细胞免疫染色及畸胎瘤切片制作流程

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,多能干细胞免疫染色及畸胎瘤石蜡切片的制作流程,成璐,复旦大学,生物医学研究院,第一部分,多能干细胞免疫染色过程,铺细胞,细胞的固定,细胞的荧光染色,观察荧光染色并拍照,提纲,铺细胞,ES,细胞或,iPS,细胞的密度要求,无滋养层细胞较好,传代后至克隆形态良好，密度适中。,通常传至,24,孔板中。,因为用,Hochest,染核对照也会将滋养层细胞的核同时染上，影响克隆定位。,Oct4/DAPI,铺细胞,细胞的固定,细胞的荧光染色,观察荧光染色并拍照,提纲,材料,细胞的固定,流程,把细胞固定在,4,PFA,中，室温放置,30min,4,多聚甲醛（,4,PFA,P,araformaldehyde,）,固定细胞之前，将培养基吸弃，用,PBS,涮,2,次,的,PBS,配制（,），,100mL PBS,加,4,克多聚甲醛。,由于多聚甲醛难溶于水，需用磁力搅拌器加热搅拌，温度控制在,60,以下。,铺细胞,细胞的固定,细胞的荧光染色,观察荧光染色并拍照,提纲,细胞的荧光染色,材料,流程,阳性,染色对照,：染色呈阴性时，证实染色的有效性,阴性染色对照,：染色呈阳性时，证实染色的特异性,一抗、二抗、,Hoechst,（,DAPI,）,：分别发挥如下作用：识别特异抗原、特异一抗及细胞核,抗体稀释液,：稀释抗体,封闭液,：封闭非特异性反应,洗涤细胞,透膜（仅限染核抗体）,一抗孵育,二抗孵育,染核定位（,Hochest,）,细胞的荧光染色,材料,阳性,染色对照,：以多能干细胞标记物染色为例，阳性染色对照细胞是确定表达相应抗体的细胞，如,ES,细胞或经过验证的,iPS,细胞,阴性染色对照,：是确定不表达相应抗体的细胞，如成纤维细胞等。,一抗,：要确保所购买的一抗识别所染细胞的物种；要做预实验以确定最适的抗体浓度,二抗,：要根据所染细胞自身所带的荧光类型决定相应的二抗的荧光类型，二者应不同。,Hoechst,：英文名称：,bisBenzimide,（,Sigma B1155,）；以,PBS,配制成,1mg/ml,的母液,，分装后于,-20,保存；常用的可置于,4,，染色时以,1XPBS 1000,倍稀释。,抗体稀释液,：,0.2%BSA,和,0.1%TritonX100,溶于,1XPBS,；,4,保存；尽量现用现配，因含蛋白成分，容易变质，长菌。,封闭液,：含,1%BSA+4%normal serum+0.4%TritonX100,的,1XPBS,溶液；,4,保存；尽量现用现配，因含蛋白成分，容易变质，长菌。,细胞的荧光染色,流程,所有洗涤，浸泡步骤都在摇床上进行。目的是为了洗涤，浸泡充分均匀。,“洗涤”指将平板置于摇床上摇洗,3,5,分钟,把细胞固定在,4,PFA,中，室温放置,30min,1X PBS,洗涤,2,次,抗体稀释液洗涤两次,无水乙醇中浸泡两次，每次,20min,（或,3,次，,10min/,次）,(,此步仅限于核蛋白染色，如,Oct4,，,Nanog,或,Rex1,等，不能用于膜蛋白,),1X PBS,洗涤,1,次,封闭液封闭细胞，室温，,1h,将一抗稀释在抗体稀释液中，加到样品上，室温,2h,或,4,放置过夜,(,以,24,孔板为例，,一抗的体积：,200ul/,孔,),细胞的荧光染色,流程,吸弃一抗，用,PBT,（,0.1%TritonX100 in PBS,）洗涤细胞,3,5,次,将二抗稀释在抗体稀释液中，并加到样品孔里，室温放置,1h;,(,以,24,孔板为例，,二抗的体积：,200ul/,孔,),注意：从以下步骤开始，样品要注意避光！