胡继红 下呼吸道感染细菌培养操作规范 花脸稿解读

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,胡继红 下呼吸道感染细菌培养操作规范 花脸稿解读,大多数微生物室：,40,-60%/,日,标本是否合格,？,定植菌？致病菌？,生长不同种类细菌如何,报告？,生长不同数量细菌取舍？,前后两天培养结果,培养结果与临床诊断,标本最多,判断难,报告难,不符合,草绿色链球菌、奈瑟菌属,嗜血杆菌属、莫拉菌属,常见引起细菌性社区感染,典型肺炎,病原菌：,上呼吸道正常菌群,肺炎链球菌,流感嗜血,杆菌, 金黄色葡萄球, 卡他莫拉菌,肺炎支原体,肺炎,/鹦鹉热衣原体,嗜,肺军团菌,柯克斯体（,Q热）,痰的来源？,是否被上呼吸道污染？,细胞内病原引起,非典型肺炎,：,卫生部临床检验中心,陕西省人民医院,安徽省立医院,卫生部北京医院,北京大学人民医院,中国医学科学院北京协和医院,首都医科大学附属北京友谊医院,解放军总医院,浙江省温州医科大学附属第二医院,胡继红,任健康,马筱玲,胡云建,王辉,徐英春,苏建荣,罗燕萍,李向阳,1 美国微生物学会:临床微生物学操作手册（第3版）.2007.,（,Clinical Microbiology Procedures Handbook,）,2 美国微生物学会:下呼吸道感染临床微生物学检验技术及操作系列丛书.2004,3 叶应妩,等,.,全国临床检验操作规程,(,第,3,版,). 2006,4,美国微生物学会:临床微生物学手册(第10版).,20,11,5,美国微生物学会:临床微生物学手册(第9版).2006,variability in the microbiological evaluation of expectorated sputa and endotracheal,aspirates. J. Clin. Microbiol.39:2344-2347.,7 Roson,B.,J.Carratala,R.verdaguer,J.Dorca,F.Manresa,and F.Gudiol.2000.Prospective study of,sputum Gram stain in the initial approach to community-acquired pneumonia requiring,hospitalization.Clin.Infec.Dis.31:869-874.,8 Gleckman,R.,J.DeVita,D.Hibert,C.Pelletier,and R.Martin.1988.Sputum gram stain assessment,in community-acquired bacteremic pneumonia.J.Clin.Microbiol.26:846-849.,应用范围,：针对医疗机构微生物实验室；,检验项目,：常规细菌培养检测下呼吸道感染病原菌；,操作流程,：按分析前、分析中和分析后的顺序书写；,引言,：是全篇的背景知识；,三个“规范性附录”：,结果报告的重要依据。,内容,定性培养,痰,/气管吸出物；,定量培养,支气管纤维镜采集标本；,快速排除和鉴别,重要致病菌的方法；,QC,培养基和试剂的质量控制；,细菌培养报告,需结合革兰染色涂片结果；,报告的临床意义和格式内容。,（,1,）,明确：下呼吸道标本,适合诊断的病原和检验项目,；,（ 2 ）规定：细菌培养项目需同时做革兰染色涂片,（,培养 + 药敏 + 涂片,）；,（ 3 ）规范：痰培养 / 气管吸出物的,定性培养,程序、气管镜,采集标本的,定量培养,程序；,（ 4 ）明确：报告,的临床意义和格式内容,。