生物化学002氨基酸与蛋白质课件-课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,2024/10/1,1,第三章,蛋白质,2022/10/111第三章 蛋白质,2024/10/1,2,蛋白质是由,20,种,L-,型,氨基酸组成的长链分子。,第一节 蛋白质概论,一、 蛋白质的化学组成与分类,1,、元素组成,碳,50%,氢,7%,氧,23%,氮,16%,硫,0-3%,微量的磷、铁、铜、碘、锌、钼,凯氏定氮：粗蛋白质含量,=,蛋白氮,6.25,2,、 氨基酸组成,2022/10/112蛋白质是由20种L-型氨基酸组成的长,2024/10/1,3,酶、运输蛋白、营养和贮存蛋白、激素、受体蛋白、运动蛋白、结构蛋白、防御蛋白。,3,、分类,（,1,）,按组成,简单蛋白 结合蛋白,（,2,）按分子外形的对称程度,球状蛋白质 纤维状蛋白质 膜蛋白质,（,3,）按功能,2022/10/113酶、运输蛋白、营养和贮存蛋白、激素、受,2024/10/1,4,蛋白质分子量,=,氨基酸数目*,110,二、蛋白质的大小与形状,少于,50,个氨基酸的低分子量氨基酸多聚物称为肽，寡肽或生物活性肽、多肽。,多于,50,个氨基酸的称为蛋白质。,110=,氨基酸残基的平均分子量（,P160,）,2022/10/114蛋白质分子量 = 氨基酸数目*110二,2024/10/1,5,四级结构：亚基之间的聚集形式,三、蛋白质分子的构象与结构层次,蛋白质都有自己特有的天然空间结构，称为构象。,一级结构：氨基酸顺序,二级结构：,-,螺旋、,-,折叠、,-,转角，无规卷曲,三级结构：整个肽链（亚基）的形状,2022/10/115四级结构：亚基之间的聚集形式三、蛋白质,2024/10/1,6,1, 酶,2,结构成分,（结缔组织的胶原蛋白、血管和皮肤的弹性蛋白、膜蛋白）,3,贮藏,（卵清蛋白、种子蛋白）,4,物质运输,（血红蛋白、,Na,+,-K,+,-ATPase,、葡萄糖运输载体、脂蛋白、电子传递体）,5,细胞运动,（肌肉收缩的肌球蛋白、肌动蛋白）,6,激素功能,（胰岛素）,7,自我保护,（,抗体、皮肤的角蛋白、血凝蛋白,8,接受、传递信息,（受体蛋白，味觉蛋白）,9,调节、控制细胞生长、分化、和遗传信息的表达,（组蛋白、阻遏蛋白）,四、 蛋白质功能的多样性,2022/10/1161 酶 四、 蛋白质功能的多样性,2024/10/1,7,第二节 氨基酸,四大类生物分子中，蛋白质是生物功能的主要载体，而氨基酸是蛋白质的构件分子。,自然界中存在的成千上万种蛋白质，在结构和功能上的惊人的多样性归根结底是由,20,中常见的氨基酸的内在性质造成的。,这些性质包括：,聚合能力,酸碱性,侧链结构的多样性,化学功能的多样性,2022/10/117第二节 氨基酸,2024/10/1,8,一、蛋白质的水解,酸水解：,色氨酸破坏，天冬酰胺、谷胺酰胺脱酰胺基,碱水解：,消旋，色氨酸稳定,酶水解：,水解位点特异，用于一级结构分析，肽谱,2022/10/118一、蛋白质的水解酸水解：色氨酸破坏，天,2024/10/1,9,非蛋白质氨基酸,：存在于生物体内但不组成蛋白质,(,约,150,种,),二、氨基酸的结构与分类,基本氨基酸,（编码的蛋白质氨基酸）：组成蛋白质，,20,种,稀有氨基酸,：是多肽合成后由基本氨基酸经酶促修饰而来,重点,2022/10/119非蛋白质氨基酸：存在于生物体内但不组成,2024/10/1,10,-,氨基酸的一般结构,-,氨基酸,与羧基相邻的,-,碳原子（,C,）上有一个氨基的氨基酸。,COO-,-,C,-,R,H,3,N,可变的侧链,H,2022/10/1110-氨基酸的一般结构-氨基酸,2024/10/1,11,（,1,）,R,为脂肪烃基的氨基酸（,5,种）,（一）基本氨基酸（编码的蛋白质氨基酸，,20,种）,1,、按照,R,基的化学结构分类,2022/10/1111（1）R为脂肪烃基的氨基酸（5种）（,2024/10/1,12,Gly,是唯一不含手性碳原子的氨基酸，因此不具旋光性,从,Gly,至,Ile,，,R,基团疏水性增加,特点,R,基均为中性烷基，,R,基对分子酸碱性影响很小，它们几乎有相同的等电点。（,6 .00.03,）,2022/10/1112Gly是唯一不含手性碳原子的氨基酸，,2024/10/1,13,（,2,）,R,中含有羟基和硫的氨基酸（共,4,种）,2022/10/1113（2） R中含有羟基和硫的氨基酸（共,2024/10/1,14, Ser,的,-CH,2,OH,基（,pKa=15,）在生理条件下不解离，但在大多数酶的活性中心都发现有,Ser,残基存在。,Ser,和,Thr,的,-OH,往往与糖链相连，形成糖蛋白。,Cys,的,R,中含巯基（,-SH,），具有两个重要性质：,（,1,）在较高,pH,值条件，巯基离解。,（,2,）两个,Cys,的巯基氧化生成二硫键，生成胱氨酸。,Met,在生物合成中是一种重要的甲基供体。,特点,2022/10/1114 Ser的-CH2OH基（,2024/10/1,15,（,3,）,R,中含有酰胺基团（,2,种）,酰胺基中氨基易发生氨基转移反应,2022/10/1115（3）R中含有酰胺基团（2种）酰胺基,2024/10/1,16,（,4,）,R,中含有酸性基团（,2,种）,Asp,、,Glu,Asp,侧链羧基,pKa,为,3.86,，,Glu,侧链羧基,pKa,为,4.25,它们是唯一在生理条件下带有负电荷的的两个氨基酸,2022/10/1116（4）R中含有酸性基团（2种）,2024/10/1,17,（,5,）,R,中含碱性基团（,3,种）,2022/10/1117（5）R中含碱性基团（3种）,2024/10/1,18,Lys,侧链氨基的,pKa,为,10.53,，生理条件下，,Lys,侧链带有一个正电荷（,NH,3,+,），侧链的氨基反应活性增大。