色谱课件高效液相

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,*,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,色谱课件高效液相,2,一、高效液相色谱概述,高效液相色谱是在气相色谱和经典色谱的基础上发展起来的。现代液相色谱和经典液相色谱没有本质的区别。不同点仅仅是现代液相色谱比经典液相色谱有较高的,效率,和实现了,自动化,操作。,经典的液相色谱法，流动相在常压下输送，所用的固定相柱效低，分析周期长。,而现代液相色谱法引用了气相色谱的理论，流动相改为高压输送,;,色谱柱是用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。,因此，高效液相色谱具有分析速度快、分离效能高、自动化等特点。,第一节 正相高效液相色谱法,3,高效液相色谱的命名,高速液相色谱（,High Speed Liquid Chromatograph,）,高效率液相色谱（,High Efficiency Liquid Chromatography,）,高压液相色谱（,High Pressure Liquid Chromatography,HPLC,）,高效,(,能,),液相色谱（,High Performance Liquid Chromatography,HPLC,）,4,被分离混合物在固定相及流动相中，由于,吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异,，而被分离。,根据分离机制不同，液相色谱可分为：,吸附色谱,分配色谱,化学键合色谱,离子交换色谱,分子排阻色谱,二,、液相色谱分类,5,在液,-,液色谱中，一个液相作为流动相，而另一个液相则涂渍在惰性载体上作为固定相。,流动相与固定相应互不相溶,，两者之间应有一明显的分界面。分配色谱过程与两种互不相溶的液体在一个分液漏斗中进行的,溶剂萃取,相类似。,固定相,由于液相色谱中，流动相参与选择作用，流动相极性的微小变化，都会使组分的保留值出现较大的差异。因此，液,-,液色谱中，,只需几种不同极性的固定液即可,。,1,、液,-,液色谱（又称分配色谱）,6,流动相,在液,-,液色谱中，要求流动相对固定相的溶解度尽可能小，,因此固定液和流动相的性质往往处于两个极端,，例如当选择固定液是极性物质时，所选用的流动相,通常是弱极性或非极性溶剂。,以极性物质作为固定相，非极性溶剂作流动相的液,-,液色谱，称为,正相分配色谱,，适合于分离极性化合物；,反之，如选用非极性物质为固定相，而极性溶剂为流动相的液,-,液色谱称为,反相分配色谱,，这种色谱方法适合于分离芳烃、稠环芳烃及烷烃等化合物。,7,2,、化学键合高效液相色谱,将固定液机械地涂渍在担体上组成固定相，不可避免固定液的流失。,70,年代初发展了一种新型的固定相,化学键合固定相。这种固定相是,通过化学反应把各种不同的有机基团键合到硅胶（载体）表面的游离羟基上,，代替机械涂渍的液体固定相。,这不仅避免了液体固定相流失的困扰，还大大改善了固定相的功能，提高了分离的选择性，,化学键合色谱适用于分离几乎所有类型的化合物,。,8,化学键合色谱具有下列优点：,（,1,）,适用于分离几乎所有类型的化合物。,一方面通过控制化学键合反应，可以把不同的有机基团键合到硅胶表面上，从而大大提高了分离的选择性；另一方面可以通过改变流动相的组成和种类来有效地分离非极性、极性和离子型化合物。,（,2,）由于键合到载体上的基团不易被剪切而流失，这不仅解决了由于固定液流失所带来的困扰，还,特别适合于梯度洗脱,，为复杂体系的分离创造了条件。,（,3,）键合固定相对不太强的酸及各种极性的溶剂都,有很好的化学稳定性,还具有很好的热稳定性,。,（,4,）固定相,使用寿命长，柱效高，分析重现性好,。,9,极性键合色谱，又称,正,相色谱,，指以,亲水性,的填料作固定相，,以疏水性溶剂或其混合物作流动相的液相色谱。,非极性键合色谱，又称,反,相色谱,，指以,强疏水性,的填料作固定相，,以可以和水混溶的有机溶剂做流动相的液相色谱。,通常所说的反相色谱是指非极性键合色谱。,反相色谱在现代液相色谱中应用最为广泛，占到高效液相色谱的,70-80%,。