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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,Phage display,Liu,Yun,基于将某个蛋白与其遗传信息之间直接联系的筛选方法,1,噬菌体展示技术,（Phage Display techniques，PDT）起源于1985年，是一种用于筛选和改造功能性多肽、蛋白质强有力的生物技术，广泛应用于蛋白组学、基因克隆等多个分子生物学领域。,概 述,目前噬菌体展示技术的研究进展非常迅速，在抗原决定簇的定位、蛋白质相互作用位点的确定、特异调节分子的分离和人工抗体和疫苗的制备、诊断技术、酶抑制剂的研究开发、多肽药物的研制等生物技术研究的不同领域得到了应用，并对这些领域产生了深远的影响。,2,Smith GP.Filamentous fusion phage:novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface.Science,1985,228:1315-1317.,1985年Smith首次通过基因工程的手段，将外源基因插入丝状噬菌体基因组中，从而使表达的外源肽或蛋白与噬菌体外壳蛋白一起展示在噬菌体表面，由此建立了噬菌体展示技术。,1990年Scott等首次将随机序列肽与丝状噬菌体表面蛋白g 融合展示在噬菌体表面，建立了噬菌体展示随机肽库。,Scott J K,Smit h GP.Searching for peptide ligands with an epitope library.Science,1990,249:386.,3,噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时，外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。到目前为止，人们已开发出了单链丝状噬菌体展示系统、噬菌体展示系统、T4噬菌体展示系统等数种噬菌体展示系统。,基本原理,4,特 点,该技术的主要特点是将特定分子的,基因型,和,表型,统一在同一病毒颗粒内，即在噬菌体表面展示特定蛋白质，而在噬菌体核心,DNA,中则含有该蛋白的结构基因。另外，这项技术把基因表达产物与亲和筛选结合起来，可以利用适当的靶蛋白将目的蛋白或多肽挑选出来。,5,Phages,Filamentous phages,M13,Fd,F1,Others,T4,6,Filamentous phages,Infect many gram-negative bacteria,Circular single stranded DNA genome,About 6.4kb.p.,Long,flexible tube structure,about 1m long and 6.5nm in diameter,Reproduced and secreted from infected bacteria without cell killing or lysis(lysogenic phage),7,(a)Adenovirus.,(b)Rotavirus.,(c)Influenza virus(courtesy of George Leser).,(d)Vesicular stomatitis virus.,(e)Tobacco mosaic virus.,(f)Alfalfa mosaic virus.,(g)T4 bacteriophage.,(h)M13 bacteriophage.,M13 噬菌体颗粒结构,8,M13噬菌体的生活史,其裂解周期为：,1)吸附(adsorption)2)侵入(entory),3)复制（生物合成biosynthesis）,4),成熟,(maturation)5)装配(assembly),6)释放(release),9,丝状噬菌体的基因及蛋白结构,http:/www.scielo.br/scielo.php?pid=S1415-47572005000100001&script=sci_arttext,pIII (406aa,58copies),pVIII(50aa,2700 copies),pVI (112aa,58copies),10,载体的插入位点,11,pIII,和,pVIII,噬菌体展示系统,pIII系统,pVIII系统,拷贝数,少,多,多肽片段大小,大,10个氨基酸,亲和力,高,低,适用范围,常用于展示由cDNA和基因组序列编码的多肽，范围较广,展示小肽，范围较窄,12,Used for cloning foreign genes among other applications,Proteins and peptides are fused to the,Capsid,(surface)of the phage,The combination of the phage and peptide is known as a,Fusion Protein,实验设计思路,13,选择方法：,淘选（Panning),而不是,筛选（Screening),14,非展示系统 展示系统,15,固相,淘选系统,完整细胞,组织，器官,常规法,淘选方法,正负法,竞争法,16,T7噬菌体展示筛选系统,测序分析插入序列,将噬菌体文库铺在固定的靶蛋白上,洗脱未结合的噬菌体,加入大肠杆菌，扩增和富集洗脱的噬菌体,铺富集文库,铺盘分离单个克隆,34轮筛选,验证实验：,结合实验,实验流程,17,Solid phase selection with immunotubes,v,Immunotube,coated with,antigen,coated with,steptavidin and,biotinylated antigen,B,B,B,B,B,B,B,v,18,Bind to Streptavidin,coated microtitre wells,19,Wash to remove unbound phage particles,20,Elute bound phage,21,Amplify eluted phage,Repeat selection,Analyze,a)ELISA,b)Specificity,c)Sequencing,d)Affinity,e)Activity,E.coli,感染,和扩增,22,举 例,呼吸道合胞病毒感染呼吸道上皮细胞靶向肽的筛选及验证,23,24,25,26,27,28,29,噬菌体展示系统的应用及优缺点,应用范围,30,受体,配体 信息传递,蛋白质,蛋白质,拮抗剂,蛋白质,DNA,抑制剂,蛋白质,其他,多肽,诊断,基因表达控制,中和活力,药物及药物导航,酶及底物,31,优点：,A.高通量的淘选：,将靶标分子（抗体）固定在固相载体上，加入噬菌体展示肽库（噬菌体的数量可达10,11,PFU），利用抗原-抗体的特异性亲和力将与抗体结合的噬菌体吸附在固相载体上，反复数轮扩增、淘选，即可将有用的基因从多达百万以上的噬菌体克隆中分离出来。,B.高效率：,在极低的存在水平下，挑选到高亲和力噬菌体成为可能。,C.可用于模拟表位的筛选：,利用噬菌体展示技术得到模拟表位，同样可诱发与天然表位相似的特异性免疫反应。,D.展示的多肽或蛋白质与其包含在噬菌体内部的基因密码的连接,:,使得结合肽或蛋白质的序列分析既快速又简便。,E.,易于纯化,重组噬菌体的纯化步骤简单、不要求昂贵的试剂与设备，在一般的实验室条件下就可以完成。,32,缺点：,首先，目前所建的肽库容量有限，要想构建大片段的肽库很困难。,其次，需要解决肽库的多样性问题。,第三，少数多肽由于疏水性过强，或由于影响外膜蛋白的折叠而不能展示在噬菌体表面。,33,谢 谢！,34,
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