,分析前,分析中,标本的采集、运送,定性、,定量,培养、涂片流程,标本初筛、合格判断,病原菌筛查和鉴定、质量控制,分析后,染色、培养结果报告,（致病菌、非致病菌）、结果解释,内容,1.,口咽部定植菌群变化对肺部感染的重要影响,肺部感染的影响因素,( 定植菌变化：健康人 G+ 免疫、基础病 /住院、用抗菌药物 G-b ),2.,肺部感染的常见机制,主要机制：吸入定植菌；吸入气溶胶；血播性；,附录 A: “下呼吸道感染的主要类型及主要病原菌”,附录A,汇总表,3.,痰涂片,对下呼吸道感染病原菌诊断的重要作用,痰培养：敏感性低 / 培养+,涂片,：提高特异性和敏感性,4.,支气管纤维镜标本定量培养的临床意义,特异性 82% 91% ，诊断价值远高于痰标本；,附录 B : “适合诊断的病原及检验项目”,附录B,汇总表,5.,下呼吸道感染细菌培养的局限性,培养结果假阴性、假阳性的原因,1.,2.,3.,人类口咽部定植：需氧菌、兼性厌氧菌和厌氧菌等微生物；,菌群总数：,10,10,10,12,CFU/mL;,健康人,咽部定植菌特点：,菌量最少；,需氧的正常菌群组成：,革兰阳性菌,为主；,影响因素：人体,基础条件变化,影响定植菌群的,种类和数量；（微生态）,举例：长期接触携带定植菌人群菌群会变化，如日托儿童的父母的肺炎链球,菌、流感嗜血杆菌（具侵袭性）定植数量会增加；,基础条件变化,：使用免疫抑制剂、慢性肺病、广谱抗菌药物治疗或住院患,者等人群中，,革兰阴性杆菌,的优势明显增加。,常见因素：,住院患者（,48h,后）：,病毒感染,抗菌药物,损害,侵入性仪器,继发细菌感染,杀死、抑制正常菌群，使,G-b、耐药,菌过度繁殖，如大肠埃希菌、铜绿假,单胞,菌、不动杆菌、阴沟肠杆菌等；,定植菌：肠道菌，,MRSA,，多重耐药菌,机械通气（,ICU）,嗜麦芽窄食单胞菌,鲍曼不动杆菌,引起医院获得性感染,1,）,肺部感染的最常见机制：,肺泡内吸入了口咽部定植菌；,吸入性肺炎患者咽部菌群种类： 多侵袭性细菌或耐药细菌，如肺炎链球菌或革兰,阴性杆菌。,清除机制：,健康宿主吸入口腔定植菌后常无临床症状，细菌,通常被,粘液柱状纤维,清除。,吸入能否引起肺部感染取决于：,吸入菌的致病性及数量；,患者免疫系统；,呼吸道功能,等诸方面的因素。,2,）,吸入气溶胶,肺部感染占第二位： 主因：使用了不清洁的呼吸机。,3,）血液播散性肺炎占第三位：,感染通常造成双肺下叶肺炎。由呼吸道感染引发,的菌血症占,12%,，,因此对肺部感染的高热患者送,检血培养,，有利于发现肺部,感染的病原菌。,类型,/,免疫,状态,最常见病原菌,少见病原菌,1,社区获得性 典型肺炎,肺炎链球菌，流感嗜血杆菌，,肺炎克雷伯菌,金黄色葡萄球菌，卡他莫,拉菌，脑膜炎奈瑟菌,2,社区获得性 非典型肺炎,肺炎支原体，呼吸道病毒，,流感病毒，肺炎衣原体，,军团菌属,沙眼衣原体，结核分枝杆,菌，真菌等,吸入性肺炎,厌氧菌,，,金黄色葡萄球菌,，,需氧G-b,医院获得性肺炎,G-b,(,肠杆菌属,/,克雷伯菌属,/不,动杆菌属/,假单胞菌属,)，,金黄色葡萄球菌,，,厌氧,菌,，,社区获得性肺炎的典型菌,军团菌，肺炎链球菌,血液播散性肺炎,金黄色葡萄球菌,，链球菌,需氧革兰阴性杆菌,注1：,肺炎链球菌,和,流感,嗜血杆菌,是引起儿童和老年人肺炎的最常见致病菌；,卡他莫拉菌、脑膜炎球菌,多发,于:,基础病患者或病毒感染后的继发感染；金黄色葡萄球菌肺炎可引发肺脓肿；肺炎克雷伯菌大叶性肺炎,常合并脓肿或肺粘连，死亡率较高。,类型,/,免疫,状态,最常见病原菌,少见病原菌,免疫抑制宿主条件致,病菌感染性肺炎,社区获得性肺炎典型菌，,奴卡菌属，念珠菌属，条,件致病真菌，曲霉菌,3,环境暴露 引起的肺炎,双相真菌、曲霉属、肺炎,支原体、肺炎衣原体,鼻疽假单胞菌，假鼻疽,假单胞菌，鼠疫耶尔森,菌，贝纳柯克斯体、图,拉热弗朗西斯菌,急性气管炎,病毒，百日咳博德特菌，,肺炎支原体和肺炎衣原体,注2：通常可用分子生物学方法快速诊断，也可在感染后期用血清学方法检测肺炎支原体、肺炎衣,原体和军团菌属抗体确诊。