,Arg,是碱性最强的氨基酸，侧链上的胍基是已知碱性最强的有机碱，,pKa,值为,12.48,，生理条件下完全质子化。,His,是,pKa,值最接近生理,pH,值的一种（游离氨基酸中为,6.00,，在多肽链中为,7.35,） ，是在生理,pH,条件下唯一具有缓冲能力的氨基酸。,His,在酶的酸碱催化机制中起重要作用,特点,2022/10/1118 Lys侧链氨基的pKa为1,2024/10/1,19,在,280nm,处，,Trp,吸收最强，,Tyr,次之，,Phe,最弱。,（,6,） 芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸）,CH,2,H,3,N,+,-C-H,COO,-,CH,2,H,3,N,+,-C-H,COO,-,OH,NH,CH,C,CH,2,H,3,N,+,-C-H,COO,-,苯丙氨酸,（,Phe,F,）,酪氨酸,（,Tyr,Y,）,色氨酸,（,Trp,W,）,2022/10/1119在280nm处，Trp吸收最强，Ty,2024/10/1,20,（,7,）、杂环族氨基酸（,2,种）,Pro,的,-,亚氨基是环的一部分，因此具有特殊的刚性结构。,一般出现在两段,-,螺旋之间的,转角,处，,Pro,残基所在的位置必然发生骨架方向的变化，,2022/10/1120（7）、杂环族氨基酸（2种）Pro的,2024/10/1,21,婴儿期：,Arg,（精氨酸）和,His,（组氨酸）供给不足，,属半必需氨基酸。,u,必需氨基酸,u,成年人：,Thr,苏氨酸,Val,缬氨酸,Leu,亮氨酸,Ile,异亮氨酸,Phe,苯丙氨酸,Trp,色氨酸,Lys,赖氨酸,Met,甲硫氨酸,携（缬氨酸）一（异亮氨酸）两（亮氨酸）本（苯丙氨酸）单（蛋氨酸，即甲硫氨酸）色（色氨酸）书（苏氨酸）来（赖氨酸）。,携（写）一两本单色书来；一两色素本来淡些；假设来写一两本书,2022/10/1121婴儿期：Arg（精氨酸）和His（组,（一）赖氨酸（,Lysine,）：促进大脑发育，是肝及胆的组成成分，能促进脂肪代谢，调节松果腺、乳腺、黄体及卵巢，防止细胞退化；（二）色氨酸（,Tryptophane,）：促进胃液及胰液的产生；（三）苯丙氨酸（,Phenylalanine,）：参与消除肾及膀胱功能的损耗；（四）蛋氨酸（又叫甲硫氨酸）（,Methionine,）；参与组成血红蛋白、组织与血清，有促进脾脏、胰脏及淋巴的功能；（五）苏氨酸（,Threonine,）：有转变某些氨基酸达到平衡的功能；（六）异亮氨酸（,Isoleucine,）：参与胸腺、脾脏及脑下腺的调节以及代谢；脑下腺属总司令部作用于甲状腺、性腺；（七）亮氨酸（,Leucine,）：作用平衡异亮氨酸；（八）缬氨酸（,Viline,）：作用于黄体、乳腺及卵巢。（九）组氨酸（,Hlstidine,）：作用于代谢的调节；,2024/10/1,22,（一）赖氨酸（Lysine）：促进大脑发育，是肝及胆的组,2024/10/1,23,在维持蛋白质的三维结构中起着重要（蛋白质的疏水核心）。,（,1,）非极性氨基酸,9,种,这类氨基酸的侧链都能与水形成氢键，因此很容易溶于水,（,2,） 不带电何的极性氨基酸,6,种,（,3,）带负电荷的氨基酸,(,酸性氨基酸,) 2,种,（,4,）带正电荷的氨基酸,(,碱性氨基酸,) 3,种,2022/10/1123 在维持蛋白,2024/10/1,24,非极性氨基酸,在维持蛋白质的三维结构中起着重要作用（蛋白质的疏水核心）。,2022/10/1124非极性氨基酸 在维持蛋,2024/10/1,25,2022/10/1125,2024/10/1,26,不带电荷的极性氨基酸,这类氨基酸的侧链都能与水形成氢键，因此很容易溶于水。,2022/10/1126不带电荷的极性氨基酸这类氨基酸的侧链,2024/10/1,27,带负电荷的氨基酸,(,酸性氨基酸,),2022/10/1127带负电荷的氨基酸(酸性氨基酸),2024/10/1,28,带正电荷的氨基酸,(,碱性氨基酸,),2022/10/1128带正电荷的氨基酸(碱性氨基酸),2024/10/1,29,胶原蛋白中的,Lys,侧链氧化时能形成很强的分子间,(,内,),交联。,Arg,的侧链碱性很强，与,NaOH,相当。,His,是一个弱碱，是天然的缓冲剂，往往存在于许多酶的活性中心。,非极性氨基酸一般形成蛋白质的,疏水核心,，带电荷的氨基酸和极性氨基酸位于表面。,酶的活性中心：,His,、,Ser,、,Cys,2022/10/1129 胶原蛋白中的Lys侧链氧化,2024/10/1,30,（二） 非编码的蛋白质氨基酸,也称修饰氨基酸，是在蛋白质合成后，由基本氨基酸修饰而来。,（,1,）,4-,羟脯氨酸,（,2,）,5-,羟赖氨酸,这两种氨基酸主要存在于结缔组织的纤维状蛋白中。,（,3,）,6-N-,甲基赖氨酸,存在于肌球蛋白中,（,4,）,-,羧基谷氨酸,存在于凝血酶原及某些具有结合,Ca,2+,离子功能的蛋白质中。