,用,PBT,洗涤,3,次，约,5min/,次,用,PBS,洗涤两次，,5min/,次,再用,4,PFA,室温固定,30min,最后再用,PBS,洗涤两次，每次,5min,Hoechst,染核,室温放置,5min,铺细胞,细胞的固定,细胞的荧光染色,观察荧光染色并拍照,提纲,观察荧光染色并拍照,iPS,细胞染色实例,多能干细胞标记物的常用抗体：,膜抗体：,SSEA-1,、,SSEA-3,、,SSEA-4,胞浆抗体：,Tra-1-60,、,Tra-1-81,核抗体：,Oct4,、,Nanog,、,Rex1,h,阳性对照,阴性对照,Rat-iPSCs,观察荧光染色并拍照,iPS,细胞染色实例,阳性对照,阴性对照,h,hESCs,Tra-1-60,观察荧光染色并拍照,iPS,细胞染色实例,Pig-iPSCs,观察荧光染色并拍照,iPS,细胞染色实例,Human,-iPSCs,EB,分化染色,Sox17,AFP,Nestin,-actin,SMA,Tuj1,内胚层,中胚层,外胚层,第二部分,畸胎瘤石蜡切片的制备,畸胎瘤,的获得,畸胎瘤石蜡切片的制备,畸胎瘤石蜡切片的,HE,染色,畸胎瘤石蜡切片各胚层组织的辨别,提纲,畸胎瘤的获得,ES,细胞或,iPS,细胞的收集,细胞数量：一个,T75,长到,80-90%,满时，细胞数大约为,1000,万个，可以打两个点，即每个点约,300-500,万个细胞；,细胞处理：,小鼠及大鼠,iPS,细胞：将细胞消化成单细胞；,1200rpm,离心,5min,后弃上清；以小于,400ul,的,10%DMEM,重悬；,人,iPS,细胞：将消化下来的细胞吹打成较小块；静置至细胞团块沉底，并弃上清；以小于,400ul,的,hES,培基重悬；,收集细胞到,1ml,注射器内并注射。,畸胎瘤的获得,ES,细胞或,iPS,细胞的注射,材料：多重免疫缺陷小鼠（,NOD,SCID,小鼠）,注射部位：后腿内侧肌肉注射,畸胎瘤的生长和摘取,畸胎瘤的获得,通常注射,30-40,天之后，畸胎瘤就长成直径大概,1-,2cm,左右的球体,当畸胎瘤长到一定体积时，手术摘除畸胎瘤,通常畸胎瘤都是实质性的，也有个别呈空泡状。,约,1-2cm,畸胎瘤,的获得,畸胎瘤石蜡切片的制备,畸胎瘤石蜡切片的,HE,染色,畸胎瘤石蜡切片各胚层组织的辨别,提纲,流程,固定,畸胎瘤石蜡切片的制备,包埋,切片,材料,4%PFA,：固定畸胎瘤组织用,石蜡,（熔点约,50-60,度）：包埋组织,石蜡包埋机,（非必须）：包埋组织，还需要包埋盒、包埋底,石蜡切片机,（必须）：切半薄“,Semi-thick”,石蜡切片,染色缸、染色架、载玻片、盖玻片,溶液,：,载玻片：,防脱片；也可以自制“蛋白胶”涂在切片上晾干,乙醇（,EtOH,）、二甲苯（,Xylene,）、氯仿（,Chloroform,）,HE,染色液（,H,：,Hematoxyline,苏木精、,E,：,Eosin,伊红）,封片树脂,染色架,染色缸,捞片、展片,染色,流程,固定,畸胎瘤石蜡切片的制备,在,4%PFA,中固定，,4,（浸泡）过夜,换成新鲜的,4%PFA,，再次,4,浸泡过夜,（过长时间浸在固定液中会降低样品的抗原性，影响后续的免疫染色）,4,固定是为了更好的保持标本的抗原性，室温也可以,流程,固定,畸胎瘤石蜡切片的制备,包埋之脱水、透明,70,EtOH 1h,80,EtOH 1h,90,EtOH 1h,95,EtOH 1h,100,EtOH 1h,Fresh 100,EtOH 1h,Fresh 100,EtOH overnight,氯仿,1h,新鲜氯仿,1h,新鲜氯仿,overnight,脱水,透明,流程,畸胎瘤石蜡切片的制备,包埋,石蜡包埋盒,经透明处理的样品,溶解,石蜡,1h,2h,溶解,石蜡,50-60,，取决于石蜡的融点,固定,包埋之包埋,流程,固定,畸胎瘤石蜡切片的制备,包埋 之 包埋,如果没有石蜡包埋机，可以用,60,烘箱代替；,利用酒精灯加热镊子可代替高温镊子；,将样品快速放到石蜡包埋底内，盖上包埋盒的底座，直至石蜡全部凝结；,修整蜡块形状、备用。