蛋白质免疫印迹技术及常见问题分析课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,蛋白质免疫印迹技术及,常见问题分析,张绍进,stean allaf,a Western Blot简介,a Western Blot一般流程,a Western Blot常见问题分析,stean allaf,Western blot简介:,口印迹法(blotting)是指将样品转移到固相载体上,而后利,用相应的探测反应来检测样品的一种方法,1975年,Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜(NC,膜)上,并利用DNA-RNA杂交检测特定的DNA片段的方,法,称为 Southern印迹法。,而后人们用类似的方法,对RNA和蛋白质进行印迹分析,对RNA的印迹分析称为 Northern印迹法,对单向电泳后的,蛋白质分子的印迹分析称为 Western印迹法,对双向电泳后,蛋白质分子的印迹分析称为 Easterr印迹法,stean allaf,Western blot基本原理,pirate,Product,s,ss8,E,arTery C,Secondary antibod,BLocking agent,enzyme,Protein,arete,stean allaf,Western blot优点,口高分辨率的电泳技术,口特异敏感的抗原-抗体反应,1-5ng中等大小的靶蛋白,stean allaf,Western Blot应用,口目的蛋白的表达特性分析,口目的蛋白与其乞蛋白的互作,口目的蛋白的组织定位,口目的蛋白的表达量分析,stean allaf,Protein blot on,Western Blot流程,蛋白样品的制备,SDS-PAGE,转膜,封闭,Detect Antibody,一抗杂交,二抗杂交,底物显色,of Interest,stean allaf,蛋白样品的提取,通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白,水溶液提取法,针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系,统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质,最常用的溶剂。,有机溶剂提取法,对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取,包括乙醇、丙酮和丁醇等。,通过层析或电洗脱法制备目的蛋白,stean allaf,蛋白样品的定量,目前常用比色法测定样品蛋白的含量:Bradford,法(考马斯亮蓝法)、Lowry法(Folin-酚试剂,法)、BCA法等。但各有优缺点,大家可以根据,具体情况选取。按相应蛋白质定量试剂盒操作说,明操作,测定样品浓度。,蛋白质浓度测定的各种方法汇总:,bbs.bbioo/thread-23639-1-1.html,stean allaf,蛋白样品的变性,口2 SDS-PAGE上样缓冲液,100 mM Tris-HCI(pH6.8),1M Tris-HCl(pH6.8),10 ml,200 mM DTT,1M DTT,20 ml,4%SDS,SDS,4 g,0.2%溴酚兰,20%甘油,甘油,溴酚蓝,02g,ddH2O,总体积,100m,口DTT可临用前以1:4比例混合加入,亦可全部配好分装,-20冻存,口按1:1比例与蛋白质样品混合,95100加热515min,冰上冷却后再上样,上样量一般为20-25p,总蛋白量20,50go,