,（,5,）,Tyr,的衍生物：,3.5 -,二碘酪氨酸、甲状腺素,存在于甲状腺蛋白中,（,6,）锁链素由,4,个,Lys,组成,存在于弹性蛋白中,2022/10/1130（二） 非编码的蛋白质氨基酸也称修,2024/10/1,31,2022/10/1131,2024/10/1,32,-Ala,（泛素的前体）、,-,氨基丁酸（神经递质）,（三） 非蛋白质氨基酸,不组成蛋白质，但有生理功能的氨基酸,L-,瓜氨酸、,L-,鸟氨酸是尿素循环的中间物,1,、,L-,型, ,氨基酸的衍生物,2,、,D-,型氨基酸,D-Glu,、,D-Ala,（肽聚糖中）、,D-Phe,（短杆菌肽,S,）,3,、,-,、,-,、,-,氨基酸,2022/10/1132-Ala（泛素的前体）、-氨基丁,2024/10/1,33,2022/10/1133,生物化学002氨基酸与蛋白质课件-课件,2024/10/1,35,精氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸是尿素循环的中间物。,三、氨基酸的功能,1,、组成蛋白质,2,、一些氨基酸及其衍生物充当化学信号分子,-,氨基丁酸，色氨酸衍生物：,5-,羟色胺、褪黑激素，都是神经递质。,甲状腺素（,Tyr,衍生物），吲哚乙酸（,Trp,衍生物）都是激素,3,、氨基酸是许多含,N,分子的前体物,核酸的含氮碱基、血红素、叶绿素的合成都需要氨基酸。,4,、一些基本氨基酸和非基本氨基酸是代谢中间物,2022/10/1135精氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸是尿素循环的中,2024/10/1,36,Gly,（甘氨酸）,只有一种构型,无旋光性,Thr,（苏氨酸）,和,Ile,（异亮氨酸）,有四种光学异构体。,其余,17,种氨基酸有两种光学异构体：,L,型、,D,型。,构成蛋白质的氨基酸均属,L-,型。,四、氨基酸的构型、旋光性和光吸收,1,、 氨基酸的构型,2022/10/1136Gly（甘氨酸）只有一种构型,无旋光,2024/10/1,37,2022/10/1137,2024/10/1,38,L-,苏氨酸和,D-,苏氨酸组成消旋物。,L-,别一苏氨酸和,D-,别,-,苏氨酸组成消旋物,2,、 氨基酸的旋光性,氨基酸的旋光性（符号和大小）取决于它的,R,基的性质，并与溶液的,pH,值有关。,外消旋物：,D-,型和,L-,型的等摩尔混合物。,2022/10/1138L-苏氨酸和D-苏氨酸组成消旋物,2024/10/1,39,胱氨酸有三种立体异构体：,L-,胱氨酸、,D-,胱氨酸、内消旋胱氨酸。,L-,胱氨酸和,D-,胱氨酸是外消旋物,内消旋物：,分子内消旋,2022/10/1139胱氨酸有三种立体异构体：内消旋物：,2024/10/1,40,3,、氨基酸的光吸收性,Tyr,、,Phe,、,Trp,的,R,基含有共轭双键，在,220-300nm,近紫外区有吸收。,p145,2022/10/11403、氨基酸的光吸收性Tyr、Phe、,2024/10/1,41,五、 氨基酸的酸碱性质,1,、氨基酸在晶体和水溶液中主要以兼性离子形式存在,2,、氨基酸的两性解离和酸碱滴定曲线,（,1,）,pK,a,/,就是氨基酸,50%,解离（,碱, = ,酸,）时溶液的,pH,值，,K,a,/,就是此时溶液的,H,+,（,2,）当,HA50%,解离时，溶液的,pH,值等于,pKa/,（,3,）,pH = pKa/,时，,碱, = ,酸,（,50%,解离 ）,pH pKa/,时，,碱, ,酸,（,50%,解离）,pH ,碱,（,50%,解离）,2022/10/1141五、 氨基酸的酸碱性质1、氨基酸在,2024/10/1,42,甘氨酸的滴定曲线（解离曲线）,2022/10/1142甘氨酸的滴定曲线（解离曲线）,2024/10/1,43,起点：,100% G,+,净电荷：,+1,第一拐点：,50%G,+,，,50%G,平均净电荷：,+0.5,pH=pK,1,+lgG,/G,+, = pK,1,= 2.34,第二拐点：,0%G,净电荷：,0,等电点,pI=5.97,第三拐点,：,50%G,，,50%G,-,平均净电荷：,-0.5,pH=pK,2,+lgG,-,/G,=pK,2,=9.6,终点：,100% G,-,净电荷：,-1,在,pH2.34,和,pH9.60,处，,Gly,具有缓冲能力。,2022/10/1143起点： 100,2024/10/1,44,2022/10/1144,2024/10/1,45,Gly,等电点的计算,2022/10/1145Gly等电点的计算,2024/10/1,46,2,2,),3,(,),3,(,),(,R,NH,NH,COOH,pK,pK,pI,pK,pK,pI,+,=,+,=,-,-,-,a,2,),(,R,COOH,pK,pK,pI,+,=,-,a,a,a,中性氨基酸,碱性氨基酸,酸性氨基酸,氨基酸等电点的计算,2022/10/114622)3()3()(RNHNHCOO,2024/10/1,47, pH pI,时，,-COOH,解离成,-COO,-,，氨基酸带负电荷，在电场作用下向正极移动。, pH = pI,时，氨基酸净电荷为零，在电场中不移动,2022/10/1147 pH pI时， -NH2解离,2024/10/1,48,六、 氨基酸的化学性质,+ HNO,2,+ N,2,收集反应放出的氮气，可用来测定氨基酸的含量，这种测定氨基酸含量的方法称为,范斯莱克（,Van slyke,）,氨基测定法。