仪器分析 __高效液相色谱分析法

单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,生物与化学工程学院,仪器分析,第四章 高效液相色谱分析法,第一节 高效液相色谱仪,第二节 主要分离类型,第三节 液相色谱的固定相与流动相,第四节 影响分离的因素与分离类型的选择,第一节 高效液相色谱仪,美国安捷伦公司,Agilent 1200,第一节 高效液相色谱仪,美国戴安公司,UltiMate3000,第一节 高效液相色谱仪,一、 高效液相色谱仪结构流程,二、,高压输液系统,三、,梯度淋洗装置,六、,液相色谱检测器,五、,分离系统,四、,进样系统,第一节 高效液相色谱仪,储液瓶,高压泵,进样器,色谱柱,检测器,废液,一、 高效液相色谱仪结构流程,高压输液泵、高效分离住、高灵敏度检测器,第一节 高效液相色谱仪,二、,高压输液系统（高压泵）,要求：,输出压力高；,平稳、脉冲小；,流量稳定可调；,耐腐蚀。,机械往复柱塞泵结构图,第一节 高效液相色谱仪,三、,梯度淋洗装置,在液相色谱中,可以通过改变流动相的组成、极性来改善分离和调节出峰时间。,第一节 高效液相色谱仪,两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定比例送入混合器，混合后进入色谱柱。,一台高压泵, 通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入混合器中混合。,高压梯度,(,外梯度,),低压梯度,(,内梯度,),第一节 高效液相色谱仪,通过改变流动相的组成来调整组分的,k,值，改变分离因子,值，以达到最短时间内得到最佳分离的目的。,梯度洗脱,梯度洗脱的特点,改善分离,加快分析速度；,改善峰形,减少拖尾,;,可能引起,基线漂移。,第一节 高效液相色谱仪,四、,进样系统,六通阀进样,装置,第一节 高效液相色谱仪,内径：,1,6 mm,，,柱长：,5,50 cm,；,柱填料粒径：,5,10m,为保护色谱柱，,通常在柱前加一支填料与色谱柱相同的保护柱。,五、,分离系统（色谱柱）,第一节 高效液相色谱仪,六、,液相色谱检测器,类型,紫外检测器,示差折光检测器,荧光检测器,电化学检测器,电导检测器,第一节 高效液相色谱仪,（一）、紫外检测器,应用最广泛的检测器,基本原理：,试样组分对特定波长的紫外光具有选择性的吸收，吸光度与试样组分浓度之间的定量关系符合郎伯,-,比耳定律。,优点：,灵敏度高，线形范围宽；,死体积小；,波长可选；,对流速和温度变化不 敏感；,可用于梯度洗脱。,缺点：,无紫外,-,可见吸收组分不响应；,流动相选择受一定限制。,第一节 高效液相色谱仪,一些常用溶剂的紫外截止波长,溶剂,二硫化碳,氯仿,四氢,呋喃,苯,乙睛,甲醇,水,紫外截止波长,/nm,380,245,212,210,190,205,187,第一节 高效液相色谱仪,(a),可变波长紫外检测器,(b),二极管阵列检测器,第一节 高效液相色谱仪,两种检测器的色谱图,(a),：,可变波长紫外检测器；,(b),：,二极管阵列检测器,峰纯度检验,第一节 高效液相色谱仪,（二）、示差折光检测器,通用型检测器,基本原理：,连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光系数差值，该值与试样池流动相中的组分浓度成正比。,每种物质具有不同的折光指数,。,生命科学中各类糖类化合物，没有紫外吸收，一般要用示差折光检测器。,第一节 高效液相色谱仪,缺点：,灵敏度低；,对温度敏感；,不能用于梯度洗脱。,第一节 高效液相色谱仪,（三）、荧光检测器,专用型检测器,基本原理：,在一定的条件下，荧光强度与流动相中的组分的浓度成之比。,对多环芳,烃，维生素,B,、,黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。,第一节 高效液相色谱仪,特点：,高灵敏度；,高选择性；,可用于梯度洗脱。,第二节 主要分离类型,一、液,-,固吸附色谱,二、液,-,液分配与化学键合相色谱,三、离子交换色谱,四、离子对色谱,五、空间排阻色谱,六、亲和色谱,第二节 主要分离类型,一、液,-,固吸附色谱,流动相,：,各种不同极性的一元或多元溶剂。