由生物恐怖病原菌，如和鼠疫耶尔森菌引起的感染，血清学检测,可作为辅助诊断方法。结核分枝杆菌可用罗氏培养基或快速结核杆菌液体培养仪培养，或分,子诊断方法检测。,注3：暴露在特殊气溶胶环境：,与飞沫有关的结核分枝杆菌、与尘暴和鸟排泄物有关的双相真菌,等,。,除引起社区,非典型肺炎,的病原不能常规培养外，其他常,见肺部感染的病原菌均可常规培养方法分离；,但培养方法敏感性低，无法判断分离菌的来源,。,涂片革兰染色方法：,评价痰标本是否合格；,提高病原菌诊断的特异性；,涂片还可发现培养不能生长的细菌。,涂片方法提高了培养方法的特异性及敏感性。,敏感性,特异性,当有大量炎症细胞,，且：,G+,双球菌,诊断肺炎链,球菌：,57%,97%,G-,小杆菌,诊断流感嗜,血杆菌：,82%,99%,4.支气管纤维镜标本定量培养的临床意义,库什曼螺旋纤维,呈毛虫状蜷曲，革兰染色可见中轴蓝染，边,缘淡红色。因慢性炎症时细支气管分泌的粘液浓,缩而成。,夏科雷登结晶,可见于支气管，为菱形或针状六边形无色透,明结晶，其两端尖长，大小不等，折光性强，由,嗜酸粒细胞破裂后嗜酸性颗粒相互融合而成, 可,用碘染色。可在稍放置的痰中找到嗜酸性粒细胞,堆。在对烟曲菌有变态反应的哮喘患者或肺部感,染寄生虫患者的痰液中常见。,弹性纤维,肺组织有破坏性病变如肺脓肿、肺癌等时，痰中,可出现弹性纤维，,证明痰液标本来自下呼吸道,。,纤毛柱状上皮细胞,纤毛柱状上皮细胞主要分布在下呼吸道内表面，在,柱状细胞的游离面附有能摆动的纤毛，是能分泌粘液的,借助纤毛有节律性的摆动，将含有灰尘、细菌的粘液排,除至喉部。,肺泡巨噬细胞,来自血中单核细胞，脱落的型肺泡上皮或肺泡间,隔细胞。细胞体积大，胞质丰富，核圆形、卵圆形或肾,形，略偏位，染色质细致均匀，偶见核仁，,涂片中有巨,噬细胞证明痰液标本来自下呼吸道。,3.1,标本采集,3.1.1,咳痰,3.1.2,气管吸出物,注：仅当出现肺炎的临床表现（如发热或浸润）时采集气管吸出物标本，,否则勿培养气管吸出物，因气管在插管 24h 后即有定植菌，培养结果,可能与疾病不符。,3.1.3,血培养,注：当下呼吸道感染患者伴有高热症状时，送检血培养（具体参考血培养,标本采集和送检要求）,3.1.4,诱导痰（通常不用于细菌培养）,3.1.5,气管镜标本,3.1.5.1,采集气管镜标本注意事项,3.5.1.2,支气管肺泡灌洗液标本,(BAL),3.5.1.3,保护毛刷,(PSB),3.2,标本运送,注 1 ：若送检标本超过 2h，将导致有临床意义的致病菌数量减少，非苛养的口咽部定植,菌过度生长。为防止口咽部正常菌群的过度生长，可将标本放置 2 8 环境，但,培养分离到肺炎链球菌等苛养菌的机会和数量会减少。,注 2 ：若标本延迟送检超过 2h后未冷藏（超过 2h24h， 2 8 ），应在报告中说明因,延误送检标本，可能对培养结果造成的影响。,筛选并拒收下呼吸道细菌培养标本,拒收,24h,内重,复采集的痰细菌培养标本,唾液,鼻冲洗液和分泌物、鼻孔拭子,咽部标本,未经保护套管收集的支气管刷培养标本,痰的厌氧菌培养标本,注：除支气管穿刺吸出物、 PSB 、活检标本、胸水或其他未经污染以外的标本做厌氧菌培,养均不合格。,诱导痰,注：诱导痰标本只适用于检测卡氏肺孢子菌和结核分枝杆菌，对其他病原菌检出效果差。