,1,、与亚硝酸反应,（一）,-NH,2,参加的反应,2022/10/1148六、 氨基酸的化学性质+ HNO2,2024/10/1,49,苄氧甲酰氯（,carbobenzyloxychloride,Cbz-Cl),叔丁氧甲酰氯,对,-,甲苯磺酰氯,邻苯二甲酸酐,2,、与酰化试剂反应,氨基酸的氨基与酰氯或酸酐在弱碱溶液中发生作用时，氨基即被酰基化。,酰化试剂,酰化试剂,在,多肽的人工合成中被用作氨基保护剂。,P136,2022/10/1149 苄氧甲酰氯（carbobe,2024/10/1,50,（,DNS,-,氨基酸 ，黄色荧光）,丹磺酰氯（,DNS-Cl,，,5,二甲基氨基萘,-1-,磺酰氯）,常用于多肽链,NH,2,末端氨基酸的标记和微量氨基酸的定量测定。,2022/10/1150（ DNS-氨基酸 ，黄色荧光）丹,2024/10/1,51,Sanger,反应,（,2,，,4,一二硝基氟苯，,DNFB,）,DNP-,氨基酸被,Sanger,用来测定多肽的,NH,2,末端氨基酸,3,、 烃基化反应,（弱碱）,（黄色）,氨基酸氨基的一个,H,原子可被烃基（包括环烃及其衍生物）取代。,2022/10/1151Sanger 反应（2，4一二硝,2024/10/1,52,苯异硫氰酸酯，,PITC,苯氨基硫甲酰衍生物（,PTC-,多肽）,苯乙内酰硫脲衍生物（,PTH-,氨基酸），无色，可以用层析法分离鉴定。,被,Edman,用来鉴定多肽的,NH,2,末端氨基酸,（弱碱）,（,CH,3,NO,2,/H,+,）,Edman,反应,2022/10/1152苯异硫氰酸酯，PITC （弱碱）（C,2024/10/1,53,甲醛,甲醛,西佛碱是某些酶促反应的中间产物（如转氨基反应的中间产物）。,4,、生成西佛碱的反应（,Schiff,）,氨基酸的,-,氨基能与醛类化合物反应生成弱碱（,Schiffs base,）,2022/10/1153甲醛甲醛西佛碱是某些酶促反应的中间产,2024/10/1,54,5,、脱氨基反应,氨基酸在生物体内经氨基酸氧化酶催化即脱去,-,氨基而转变成酮酸。,C,H,3,C,COOH,O,氨基酸氧化酶,2022/10/11545、脱氨基反应 氨基酸在生物体,2024/10/1,55,（二）,-,羧基参加的反应,1,、成盐、成酯反应,可以屏蔽羧基活化氨基,R,CH,COOH,NH,2,+,C,2,H,5,OH,干燥，,HCl,回流,R,CH,COOC,2,O,5,NH,3,Cl,-,+,+,H,2,O,成酯反应,R,CH,COOH,NH,2,+,NaOH,R,CH,COONa,NH,2,+,H,2,O,2022/10/1155（二）-羧基参加的反应1、成盐、成,2024/10/1,56,氨基被保护后，羧基可与二氯亚砜或五氯化磷反应，生成酰氯， 使羧基活化，在多肽的人工合成中常用。,2,、成酰氯的反应,HN-,保护基,R-CH-COO,H,+,PCl,5,HN-,保护基,R-CH-COO,Cl,+,POCl,3,+,HCl,2022/10/1156 氨基被保护后，羧基可,2024/10/1,57,3,、叠氮反应,活化羧基，可用于肽的人工合成。,YNH O,R-CH-C-OCH,3,酰化氨基酸甲酯,（,Y=,酰基）,YNH O,R-CH-C-NHNH,2,酰化氨基酸酰肼,NH,2,NH,2,YNH O,R-CH-C-N-N=N,+,H,2,O,酰化氨基酸叠氮,2022/10/11573、叠氮反应活化羧基，可用于肽的人工,2024/10/1,58,将,-,氨基酸加热时，可脱去,CO,2,得到胺。,Ba(OH),2,尸胺,4,、脱羧基反应,2022/10/1158将-氨基酸加热时，可脱去CO2得到,2024/10/1,59,茚三酮在弱酸中与,-,氨基酸共热，引起氨基酸的氧化脱氨，脱羧反应，最后，茚三酮与反应产物,氨和还原茚三酮反应，生成,紫色物质,（,max=570nm,）。,（三）,-NH,2,和,-COOH,共同参加的反应,1,、与茚三酮反应,2022/10/1159 茚三酮在弱酸中与-,+,+ NH,3,CO,2,RCHO,H,+,+,+,C,C,C,OH,O,C,C,C,O,O,N,蓝紫色复合物,Pro,、,Hy-Pro,与直接形成,黄色化合物（,max=440nm,）,茚三酮,还原茚三酮,还原茚三酮,茚三酮,（,max=570nm,）,+ NH3+CCCOHOCCCOON蓝紫色复合物Pro、,2024/10/1,61,2,、成肽反应,一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基可以缩合成肽，形成的键称肽键。,肽键,2022/10/11612、成肽反应 一个氨基,2024/10/1,62,（四） 侧链,R,基参加的反应,用于蛋白质的化学修饰,略,2022/10/1162（四） 侧链R基参加的反应略,2024/10/1,63,（一）基于电荷性质差异的分离方法,七、 氨基酸的分离和分析,Glu,、,Leu,、,His,、,Lys,，,4,种混合样，在,pH6.0,时，泳动方向,1,、电泳分离,电泳的基本原理,Glu Leu His Lys,pI,3.22 5.98 7.59 9.74,+,-,2022/10/1163（一）基于电荷性质差异的分离方法七、,2024/10/1,64,2,、 离子交换柱层析,磺酸型阳离子交换树脂,氨基酸与树脂上解离基团之间的静电引力,氨基酸与树脂基质聚苯乙烯之间的疏水作用,NH,3,-CH-COOH,R,+,2022/10/11642、 离子交换柱层析磺酸型阳离子,2024/10/1,65,2022/10/1165,2024/10/1,66,2022/10/1166,2024/10/1,67,1,、 纸层析,流动相：丁醇、醋酸、水,基本步骤：,点样、展层、现色、定性（定量）,（二）基于分配系数（极性）差异的分离方法,分配层析,分配系数：在流动相中分配系数越大，移动越快。