PCR原理及其操

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,PCR,反应原理及其操作,生物化工,韩 栋,1.PCR,的基本原理,2.PCR,反应体系,3.PCR,的基本步骤,4.PCR,反应五要素,5.PCR,的反应流程,PCR,的基本原理,试管中进行的,DNA,复制反应，依据,DNA,半保留复制,的机理；,体外,DNA,分子于不同温度下可,变性和复性,的性质；,通过人为控制体外合成系统的温度，使,双链,DNA,变成单链,，,单链,DNA,与人工合成的,引物退火,，,DNA,聚合酶使,引物沿着单链模板延伸为双链,DNA,。,PCR,反应体系,4,种,dNTP,混合物 各,200umol/L,引物 各,10,100pmol,模板,DNA,0,.,1,2ug,Taq DNA,聚合酶,2,.,5u,Mg,2+,1,.,5mmol/L,PCR,的基本步骤,72,94,55,PCR,循环,PCR,的基本步骤,1.,变性：高温使双链,DNA,解离形成单链（,94,，,30s,）。,2.,退火：低温下，引物与模板,DNA,互补区结合（,55,，,30s,）。,3.,延伸：中温延伸。,DNA,聚合酶催化以引物为起始点的,DNA,链延伸反应（,70,72,，,30,60s,）,PCR,的基本步骤,1,2,3,4,5,22,55,72,94,时间（,min,）,温度,（）,低温退火,2,高温变性,1,适温延伸,3,重复,13,步,2530,轮,目的,DNA,片段,扩增,100,万倍以上,DNA,双螺旋,DNA,变性,形成,2,条单链,DNA,单链,与引物复性,子链延伸,DNA,加倍,高温变性,低温退火,中温延伸,PCR,每一步的转换通过,温度的改变,控制。,DNA,模板解链（,变性,）、引物与模板结合（,退火,）、,DNA,聚合酶催化新生,DNA,的合成（,延伸,）三个步骤构成,PCR,反应的一个循环。,此循环反复进行，可使目的,DNA,得以迅速扩增。,理论扩增率：,2,n,递增,（,n,为循环次数），,25,30,循环，目标,DNA,可增加,10,9,倍。,实际扩增率：,(,),n,，,X,为,PCR,的实际扩增率，,平均约为,75%,。,由于引物和底物的消耗，酶活力的下降等因素，扩增产物的增加，逐渐由指数形式变为线性形式，所以实际上进行,30,个循环后，扩增倍数一般可达,10,6,10,7,。,以上“变性、退火、延伸”三部曲为,PCR,一轮循环。,PCR,扩增曲线,PCR,反应五要素,1.,引物,（,primer,）,2.,酶,（,Taq DNA polymerase,）,3.dNTP,（,dATP,dGTP,dCTP,dTTP,）,4.,模板,（,template,）,5.Mg,2+,（,magnesium,）,1.,引物,引物是,PCR,特异性反应的关键，,PCR,产物的特异性取决于引物与模板,DNA,互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板,DNA,序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用,PCR,就可将模板,DNA,在体外大量扩增。,引物设计的原则,引物长度：,15-30bp,，常用为,20bp,左右；,引物扩增跨度：,以,200-500bp,为宜，特定条件下可扩增长至,10kb,；,引物碱基：,G+C,含量以,40-60%,为宜，,G+C,太少扩增效果不佳，,G+C,过多易出现非特异条带。,ATGC,最好随机分布，避免,5,个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列；,避免引物内部出现二级结构：,避免两条引物间互补，特别是,3,端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带；,引物,3,端的碱基应严格要求配对：,特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致,PCR,失败；,引物中有或能加上合适的酶切位点,，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处；,引物的特异性：,引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性；,引物量：,每条引物的浓度,0.1 0.5,M,，以最低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会,2.,酶及其浓度,目前有两种,Taq DNA,聚合酶供应：,天然酶：,从栖热水生杆菌中提纯,基因工程酶：,大肠菌合成,一个典型的,PCR,反应约需酶量,2.5U,（指总反应体积为,100l,时）；,浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。,3.dNTP,的质量与浓度,dNTP,的质量与浓度和,PCR,扩增效率有密切关系：,dNTP,呈颗粒状,，保存不当易变性失活,dNTP,溶液呈酸性,，使用时应配成高浓度后，以,1M NaOH,或,1M Tris-HCl,的缓冲液将其,pH,调节到,7.0,7.5,，小量分装，,-20,冰冻保存。多次冻融会使,dNTP,降解,在,PCR,反应中,，,dNTP,应为,50,200umol/L,，尤其是注意,4,种,dNTP,的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低,PCR,产物的产量,dNTP,能与,Mg,2+,结合,，使游离的,Mg,2+,浓度降低,4.,模板（靶基因,target gene,）,模板核酸的量与纯化程度，是,PCR,成败的关键环节之一；,传统,DNA,纯化方法：,采用,SDS,和蛋白酶,K,来消化处理标本；,SDS,：是溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而,破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，,SDS,还能与蛋白质结合,而沉淀；,蛋白酶,K,能水解消化蛋白质，特别是与,DNA,结合的组蛋白,再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇,或异丙醇沉淀核酸提取的核酸即可作为模板用于,PCR,反应。,临床检测标本,：可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于,PCR,扩增；,RNA,模板提取：,采用异硫氰酸胍或蛋白酶,K,法，要防止,RNase,降解,RNA,5.Mg,2+,浓度,Mg,2+,对,PCR,扩增的特异性和产量有显著的影响,;,在一般的,PCR,反应中，各种,NTP,浓度为,200mol/L,时，,Mg,2+,浓度为,1.5,2.0 mmol/L,为宜,;,Mg,2+,浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低,Taq DNA,聚合酶的活性，使反应产物减少。,PCR,的反应流程,温度与时间的设置,循环次数,1,、温度与时间的设置,设置变性,-,退火,-,延伸三个温度点,标准反应中采用,三温度点法,，双链,DNA,在,90,95,变性，再迅速冷却至,40,60,退火，然后快速升温至,70,75,延伸，,对于较短靶基因（长度,100,300bp,）可采用,二温度点法,，将退火与延伸温度合二为一，一般采用,94,变性，,65,左右退火与延伸。,变性温度与时间：,一般,93,94,，,1min,足以使模板变性,若低于,93,则需延长时间,但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。,退火,(,复性,),温度与时间：,退火温度是影响,PCR,特异性的重要因素,退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的长度,对于,20,个核苷酸，,G+C,含量约,50%,的引物，,55,作为选择最适退火温度的起点较为理想,Tm,（解链温度）,4(G+C)+2(A+T),复性温度,=Tm,值（,5,10,）,在,Tm,值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高,PCR,反应的特异性,复性时间一般为,30,60s,，足以使引物与模板之间完全结合,引物的复性温度,通过以下公式帮助选择合适的温度：,延伸温度与时间,：,延伸温度：一般选择在,70,75,之间,常用温度为,72,过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。,延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定,1Kb,以内的,DNA,片段，延伸时间,1min,（足够）,3,4kb,的靶序列需,3,4min,扩增,10kb,需延伸至,15min,延伸时间过长会导致非特异性扩增,对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些,2,、循环次数,循环次数,决定,PCR,扩增程度,循环次数,主要取决于模板,DNA,的浓度,循环次数：,选在,30,40,次之间,循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多,