,溶解蜡存放槽,出蜡口,冷冻台,高温镊子,石蜡包埋盒和包埋底存放槽,各种规格的石蜡包埋底,用单面刀片修整蜡块，并达到以下要求：,（,1,）蜡块呈正方形或长方形，蜡块各面要平直，样品位于蜡块正中央；,（,2,）样品边缘与蜡块边缘的距离约,3mm,。,流程,固定,畸胎瘤石蜡切片的制备,包埋 之 修整蜡块,样品与蜡块边缘有一定距离，以便切片能够连成蜡带,平行,流程,固定,畸胎瘤石蜡切片的制备,包埋,切片,蜡块,固定座,刀片,切片厚度微调旋钮,手动切片转轮,切片厚度：,5,微米,蜡带,毛笔,固定,包埋,切片,捞片、展片,流程,畸胎瘤石蜡切片的制备,37,蒸馏水,载玻片置于,37-42,的烘片台（平面）上,样品切片,切片借助水的表面张力展开至平整,吸除多余水分，,37,烤片过夜,备用,做好样品,ID,的标记,流程,畸胎瘤石蜡切片的制备,烤片机,37,烤片过夜，防止脱片,展片温水槽,温度设定：,37-42,左右,固定,包埋,切片,捞片、展片、烤片,畸胎瘤,的获得,畸胎瘤石蜡切片的制备,畸胎瘤石蜡切片的,HE,染色,畸胎瘤石蜡切片各胚层组织的辨别,提纲,流程,脱蜡亲水,畸胎瘤石蜡切片的,HE,染色,100%EtOH,浸泡,2,次,10min/,次,95%EtOH 5min,90%EtOH 5min,80%EtOH 5min,70%EtOH 5min,蒸馏水浸洗,3,次，,5min/,次,Xylene1,Xylene3,Xylene2,Xylene4,脱蜡,亲水,（非一次性使用，可反复多次使用）,二甲苯浸泡,4,次,5min/,次,流程,染色,畸胎瘤石蜡切片的,HE,染色,在盐酸酒精溶液内浸一下至变成接近红色，此步骤称为“盐酸分化”,(1%,盐酸酒精溶液：指染色缸中,70,酒精中含,1%,盐酸,),将切片 在自来水龙头下流水冲洗,15-20,分钟，至切片呈理想的紫蓝色，此步骤称,“,蓝化,”,（颜色的适宜度取决于染色者的经验）,蒸馏水中涮洗一下,切片在,Eosin,溶液中染,5min,自来水涮洗至水接近无色,蒸馏水涮洗一下,切片在,Hematoxylin,溶液中浸泡,10min,自来水中涮洗,2,、,3,次至水接近无色,蒸馏水中涮洗,1,次,流程,脱水封片,畸胎瘤石蜡切片的,HE,染色,100%EtOH,浸泡,2,次,10min/,次,脱水,二甲苯浸泡,4,次,5min/,次,Xylene1,Xylene3,Xylene2,Xylene4,透明,（非一次性使用，可反复多次使用）,70%EtOH short time,80%EtOH short time,90%EtOH short time,树脂封片，显微镜下观察,(,以上几步一方面是为了脱水，另一方面是为了脱去多余的,Eosin,颜色，所以，要注意观察切片颜色的变化。,70,和,80,的酒精只要稍稍浸一下即可，,90,的酒精是调整颜色的关键步骤，在这一步要依靠染色者根据切片颜色自觉调整时间。新鲜的无水酒精没有脱色作用,),流程,畸胎瘤石蜡切片的制备,在,样品中央滴一滴封片树脂,固定,包埋,切片,捞片、展片,封片,封片树脂,避免气泡,通风橱内操作为宜！,末端,蘸有少量二甲苯的盖玻片,畸胎瘤,的获得,畸胎瘤石蜡切片的制备,畸胎瘤石蜡切片的,HE,染色,畸胎瘤石蜡切片各胚层组织的辨别,提纲,畸胎瘤石蜡切片各胚层组织的辨别,分化良好的畸胎瘤,畸胎瘤石蜡切片各胚层组织的辨别,外胚层,神经上皮,色素上皮,角质上皮,畸胎瘤石蜡切片各胚层组织的辨别,中胚层,脂肪组织,肌肉组织,软骨组织,骨组织,畸胎瘤石蜡切片各胚层组织的辨别,内胚层,呼吸上皮,腺体组织,原始肾脏组织,Thank you!,