,固定相：吸附的水,逆流分溶原理,2022/10/11671、 纸层析流动相：丁醇、醋酸、水,2024/10/1,68,2,、薄层层析,基本步骤：铺板、点样、展层、现色、定性（定量）,支持剂：纤维素粉、 硅胶、 氧化铝粉,2022/10/11682、薄层层析基本步骤：铺板、点样、,2024/10/1,69,3,、分配柱层析,支持剂：纤维素、淀粉、硅胶,固定相：吸附水,流动相；苯酚、正丁醇,2022/10/11693、分配柱层析支持剂：纤维素、淀粉、,2024/10/1,70,固定相：涂有薄层液体的惰性颗粒,流动相：,H,2,、,N,2,、,CO,2,前提：样品能汽化、热稳定,（三）气液层析（气相层析、气相色谱）,2022/10/1170固定相：涂有薄层液体的惰性颗粒（三）,2024/10/1,71,分配层析,离子交换层析,吸附层析,凝胶过滤层析,（四）高效液相层析（,HPLC,）,2022/10/1171分配层析（四）高效液相层析（HPLC,2024/10/1,72,第三节 蛋白质的一级结构 （共价结构）,蛋白质结构层次,2022/10/1172第三节 蛋白质的一级结构,2024/10/1,73,蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序,(,含二硫键,),一级结构（共价结构）,二级结构,多肽主链中各个肽段借助于相邻氨基酸之间的氢键形成的构象。主要有,-,螺旋、,折叠、,-,转角、无规卷曲。,超二级结构,由两个以上二级结构单元相互聚集形成的有规则的二级结构的组合体如,、,、,。,2022/10/1173蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序(含,2024/10/1,74,2022/10/1174,2024/10/1,75,2022/10/1175,2024/10/1,76,2022/10/1176,2024/10/1,77,2022/10/1177,2024/10/1,78,大的球蛋白分子中，多肽链形成几个紧密的球状构象，彼此以松散的肽链相连，此球状构象是结构域，结构域是多肽链的独立折叠单位，一般由,100-200,个氨基酸残基构成。,结构域,2022/10/1178 大的球蛋白分,2024/10/1,79,单链蛋白质只有一、二、三级结构，无四级结构。,三级结构,整条多肽链或亚基通过盘旋、折叠，形成紧密的、借各种次级键维持的球状构象。,四级结构,寡聚蛋白中亚基种类、数目、空间排布及亚基间相互作用力。,2022/10/1179单链蛋白质只有一、二、三级结构，无四,2024/10/1,80,2022/10/1180,2024/10/1,81,2022/10/1181,2024/10/1,82,酰胺平面，肽单位间以,-C,原子相隔，构成肽链。,一、肽和肽键的结构,肽,一个氨基酸的羧基和另一个氨基酸的氨基脱水缩合而成的化合物。其中的氨基酸单位称氨基酸残基。,肽键,氨基酸间脱水后形成的共价键称,肽键,（,酰氨键,）。,肽单位,2022/10/1182酰胺平面，肽单位间以-C原子相隔，,2024/10/1,83,五 肽,名称：丝氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸,写法： ,Ser-Gly-Try-Ala-Leu,或,，,2022/10/1183五 肽,2024/10/1,84,肽键具有部分双键性质，不能自由旋转。,肽键具有平面性，组成肽键的,4,个原子和,2,个,C,几乎处在同一平面内（酰氨平面）。,肽键亚氨基在,pH0-14,内不解离。,肽键的结构特点,2022/10/1184肽键具有部分双键性质，不能自由旋转。,2024/10/1,85,多肽链可以看成由,C,串联起来的无数个酰胺平面组成,2022/10/1185多肽链可以看成由C串联起来的无数,2024/10/1,86,短肽在晶体和水溶液中也是以偶极离子形式存在。,肽的酸碱性质主要取决于端,和端,COOH,以及侧链上可解离的基团。,在长肽或蛋白质中，可解离的基团主要是,侧链基团,。,二、肽的重要性质,1,、旋光性,一般短肽的旋光度等于其各个氨基酸的旋光度的总和。,2,、 肽的酸碱性质,2022/10/1186 短肽在晶体和水溶液中也是,2024/10/1,87,双缩脲反应是肽和蛋白质特有的反应，游离氨基酸无此反应。,3,、肽的化学反应,肽的,-,羧基，,-,氨基和侧链,R,基上的活性基团都能发生与游离氨基酸相似的反应。,双缩脲反应,凡是有肽键结构的化合物都会发生双缩脲反应，可用于定量分析。,H,2,N-CO-NH-CO-NH,2,双缩脲,CuSO,4,-NaOH,紫红色化合物,2022/10/1187双缩脲反应是肽和蛋白质特有的反应，游,2024/10/1,88,红细胞中的巯基缓冲剂。,参与氧化还原过程，清除内源性过氧化物和自由基，维护蛋白质活性中心的巯基处于还原状态。,三、天然存在的活性肽,1,、谷胱甘肽,GluCysGly,2022/10/1188 红细,2024/10/1,89,由短杆菌产生的,10,肽环。抗革兰氏阳性细菌，临床用于治疗化浓性病症。,2,、 短杆菌肽（抗生素）,2022/10/1189 由短杆菌产生的10肽环,2024/10/1,90,合成蛋白质的剪切、修饰, 酶专一性逐步合成（如谷胱甘肽）、, 动物肠道可吸收寡肽,3,、 脑啡肽（,5,肽）,Met-,脑啡肽：,TyrGlyGlyPhe,Met,Leu-,脑啡肽：,TyrGlyGlyPhe,Leu,具有镇痛作用。