,1+（偶见）,2+ （ 少 量,3+（中量）,4+（大量）,细胞计数（低倍镜）,少于1个/LPF,1个9个/LPF,10个25个/LPF,大于25个/LPF,细胞计数（油镜）,少于1个/OIF,1个5个/OIF,6个30个/OIF,大于30个/OIF,4.1,痰及气管吸出物标本处理,4.1.1,标本处理要求,接种标本及涂片操作必须在,级生物安全柜中进行；,应,尽快处理所有标本，特别是来自急诊、新入院患者和有创方法采集的标本（如：,BAL,和肺,活检标本），以保证致病菌的活性，避免造成重复采集标本；,使用全自动接种前处理系统的实验室,按厂家说明书处理标本，洗痰、液化后自动接种和涂片,革兰染色。,4.1.2,接种标本,4.1.3,培养,4.1.4,标本涂片,及革兰染色,注 1 ：革兰染色脱色时间因选用不同的脱色剂而异。 1 ）,95% 乙醇脱色时间为 30s,； 2 ）,丙酮- 乙醇,（体积比为 3:7, 棕色瓶室温保存，有效期 1 年）脱色时间 1s 5s ，脱色效果一致性好；,3 ）,丙酮,（试剂纯）脱色时间最短，当标本中含大量宿主细胞时脱色效果好。,注 2 ：使用革兰染色仪染色的实验室按照厂家操作说明书进行，注意条件优化，使涂片染色结果达到满意效果。,显微镜观察革兰染色结果,4.2,气管镜标本处理,支气管,肺泡,灌洗液,定量培养,保护毛刷,定量培养,接种其他培养基并培养,革兰染色标本处理,剩余,BAL,标本可用于其他病原检测,（标本珍贵）,对剩余BAL标本离心后，可根据需要进行病毒、分枝杆菌、军团菌和真,菌培养；或做病毒、卡氏肺孢子菌、抗酸染色和真菌涂片染色,.,4.3,连续培养并观,察慢生长菌,适用于检测条件致病菌的所有项目,只用于诊断细菌性肺炎，定量培养和革兰染色,4.4,分离并鉴定下呼吸道重要致病菌（参见附录,C）,“常见可疑菌落形态及经典快速鉴定方法(16种)”,链球菌属,苛养革兰阴性杆菌（在麦康凯平板上难生长）,革兰阴性双球菌,革兰阴性杆菌（在麦康凯平板上生长良好）,葡萄球菌属,肠球菌属,革兰阳性杆菌,鉴定丝状真菌,涂片时可见但培养不生长的细菌,质量控制,革兰染色,抗酸染色,培养基,试剂,每批号、每周需做质控的试剂,每批号、每次试验需做质控的试剂,5.1,革兰染色报告,痰标本报告原则（见表,1）,“痰 / 气管吸出物标本涂片革兰染色结果解释”,5.1.2 BAL,细胞离心涂片报告,5.2,报告有临床意义的微,生物,应报告的病原菌,（,致病菌,）,培养和涂片相符合时报告的病原菌,（与感染相关的定植菌）,有临床意义的数量,报告有临床意义数量的非优势菌,报告有临床意义数量的优势菌,5.3,对非致病菌的报告,报告“肠杆菌科细菌”,报告“非发酵细菌”,只生长肠球菌和凝固酶阴性葡萄球菌,报告“分离到口咽部正常菌群”,5.4,平板上无细菌生长,5.5,结果解释,不接受培养,可接受培养,提示感染,特征性,提示与感染相关,的病原菌,注意！,用革兰染色来评估呼吸道标本是否合格,10鳞状上皮细胞/LPF标本来,自上呼吸道,弹性纤维，中性粒细胞多，鳞状上,皮细胞少，有代表性的好标本,你看见多少种形态？,几种细菌的混合形态，缺乏鳞状上皮细胞,=,混合厌氧菌感,染。如果是呼吸道标本可能是吸入性肺炎。报告临床医生,“提示吸入性肺炎”,细胞内细菌,在使用抗生素之后链球菌常形态,变得特别奇怪,呼吸道标本中未被染色的，,有折射的杆菌,=,抗酸杆菌,5.2.1,应报告的病原菌,化脓链球菌,B,群,-溶血链球,菌（儿童）,博德特菌属，特别是支气管博德特菌,奴卡菌属,新生隐球菌,弗朗西斯土拉菌（高致病菌）,鼠疫耶尔森菌（高致病菌）,炭疽芽孢杆菌（高致病菌）,丝状真菌（排除腐生菌污染）,处理培养物应参考涂片的结果，应根据革兰染色所见,炎,症细胞和细菌的形态与培养物进行对照,，当培养与涂片,结果不相符时应重新读片。