细菌的革兰氏染色

细菌的革兰氏染色,一、目的：,学习细菌的革兰氏染色法。,二、原 理,革兰氏染色法,：,是,1884,年由丹麦病理学家所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌,（,G,+,）,和革兰氏阴性菌,（,G,）,两大类，该染色法所以能将细菌分为,G,+,菌和,G,菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。,革兰阳性菌细胞壁的化学组成,肽聚糖（,15-50,层）,细胞膜（双层脂质 蛋白嵌镶）,脂质,蛋白质,-1,4,糖苷键,N-,乙酰葡萄糖胺,N-,乙酰胞壁酸,四肽链,五肽桥,革兰阴性菌细胞壁的化学组成,外膜,肽聚糖（,1-3,层）,细胞膜,脂质,蛋白质,脂质双层,脂蛋白,脂多糖,革兰阳性菌与革兰阴性菌细胞壁,区别要点 革兰阳性菌 革兰阴性菌,肽聚糖组成 聚糖骨架、四肽侧链、五肽交联桥 聚糖骨架、四肽侧链 肽聚糖层数 可多达,50,层 仅,1-2,层 肽聚糖含量 占细胞壁干重,50%-80%,占细胞壁干重,5%-10%,强度 较坚韧，三维立体结构 较疏松，二维平面结构 磷壁酸 有 无 外膜 无 有 青霉素、溶菌酶 敏感 不敏感,G,+,菌细胞壁较厚，肽聚糖含量较高，网格结构紧密，含脂量低，当被酒精脱色时，引起了细胞壁肽聚糖层网状结构的孔径缩小以至关闭，从而阻止了不溶性结晶紫,-,碘复合物的逸出，还是原来的颜色；,G,细菌的细胞壁肽聚糖层较薄，含量较少，而脂类含量高，当酒精脱色时，脂类物质溶解，细胞壁透性增大，结晶紫,-,碘复合物也随之被抽提出来，故,G,细菌细菌菌体呈复染液的红色。,1,2,3,4,？,结晶紫,碘液,酒精,复红,三、实验器材,1,、,活材料,：培养,24,小时的大肠杆菌和葡萄球菌。,2,、,染色液和试剂,：结晶紫、碘液、,95%,酒精、石炭酸复红 、蒸馏水、乙醚,-,乙醇混合液、香柏油。,3,、,器材,：废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜。,（1）,涂片,：取干净载玻片一块，在载玻片中央加一滴蒸馏水，按,无菌操作法,取大肠杆菌涂片，做成浓菌液，注意取菌不要太多。,（2）,晾干,：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。,（3）,固定,：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）。,四、实验方法：,（,4,）,结晶紫染色,：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色,1,分钟,；水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。,（,5,）,媒染,：碘液，媒染,1min,；,水洗：用水洗去碘液。,（,6,）,脱色,：将玻片倾斜，连续滴加,95%,乙醇脱色,20,25s,至流出液无色，立即水洗。,（,7,）,复染,：滴加复红复染,3-5min,；,水洗：用水洗去涂片上的复红染色液。,（,8,）,晾干,：将染好的涂片用吸水纸吸干。,（,9,）,镜检,：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。,革兰氏阴性杆菌,革兰氏阳性杆菌,（,10),实验完毕后的处理：,将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净，,a.,先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。,b.,用擦镜纸沾少许,乙醚,-,乙醇混合液（二甲苯）,将镜头擦,2-3,次。,c.,再用干净的擦镜纸将镜头擦,2-3,次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。将显微镜小心轻拿，按号放入显微镜柜中。,观察后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净，放入回收容器内。,五、注意事项,1,.,革兰氏染色成败的关键是,酒精脱色,。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。,2.,染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后（冲反面），应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。,欢迎批评指正！,谢谢！,