,生物体内寡肽的来源,2022/10/1190 合成蛋白质的剪切、修饰3、,2024/10/1,91,4,、肽类激素,2022/10/11914、肽类激素,2024/10/1,92,四、蛋白质一级结构测定,（一） 蛋白质测序的基本策略,对于一个纯蛋白质，理想方法是从,N,端直接测至,C,端，但目前只能测,60,个,N,端氨基酸。,1,、直接法（测蛋白质的序列）,2,、间接法（测核酸序列推断氨基酸序列）,2022/10/1192四、蛋白质一级结构测定（一） 蛋白质,2024/10/1,93,（,1,）,测定蛋白质分子中多肽链的数目,（,2,）,拆分蛋白质分子中的多肽链。,（,3,）,断裂链内二硫键。,（,4,） 分析多肽链的,N,末端和,C,末端。,（,5,）,测定多肽链的氨基酸组成。,（,6,）,多肽链部分裂解成肽段。,（,7,）,测定各个肽段的氨基酸顺序,（,8,）,确定肽段在多肽链中的顺序。,（,9,）,确定多肽链中二硫键的位置。,（二）蛋白质测序的一般步骤,2022/10/1193（1） 测定蛋白质分子中多肽链,2024/10/1,94,估算氨基酸残基数，确定肽链数,方法：,SDS-PAGE,凝胶过滤法,沉降系数法,（三） 测序前的准备工作,1,、 蛋白质的纯度鉴定,要求：,纯度,97%,以上，均一。,鉴定方法：,聚丙烯酰胺凝胶电泳,(PAGE),要求一条带。,DNS,Cl,（二甲氨基萘磺酰氯）法测,N,端氨基酸。,2,、测定蛋白质的分子量,2022/10/1194估算氨基酸残基数，确定肽链数 （,2024/10/1,95,酸水解的同时辅以碱水解。,确定肽链中各种氨基酸出现的频率,便于选择裂解方法及试剂。,3,、 确定亚基种类及数目,根据分子量和,N,末端数,4,、拆分多肽链，分别分离纯化,非共价键结合：,8mol/L,尿素，,SDS-PAGE,二硫键结合：,过甲酸氧化：,S,S,+ HCOOOH SO,3,H,巯基乙醇还原,5,、 测定氨基酸组成,2022/10/1195酸水解的同时辅以碱水解。3、 确,2024/10/1,96,6,、端基分析,N,端分析,DNS-Cl,法,最常用，黄色荧光，灵敏度极高，,DNS-,多肽水解后的,DNS-,氨基酸不需要提取。,DNFB,法,Sanger,试剂，,DNP-,多肽，酸水解，黄色,DNP-,氨基酸，有机溶剂（乙酸乙酯）抽提分离，纸层析、薄层层析、液相等, PITC,法,Edman,法，逐步切下。无色,PTH-,氨基酸，有机溶剂抽提，层析,2022/10/11966、端基分析N端分析DNS-Cl法,2024/10/1,97,无水肼,NH,2,NH,2,100 5-10h,。,苯甲醛沉淀氨基酸的酰肼，,C,端游离氨基酸留在上清中。,Gln,、,Asn,、,Cys,、,Arg,不能用此法。,C,端分析,肼解法,2022/10/1197无水肼NH2NH2 100 5,2024/10/1,98,羧肽酶,A,：,除,Pro,、,Arg,、,Lys,外的所有,C,端氨基酸,羧肽酶,B,：,只水解,Arg,、,Lys,羧肽酶法测,C,末端,羧肽酶法,（,Pro,不能测）,2022/10/1198羧肽酶A：羧肽酶法测C末端羧肽酶法,2024/10/1,99,溴化氰,Met,X,产率,85%,亚碘酰基苯甲酸,Trp,X,产率,70-100%,NTCB,（,2-,硝基,-5-,硫氰苯甲酸）,X,Cys,羟胺,NH,2,OH,Asn,Gly,约,150,个氨基酸出现一次,（四） 肽链的部分裂解和肽段的分离纯化,1,、化学裂解法,2022/10/1199 溴化氰 （四） 肽链,2024/10/1,100,胰蛋白酶,LysX (X Pro),Arg X,胰凝乳蛋白酶,TyrX (X Pro),TrpX PheX,胃蛋白酶,Phe(Trp,、,Try,、,Leu)Phe(Trp,、,Try,、,Leu),Glu,蛋白酶,GluX,（,V,s,蛋白酶）,Arg,蛋白酶,ArgX,Lys,蛋白酶,XLys,Pro,蛋白酶,ProX,2,、酶法裂解,2022/10/11100胰蛋白酶 Lys,2024/10/1,101,电泳法,根据分子量大小分离, 离子交换层析法,（,DEAE,Cellulose,、,DEAE,Sephadex,）,根据肽段的电荷特性分离, 反相法,根据肽段的极性分离,凝胶过滤,根据肽段的大小分离,3,、肽段的分离纯化,要求： 单带,单峰,端单一（常用,C l,法）,2022/10/11101 电泳法 ,2024/10/1,102,（,1,）耦联,PITC,H,N,A-B-C-D,pH8,9,，,40,PTC,A-B-C-D,（,2,）裂解 无水三氟乙酸（,TFA,）,ATZ,A + H,2,N,B-C-D,（,3,）转化,PTH,A,PTC,肽：苯氨基硫甲酰肽,ATZ,：噻唑啉酮苯胺（一氨基酸）,PTH,：苯乙内酰硫脲（一氨基酸）,（五） 肽段序列测定及肽链的拼接,1,、,Edman,法,2022/10/11102（1）耦联 PI,2024/10/1,103,荧光基,-,团或有色试剂标记的,PITC,试剂。,4-N,、,N-,二甲基氨基偶氮苯,-4,异硫氰酸酯。,2,、,DNS-Edman,法,用,DNS,法测,N,末端，用,Edman,法提供（,n-1,）肽段。,3,、有色,Edman,法,2022/10/11103荧光基-团或有色试剂标记的PITC,2024/10/1,104,仪器原理：,Edman,法。