,固定相,：,固体吸附剂，如硅胶、氧化铝等。,颗粒度较小，,5-10,m,分离机理：,流动相中的溶质分子,(X),与溶剂分子,(S),在固体吸附剂上竞争吸附的结果。,第二节 主要分离类型,下标,M,、,s,分别代表流动相和固定相，,n,代表被吸附的溶剂分子数；,K,代表吸附平衡常数。,吸附平衡常数,K,不等于分配系数。,K,值越大，保留时间越长，分配系数大。,适用对象：,相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性。,第二节 主要分离类型,二、液,-,液分配与化学键合相色谱,（一）、液,-,液分配色谱,固定相与流动相均为液体（互不相溶）。,基本原理,：组分在固定相和流动相上的分配。,与气相色谱中气,-,液色谱比较？,改变流动相的组成来 改善分离效果。,K,不仅与固定相的种类有关，也与流动相的种类有关。,第二节 主要分离类型,固定相极性,流动相极性,正相分配色谱,（正相柱）,组分极性越大，保留时间越长；使用极性化合物的分离。,反相分配色谱,（反相柱）,固定相极性,流动相极性,组分极性越小，保留时间越长；适用非极性化合物的分离。,第二节 主要分离类型,（二）、化学键合固定相色谱,固定相非常稳定，在使用中不易流失。由于可将各种极性的官能团键合到载体表面，因此它适用于种类繁多样品的分离。,特点,将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。,第二节 主要分离类型,1.,键合固定相制备,ODS(C,18,),键合相,硅胶,十八烷基氯硅烷,非极性,硅烷化反应,使用,pH,范围：,2-8,第二节 主要分离类型,2.,键合固定相类型,类型,反相柱,正相柱,氨丙基,氰乙基、醚和醇等,极性基团,不同碳原子数的,烷烃（,C8,和,C18,）、,苯基等疏水基团,第二节 主要分离类型,保留时间：,例：以,ODS,键合色谱柱、甲醇,-,水为流动相分离以下两种苯甲酸，试判断出峰次序。,没食子酸,3,4-,二羟基苯甲酸,固定相,:,非极性,;,流动相,:,极性,组分极性,:,3,4-,二羟基苯甲酸, 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小),常用溶剂的极性顺序,第三节 液相色谱的固定相与流动相,1,、,尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。,选择流动相时应注意的问题,2,、避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。,第三节 液相色谱的固定相与流动相,3,、试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。,4,、流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。,第四节 影响分离的因素与分离类型选择,一、影响分离的因素,二、分离类型的选择,第四节 影响分离的因素与分离类型选择,一、影响分离的因素,速率方程,溶质在液相流动相中的扩散系数，约为气相中扩散系数的万分之一,第四节 影响分离的因素与分离类型选择,修正的速率方程：,A.,降低颗粒度大小，填充均匀；,B.,减小液膜厚度；,C.,选择粘度小的溶剂；,D.,选择较低的流动相流速。,提高柱效途径,第四节 影响分离的因素与分离类型选择,二、分离类型的选择,根据分析目的、试样性质、化合物的结构,气相色谱与高效液相色谱的比较,气相色谱,高效液相色谱,1.,只能分析挥发性物质，只能分析,20%,的化合物,2.,不能用于热不稳定物质的分析,3.,用毛细管色谱可得到很高的柱效,4.,有很灵敏的检测器如,ECD,和较灵敏的通用检测器（,FID,和,TCD,）,5.,流动相为气体，无毒，易于处理,6.,运行和操作容易,7.,仪器制造难度较小,1.,几乎可以分析各种物质,2.,用于热不稳定物质的分析,3.,色谱柱较短，柱效较低,4.,没有较高灵敏通用检测器,5.,流动相有毒，费用较高,6.,运行和操作比,GC,难一些,7.,仪器制造难度大,