leture基因表达与蛋白质纯化

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,复旦大学生物化学系 黄伟达, 2004年5月18日,基因表达,与,蛋白质纯化,技术探讨,内 容,基因表达体系及优劣势,大肠杆菌中表达蛋白质,可能碰到的问题,基因工程的应用领域,1.,蛋白质功能研究,2.,生物制药和疫苗生产,3.疾病的基因治疗,4.,食品、化工用酶制剂,5.,抗虫、抗逆植物改良,6.细胞代谢产物的富集,基因表达体系,1.,原核体系,2.,真核体系,大肠杆菌(,Escherichia coli,),遗传背景清楚，基因工程操作方便，商品化表达载体种类齐全，表达效率高；,基本不分泌，易形成包含体(无正确折叠的立体结构)，无加糖等修饰,枯草杆菌,(,Bacillus subtilis,),分泌蛋白质能力强，一般有天然立体结构；,无加糖修饰功能，培养液中蛋白酶活性高，重组蛋白易受蛋白酶的水解；,质粒不稳定，尚无商品化的表达载体,其 他,乳酸菌,(Lactic acid bacteria),沙门氏菌,(,Salmonella typhimurium,),苏云金杆菌,(,Bacillus thuringiensis,),真核细胞表达体系,酵母细胞,昆虫细胞,哺乳动物细胞/组织,植物细胞/组织,酵母细胞,可生产分泌型蛋白；有天然立体结构，有加糖修饰功能；可进行染色体整合型基因表达;,糖链与哺乳动物加工的不一致，培养上清多糖浓度高;,商品化表达体系：,酿酒酵母,（Saccharomyce cerevisiae）,;,毕氏酵母,(Pichia pastoris);,裂殖酵母,（Schizosaccharomyce pombe）,昆虫细胞,可以病毒感染的型式在成虫中生产，也可在体外培养细胞中生产蛋白;,适合分泌型和膜蛋白的表达，有加糖修饰；,糖链有所区别，表达量有限；,作为药物宿主细胞未被FDA认可,CHO细胞,可进行分泌表达，有天然立体结构，加糖方式与人体蛋白质完全一致；,表达量不够高，培养成本较高,植物组织,植物可大面积种植，可以廉价大规模生产；,转基因植物制作费时，表达的组织特异性较难控制；,表达量较难提高，分离纯化不方便,动物乳腺组织,分泌生产有天然立体结构和活性的蛋白质至乳汁，产量高，分离纯化方便，特别适合药用蛋白的生产；,转基因动物制作花费巨大，实验周期长,鸟类输卵管组织,分泌生产有天然立体结构的蛋白质到蛋清，产量高，容易贮存和运输，分离纯化方便；,实验成本低，饲养费用低；,加糖方式可能与人有所不同,体系选择,研究基因功能:,大肠杆菌,裂殖酵母,昆虫细胞,CHO细胞,多肽药物生产:,大肠杆菌,毕氏酵母,CHO细胞,乳腺组织,疫苗:,大肠杆菌,酵母,大多数沿用细胞培养产物进行灭毒,单抗生产:,杂交瘤细胞,工业酶生产:,各种微生物,在大肠杆菌中直接生产有活性的胰岛素,在大肠杆菌中生产人凝血,IX,因子,在大肠杆菌生产,Calcitonin,类,C,端酰胺化短肽,在大肠杆菌中进行蛋白质的糖基化修饰,在酵母中进行与哺乳动物细胞一致的糖基化,在鸡输卵管中进行与哺乳动物细胞一致的糖基化,提高乳腺分泌表达的,Factor IX,类因子的活性,在植物中得到与哺乳动物细胞一致的糖基化,有可能以后做到的事,在大肠杆菌中表达,外源基因,按蛋白质类型分,单纯表达:,pJLA,系列,用,NcoI,/,NdeI,导入,AUG,的载体,融合表达:融合各种,tag,GST,CBD,MAL,GFP,etc,分泌表达:,pel,/,ompT,分泌肽,按启动子分,lac,及衍生的,tac,trc,pac,rac,等启动子,IPTG,诱导,lamda,phage P,L,和,P,R,启动子,热诱导,T7,启动子,IPTG,诱导,T5,启动子,IPTG,诱导,ara,启动子,阿拉伯糖诱导,大肠杆菌表达载体分类,pJLA50X,系列;,pcDNAII,;etc,pET,系列,(,T7 promoter,Novagen,公司),pQE,系列,(,T5 promoter,Qiagen,公司),pMAL,系列,(周质表达,BioLabs,公司),pGEX,系列,(,GST,融合表达,Pharmacia,公司),pBAD,系列,(,Arabinose,诱导型),常用表达载体,pTYB,系列,(,CBD,融合,可以自我切割,BioLabs,),Protein A,GST（,glutathione,S-,transferase,）,CBD(chitin-binding domain,BioLabs,;,cellulose-binding domain,Novagen,),calmodulin,-binding domain,Stratagene,),MBP(maltose-binding protein),GFP (green fluorescence protein),Thioredoxin,*,帮助二硫键形成,Dsb,(,periplasma,enzyme,DsbA,DsbC,),*,二硫键的形成与,SUMO(small,ubiquitin,-related modifier),KSI(,ketosteroid isomerase,),基本上全部沉淀,各种融合蛋白表达载体,帮助可溶化,帮助分泌到周质,可用亲和层析纯化,His-tag(,6-8 Histidine,),T7-tag (,MASMTGGQQMG,),HSV-tag(,QPELAPEDPED,),S-tag(,KETAAKFERQHMDS,),VSV-G-tag(,TTDIEMNRLGK,),HA-tag(,YPYDVPDYA,),Flag-tag,(,DYKDDDDK,),Myc,-tag(,EQKLISEEDL,),各种用于抗体识别的标记,Biotinylation,-tag,100,多,AA,的结构域,在大肠杆菌中被识别为生物素化的位点.,Promega,的,PinPoint,TM,Xa,-1;Invitrogen,的,pET104-DEST.,未,命名,DVEAWLGAR,被用来和,streptoavidin,结合,(个人通讯,),未,命名,一些病毒外壳蛋白的片段,破坏细胞膜的结构导致容易进入细胞,有前景的特殊用途的tag,DTT:,intein,的,Cys,溴化,氰:,Met,Thrombin:,LVPR,GS,Factor,Xa,:,IEGR,Enterokinase,:,DDDDK,PreScission,TM,protease:,LEVLFQ,GP,Genenase,I,TM,PGAAHY,TEV protease:,ENLYFQ,G,融合蛋白的专一性切割,BL21(DE3)/,pLysS,:,自身表达,T7 RNA polymerase,适用,pET,系列等带,T7,启动子的载体,M15/SG13009:,自身表达,T5 RNA polymerase,适用,pQE,系列等带,T5,启动子的载体,BL21,TrxB,(DE3):,thioredoxin reductase,突变,Origami:,thioredoxin reductase,/,glutathione reductase,双突变,适合带,thioredoxin reductase,的,融合表达载体,帮助形成更多的二硫键,BR21CodonPlusRIL:,富含,AT,的真核生物基因的表达,BR21CodonPlusRP:,富含,GC,的真核生物基因的表达,特殊的表达用菌株,Novagen,Stratagene,Invitrogen,BioLabs,Qiagen,Pharmacia,Promega,Clontech,Roche,Gibco,/BRL,重要的原核表达质粒提供商,如果所表达的蛋白质有二硫键并需要正确的立体结构,尽可能进行可溶性表达;,如果所表达的蛋白质没有二硫键或只用来制备抗血清,采用包含体表达比较好;,如果希望表达的多肽的分子量小于10,kDa,一定要进行融合表达,采用,MBD,融合,采用,GST,融合,采用,CBD,融合,采用,thioredoxin,融合,采用,Origami,等宿主菌,降低菌体培养的速度,温度(15-30),降低转速,让表达产物可溶化,采用,CBD,融合,(,pET36/37),采用,Dsb,融合,(,pET39/40),采用带,pelB,/,ompT,引导肽的载体,(,pET12/20/22),采用带,MBD,融合,(,pMAL,载体,Biolabs,),采用带,SUMO,融合,(,pET SUMO,Invitrogen),让蛋白质分泌到间质去,纯化方便:先用,EDTA/蔗糖,溶液处理,然后,5 mM MgSO4,洗出,透析法:,简单;,但费时,费缓冲液,蛋白质浓度不能过高(容易产生沉淀),快速稀释法:,最常用的小规模复性方法;,但比较费时,费缓冲液,蛋白质的浓度不能高(容易产生沉淀),超滤透析法:,比较省缓冲液,处理量大;,但费时,要控制好蛋白质浓度,凝胶过滤法:,快速,可重复性高,不会产生沉淀,操作复杂一点,亲和层析复性法,水相二相法,etc,包含体来源蛋白质的复性,表达量不够高；,包含体在8,M,尿素中不能溶解；,重组蛋白在大肠杆菌中表达的分子量偏小；,带,His-tag,重组蛋白不吸附到,Ni-chelating,树脂上；,Ni-chelating,分离纯化的效果不好；,GST,融合蛋白不吸附到,glutathione,-,Sepharose,上；,包含体来源的采用透析法或稀释法复性时全部沉淀；,Ni-chelating,错用,DTT,后发生黑色沉淀该怎么办？,贵重的亲和层析树脂经常发生结块该怎么办？,某些表达载体的表达效率在放大培养时无法提高,经常碰到的问题,尝试不同表达载体，特别是N端有融合蛋白的载体,是不是忘了加还原剂（,DTT,或巯基乙醇）？,是不是在20冻存过？,用4,M,盐酸胍试试,是不是酸性蛋白质？,是不是蛋白质的合成提前中止了？（富含,Arg,Ile,Leu,Pro,这几种氨基酸）,可以尝试用,BL21,CodonPlus,RIL,或,RP,作宿主菌,(,Stratagen,)；,使用,C,端带,His-tag,的,融合表达载体（如,pET21,Novagen,）,以便纯化全长的融合蛋白,His-tag,被操作过程混入的重金属离子所饱和，可以通过添加0.5,mM EDTA,来去除重金属离子的干扰；,His-tag,被包裹在不易和树脂发生结合的,位置（比较罕见）;,其他不明原因导致弱结合,样品没有很好细心去除不溶性物质,重复使用前树脂没有洗干净,蛋白质之间存在相互作用,可以提高盐浓度,改变,pH,添加2-6,M,尿素等方法来洗去杂蛋白质,是不是在进行复性时用了Redox buffer,尝试用 Urea gradient /Gel filtration来解决,尽快用0.1 N HCl冲洗,用0.1 N NaOH/0.1%SDS洗,主要是溶氧量的问题,可以通过在摇瓶中加入不同量的培养基的方式来确定最佳体积,