖合成过程中的转肽作用，从而削弱细胞壁对溶菌酶的抗性。,二 原核细胞的原生质体融合,细菌是最典型的原核单细胞生物，细胞外有一层成分不同、结构相异的坚韧细胞壁，形成抵抗不良环境因素的天然屏障。,根据细胞壁成分的差异将细菌分成,革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌,两大类。,前者,肽聚糖,约占细胞壁成分的90，而后者的细胞壁上除了部分,肽聚糖,外还有大量的,脂多糖,等有机大分子。由此决定了它们对溶菌酶的敏感性有很大差异。,溶菌酶,广泛存在于动植物、微生物细胞及其分泌物中。它能,特异地切开肽聚糖中N-乙酰胞壁酸与N-乙酰葡萄糖胺之间的-1，4糖苷键,，从而使革兰氏,阳性菌,细胞壁溶解。,由于革兰氏,阴性细菌,细胞壁组成成分的差异，处理革兰氏阴性菌时，除了,溶菌酶,外，一般还要添加适量的,EDTA,(乙二胺四乙酸)，才能除去它们的细胞壁，制得原生质体或原生质球。,三 真菌的原生质体融合,真菌主要包括单细胞的酵母类和多细胞菌丝类。,降解真菌细胞壁、制备原生质体是融合的关键,。,真菌的细胞壁成分较复杂,，主要由几丁质及各类葡聚糖构成纤维网状结构，夹杂着少量的甘露糖、蛋白质和脂类。,因此可在含有渗透压稳定剂的反应介质中加入,消解酶,进行酶解，也可用,蜗牛复合酶,进行处理，原生质体的得率都在90以上。此外还有,纤维素酶、几丁质酶、新酶,等。,真菌原生质体融合的要点与前述细胞融合类似，多以,PEG,为融合剂，在特异的选择培养基上筛选融合子。,但真菌多为单倍体，,只有形成真正单倍重组体的融合子才能稳定传代,；杂合双倍体和异核体的融合子遗传特性不稳定，需经多代考证才能最后断定是否为真正的杂合细胞。,思考题,1,微生物细胞工程的主要研究内容,2微生物细胞融合工艺,