,1967,液相测序仪,自旋反应器，适于大肽段。,1971,固相测序仪,表面接有丙氨基的微孔玻璃球，可耦连肽段的端。,1981,气相测序仪,用,Polybrene,反应器。 （聚阳离子）四级铵盐聚合物,液相：,5nmol 20-40,肽,97%,气相：,5pmol 60,肽,98%,4,、用自动序列分析仪测序,2022/10/11104仪器原理：Edman法。4、用自动,2024/10/1,105,16,肽，端,H,端,法裂解：,ONS PS EOVE RLA HOWT,法裂解：,SEO WTON VERL APS HO,重叠法确定序列：,HOWTONSEOVER LAPS,5,、肽段拼接成肽链,2022/10/1110516肽，端H 端5、肽,2024/10/1,106,2022/10/11106,2024/10/1,107,2022/10/11107,2024/10/1,108,碘乙酰胺封闭,-SH,胃蛋白酶酶解蛋白质,第一向电泳,过甲酸氧化,S,S,生成,-SO,3,H,第二向电泳,分离出含二硫键的两条短肽，测序,与拼接出的肽链比较，定出二硫键的位置。,（六）二硫键、酰胺及其他修饰基团的确定,1,、二硫键的确定（对角线电泳法）,方,法,2022/10/11108碘乙酰胺封闭-SH（六）二硫键、,2024/10/1,109,Asp Asn,、,Glu-Gln,酶解肽链，产生含单个,Asx,或,Glx,的肽，用电泳法确定是,Asp,还是,Asn,Leu-Glx-Pro-Val,肽,在,pH=6.0,时，电荷量是,Leu,+,Pro,0,Val,-,此肽除,Glx,外，净电荷为,0,，可根据此肽的电泳行为确定是,Glu,或是,Gln,。,2,、酰胺的确定,举例,2022/10/11109Asp Asn、Glu-Gln,2024/10/1,110,Lys(Arg)-Ser-Asn-Ser(PO,4,),Arg-Thr-Leu-Ser(PO,4,),Lys(Arg),Ala-Ser(PO,4,),3,、糖、脂、磷酸基位置的确定,糖 类,通过,Asn,、,Ser,与蛋白质连接，,-N-,糖苷,-0-,糖苷,脂 类,Ser,、,Thr,、,Cys,磷 酸,Ser,、,Thr,、,His,经验性序列,2022/10/11110Lys(Arg)-Ser-Asn-,2024/10/1,111,牛胰,RNase,变性一复性实验,五、蛋白质的一级结构与生物功能,（一） 蛋白质的一级结构决定高级结构和功能,用,(8M,尿素,+,硫基乙醇,),变性、失活,透析后构象恢复，活性恢复,95%,以上。,牛胰,RNase,共有,124,个氨基酸残基,4,个链内二硫键。,分子量：,12600,p181,2022/10/11111牛胰RNase变性一复性实验五、,2024/10/1,112,2022/10/11112,2024/10/1,113,血红蛋白在不同的脊椎动物中都具有输送氧气的功能,细胞色素在所有的生物中都是电子传递链的组分。,（二） 同源蛋白质一级结构的种属差异与生物进化,同源蛋白质,在不同的生物体内行使相同或相似功能的蛋白质。,例,2022/10/11113血红蛋白在不同的脊椎动物中都具有输,2024/10/1,114,同源蛋白质的氨基酸序列具有明显的相似性（序列同源性）,有许多位置的氨基酸对所有种属来说都是相同的，称不变残基，不变残基高度保守，是必需的。,除不变残基以外，其它位置的氨基酸对不同的种属有很大变化，称可变残基，可变残基中，个别氨基酸的变化不影响蛋白质的功能。,多肽链长度相同或相近,同源蛋白质的特点,2022/10/11114同源蛋白质的氨基酸序列具有明显的,2024/10/1,115,亲源关系越远，同源蛋白的氨基酸顺序差异就越大。,通过比较同源蛋白质的氨基酸序列的差异可以研究不同物种间的亲源关系和进化。,2022/10/11115亲源关系越远，同源蛋白的氨基酸顺序,2024/10/1,116,分子量：,12,500,左右,氨基酸残基：,100,个左右，单链。,25,种生物中，细胞色素,C,的不变残基,35,个。,60,种生物中，细胞色素,C,的不变残基,27,个。,亲源关系越近的，其细胞色素,C,的差异越小。,亲源关系越远的，其细胞色素,C,的差异越大。,人与黑猩猩,0,人与猴,1,人与狗,10,人与酵母,44,1,、细胞色素,C,2022/10/11116分子量：12,500左右1、细胞色,2024/10/1,117,有,24,个氨基酸残基位置始终不变：,A,B,链上,6,个,Cys,不变，其余,18,个氨基酸多数为非极性侧链，对稳定蛋白质的空间结构起重要作用。,其它可变氨基酸对稳定蛋白质的空间结构作用不大，但对免疫反应起作用。,猪与人接近，而狗则与人不同，因此可用猪的胰岛素治疗人的糖尿病。,2,、胰岛素,2022/10/11117有24个氨基酸残基位置始终不变：,2024/10/1,118,2022/10/11118,2024/10/1,119,镰刀形红细胞贫血现是由于血红蛋白发生了遗传突变引起的,链第,6,位的,aa,线基由正常的,Glu,变成了疏水性的,Val,。,正常人血红蛋白,.N.Glu 6,镰刀型贫血,.N.Val 6,生理条件下电荷：,Glu,-,Va1,0,亲水 疏水,（三） 蛋白质一级结构的突变,-,分子病,分子病,基因突变引起的某个功能蛋白的某一个或几个氨基酸残基发生了遗传性替代从而导致整个分子的三维结构发生改变，功能部分或全部丧失。