,当,培养,生长的细菌在,涂片中亦和炎症细胞相关,时，,报告以下两种病原菌,：,肺炎链球菌，并报告药敏结果,流感嗜血杆菌，常规报告,-,内酰胺酶,下呼吸道标本有意义的细菌浓度值（,CFU/ml,）,标本,自然咳痰,诱导痰,气管内吸取物,支气管肺泡灌洗液,保护性毛刷,支气管灌洗液,有意义的浓度,CFU/ml,10,7,不确定,10,6,10,4,10,3,不,做培养,a.,定性培养,生长的病原菌数量达到以下情况时，判断为有临床意义：,在平板第2区划线仍大量生长，或培养物生长量超过1/4平板；,培养少量生长且革兰染色涂片可见,此形态细菌与炎症细胞相,关联,的病原菌；,在平板划线第1区生长且纯度超过90%以上时，同时革兰染色,涂片可见,此形态细菌与炎症细胞相关,的病原菌。,b.,定量培养,有临床意义的数量：,BAL：菌落计数,10,4,CFU/mL,PSB：菌落计数,10,3,CFU/mL,取最高稀释度平板，分别对不同菌落形态的细菌计数，乘上,稀释倍数即为菌落数。,当培养达到,所示有临床,意义的数量时，即,使非优势菌也应报告的病原菌：,a.,卡他莫拉菌、脑膜炎奈瑟菌,，常规报告,-内酰胺酶；,b.,只对住院患者报告的病,原菌有,：,铜绿假单胞菌，并报告药敏结果,嗜麦芽窄食单胞菌，并报告药敏结果,不动杆菌属，特别是鲍曼不动杆菌，并报告药敏结果,洋葱伯克霍德菌，并报告药敏结果,生长菌达有临床意义数量的优势菌，特别当涂片提示分离菌与,多形核白细胞相关时报告的病原菌：,a.,金黄色葡萄球菌，并报告药敏结果,b. B,群,-,溶血链球菌（成人）、,C,群或,G,群,-溶血链球菌,c.,单一形态革兰阴性杆菌（特别是肺炎克雷伯菌），并报告药敏结果,d.,苛养的革兰阴性杆菌，通常报告,-内酰胺酶,e.,脲酶阳性,的棒状杆菌或来自,ICU的患者,f. 分离自免疫抑制患者的马红球菌,报告“肠杆菌科细菌”,在麦康凯平板上生长,1,种,G-b,，经氧化酶,(-)、乳,糖产酸等试验初步鉴定为肠杆菌科细菌，报告：,经鉴定生长“肠杆菌科细菌”。,报告“非发酵细菌”,在麦康凯平板上生长,1,种,G-b,，经氧化酶,(+)、,克氏双糖铁上不发酵葡萄糖等试验初步鉴定，报告：,经鉴定生长“非发酵细菌”。,若只生长肠球菌属和,/,或凝固酶阴性葡萄球,菌（有或,无酵母样真菌），报告“革兰阳性球菌混合生长”,;,若培养物纯度达,90%以上，则做初步鉴定到属水平并,分别列出。,若未分离到致病菌，对分离的：,草绿色链球菌和,/,或非致病奈瑟菌,类白喉菌,凝固酶阴性葡萄球菌,罗斯菌属（,Rothia spp.),F,群链球菌,厌氧菌,嗜血杆菌属（非流感嗜血杆菌）,艾肯菌属,放线杆菌属,嗜二氧化碳菌,莫拉菌属,肠球菌属,酵母样真菌,未达到有意义数量的金黄色葡萄球菌（如果医院感染控制要求可做药敏试验）,革兰阴性杆菌及脑膜炎奈瑟菌，,均报告：“分离到口咽部正常菌群”（可列出相应菌属）,如任何平板上无细菌生长，报告“无细菌生长”。,出现此种情况可能是使用抗菌药物抑制了正常菌群,等原因。,尽管培养到的,肺炎链球菌或流感嗜血杆菌,可能是,定植菌,，因而导致报告了假阳性结果，,但通常仍在临床报告中提示分离菌是可疑致病菌。,培养生长的,革兰阴性杆菌或金黄色葡萄球菌是优势菌,，且涂片也提示这些形态的细菌,与,感染相关,时才报告。,培养阴性时也不能排除患者的下呼吸道感染，因培养的阳性率低，经常分离不到致病菌。,多数医生认为对通气相关肺炎和院内感染肺炎患者做气管吸出物或痰培养对临床诊断有,帮助。,通常治疗社区获得性肺炎使用青霉素类抗菌药物，如阿莫西林或阿莫西林,/,棒酸、一种,氟喹诺酮类、一种大环内酯类抗菌药物，或联合抗菌药物治疗。,行业标准力求科学性、原则性、易读性、可操作性；,解决共性问题；,不“完美”，改进和修订；,结合各自的工作流程使用，符合相关原则和要素；,标准的选择和制定也更规范。,谢 谢！,谢谢观赏！,2020/11/5,49,