,例,2022/10/11119 镰刀形红细胞,2024/10/1,120,2022/10/11120,2024/10/1,121,2022/10/11121,2024/10/1,122,（四） 一级结构的部分切除与蛋白质的激活,1,、 血液凝固的机理,凝血因子（凝血酶原致活因子）,凝血酶原,凝血酶,血纤维蛋白原,血纤维蛋白,血纤维蛋白凝块,2022/10/11122（四） 一级结构的部分切除与蛋白质,2024/10/1,123,（,1,）凝血酶原,在凝血酶原致活因子催化下，凝血酶原分子中的,Arg274,Thr275,、,Arg323,Ile324,断裂，产生活性凝血酶。,A,链,49,氨基酸,B,链,259,氨基酸,2022/10/11123（1）凝血酶原在凝血酶原致活因子催,2024/10/1,124,（,2,） 血纤维蛋白原,从二条,链和二条,链的,N,端各断裂一个特定的肽键,-Arg,Gly-,，释放出二个纤维肽,A,（,19,个氨基酸）和二个纤维肽,B,（,21,个氨基酸），它们含有较多的酸性氨基酸残基。,2022/10/11124（2） 血纤维蛋白原从二条链和,2024/10/1,125,A,、,B,肽切除后，减少了蛋白质分子的负电荷，促进分子间聚集，形成网状结构。,在凝血因子,XIIIa,（纤维蛋白稳定因子）催化下，纤维蛋白质单体间形成共价健（,Gln-Lys,结合），生成交联的纤维蛋白。,2022/10/11125A、B肽切除后，减少了蛋白质分子的,2024/10/1,126,2,、胰岛素原的激活,前胰岛素原（含信号肽）,胰岛素原,活性胰岛素,（在内质网上信号肽被信号肽酶切除）,（在高尔基体上切除,C,肽）,2022/10/111262、胰岛素原的激活前胰岛素原（含信,2024/10/1,127,胰岛素原,活性胰岛素,2022/10/11127胰岛素原活性胰岛素,2024/10/1,128,2022/10/11128,2024/10/1,129,从理论上讲，一个多肽主链能有无限多种构象。,但是，只有一种或很少几种天然构象，且相当稳定。,因为：天然蛋白质主链上的单键并不能自由旋转。,第四节,蛋白质的二级结构和纤维状蛋白质,一、多肽主链折叠的空间限制,2022/10/11129从理论上讲，一个多肽主链能有无限多,2024/10/1,130,1,、 肽链的二面角,环绕,C,N,键旋转的角度为,环绕,C,C,键旋转的角度称,只有,碳原子连接的两个键（,C,N,和,C-C,）是单键，能自由旋转。,2022/10/111301、 肽链的二面角环绕C,2024/10/1,131,从,C,沿键轴方向看，顺时针旋转的, (),角为正值，反之为负值。,当,(),旋转键两侧的主链呈顺式时，规定,() =0,2022/10/11131从C沿键轴方向看，顺时针旋转的,2024/10/1,132,和,同时为,0,的构象实际不存在,二面角（,、,）所决定的构象能否存在，主要取决于两个相邻肽单位中非键合原子间的接近有无阻碍。,C,上的,R,基的大小与带电性影响,和,2,、拉氏构象图：可允许的,和,值,拉氏构象图,Ramachandran,根据蛋白质中非键合原子间的最小接触距离，确定了哪些成对二面角（,、,）所规定的两个相邻肽单位的构象是允许的，哪些是不允许的，并且以,为横坐标，以,为纵坐标，在坐标图上标出，该坐标图称拉氏构象图。,p206,2022/10/11132和同时为0的构象实际不存在2、,2024/10/1,133,2022/10/11133,2024/10/1,134,实线封闭区域,一般允许区，非键合原子间的距离大于一般允许距离，此区域内任何二面角确定的构象都是允许的，且构象稳定。,虚线封闭区域,是最大允许区，非键合原子间的距离介于最小允许距离和一般允许距离之间，立体化学允许，但构象不够稳定。,虚线外区域,是不允许区，该区域内任何二面角确定的肽链构象，都是不允许的，此构象中非键合原子间距离小于最小允许距离，斥力大，构象极不稳定。,对非,Gly,氨基酸残基，一般允许区占全平面的,7.7%,，最大允许区占全平面,20.3,2022/10/11134实线封闭区域,2024/10/1,135,2022/10/11135,2024/10/1,136,The crystal structure of pyruvate kinase,2022/10/11136The crystal struc,2024/10/1,137,多肽主链按右手或左手方向盘绕，形成右手螺旋或左手螺旋，,相邻的螺圈之间形成链内氢键,构成螺旋的每个,C,都取相同的二面角,、,。,二、 二级结构的基本类型,1,、,螺旋,螺旋的一般特征,2022/10/11137多肽主链按右手或左手方向盘绕，形,2024/10/1,138,2022/10/11138,2024/10/1,139,2022/10/11139,2024/10/1,140,2022/10/11140,2024/10/1,141,二面角：,= -57, = - 48,，是一种右手螺旋, 每圈螺旋：,3.6,个,a.a,残基， 高度：,0.54nm,每个残基绕轴旋转,100,，沿轴上升,0.15nm,氨基酸残基侧链向外, 相邻螺圈之间形成链内氢链，氢键的取向几乎与中心轴平行。, 肽键上,C=O,氧与它后面（,C,端）第四个残基上的,N-H,氢间形成氢键。,典型的,螺旋有如下特征,2022/10/11141 二面角：= -57, =,2024/10/1,142,多肽链上连续出现带同种电荷基团的氨基酸 残基,(,如,Lys,，或,Asp,，或,Glu),，不能形成稳定