,根据键合相与流动相之间相对极性的强弱，可将键合相色谱分为极性键合相色谱和非极性键合相色谱。,10,1.,概念,在正相色谱中，一般采用,极性键合固定相,，硅胶表面键合的是极性的有机基团（如羟基、氨基或氰基等）；,流动相一般用比键合相极性小的非极性或弱极性有机溶剂，如烃类溶剂（己烷或环己烷），或其中加入一定量的极性溶剂（如氯仿、二氯甲烷、醇、四氢呋喃和乙腈等），以调节流动相的洗脱强度。,三、正相色谱介绍,11,2.,应用,在液相色谱发展的早期，类似于气相色谱把含羟基、氨基或氰基的极性固定液涂渍在硅胶上，这样容易被流动相冲洗掉，,现在几乎都使用键合固定相,了。,正相高效液相色谱主要应用于分离甾醇类、类脂化合物、磷脂类化合物、脂肪酸等。,12,四、正相色谱固定相,正相键合色谱的键合固定相的优点是：在梯度洗脱时，体系平衡快，同时对水和金属离子等杂质的不可逆吸附弱，柱子的使用寿命增加，重现性得到很大提高。,1.,常用的氰基固定相具有与硅胶相似的极性和分离选择性，由于氰基含有多键，因此对不饱和的化合物或异构体，以及含有双键数目不同的样品具有更好的选择性。,2.,羟基类键合相与硅胶固定相有相同的羟基官能团和氢键作用力，因此分离的选择性也很相近。羟基柔性更好。,13,3.,氨基键合相,氨基键合相呈较强的碱性，与硅胶的酸性和氰基、羟基的中性有较大的区别。,在酸性条件下，固定相上的氨基被质子化，带有正电，不仅有吸附而且有离子交换机理存在。,氨基具有很强的氢键作用能力，对能够形成氢键的化合物，如甾醇、药物有特殊的分离能力，对糖类化合物具有很好的分离选择性。,氨基具有很强的化学活性，凡是在常温下能与氨基反应的化合物均不能用氨基键合相分离；氨基也容易被空气中的氧气所氧化，避免在较高温度下使用，并除去氧气。,14,第二节 反相高效液相色谱,一、,固定相,在反相,键合,色谱中，一般采用非极性键合固定相，如硅胶,-C,18,H,37,（简称,ODS,或,C,18,）、硅胶,-C,8,H,17,（,C,8,）、硅胶,-,苯基等。,n=7 or 17,15,以硅胶为基质的反相高效液相色谱柱,1996,年的匹兹堡分析仪器展览会上，许多厂家推出了第三代反相,HPLC,填料：,使用高纯硅胶，残余硅醇基量低，键合基团覆盖均匀；,细内径；,球形填料（不规则填料多用于制备色谱柱）。,一般的十八烷基键合硅胶（,ODS,）多用,3,m,或,5,m,的填料。,硅胶,分子毛,16,流动相一般用强极性的溶剂，如甲醇,/,水，乙腈,/,水，有机溶剂和无机盐的缓冲液等。,反相高效液相色谱对水的要求很高，因为水中的杂质常带来许多麻烦，特别是在进行,痕量分析的梯度洗脱,时：,水中的杂质累积于色谱柱头，洗脱强度发生变化时它们就可能会流出色谱柱，形成,鬼峰,；,使用蒸馏并进行了离子交换的纯水（二次水）。,二、流动相,17,选择缓冲溶液的要求：,在,pH=2-8,之间要有大的缓冲容量；,能透过检测器使用的光波；,能和有机溶剂相溶。,通常不使用乙酸盐缓冲溶液，因为它和带阳离子的溶质会形成非极性配合物；,也不要使用卤化物，以免腐蚀液相色谱仪。,18,目前，对于反相色谱的保留机制还没有一致的看法，大致有两种观点：一种认为属于分配色谱，另一种认为属于吸附色谱。还有一些研究者倾向于多种作用机制共存。,分配色谱,的作用机制：,假设混合溶剂（水,+,有机溶剂）中极性弱的有机溶剂吸附于非极性烷基配合基表面；,组分分子在流动相中与被非极性烷基配合基所吸附的液相中进行分配。,三、反相高效液相色谱的分离机理,19,吸附色谱,的作用机制：,把非极性的烷基键合相，看作是在硅胶表面上覆盖了一层键合的十八烷基的,“分子毛”,，这种“分子毛”有强的疏水特性。当用水与有机溶剂所组成的极性溶剂为流动相来分离有机化合物时：,一方面，非极性组分分子或组分分子的非极性部分，由于疏溶剂作用，将会从水中被“挤”出来，与固定相上的疏水烷基之间产生,缔合作用,。（类似于吸附作用）,另一方面，被分离物的极性部分受到极性流动相的作用，使它离开固定相，此即,解缔过程,。,20,四、排阻色谱法,排阻色谱法也称空间排阻色谱或凝胶渗透色谱法，是一种根据试样分子的尺寸进行分离的色谱技术。,排阻色谱的分离机理是立体排阻，样品组分与固定相之间不存在相互作用的现象。,排阻色谱的色谱柱的,填料是凝胶,，它是表面惰性的，并含有许多不同尺寸的孔穴或立体网状结构。,所谓凝胶，指含有大量液体（一般是水）的柔软而富有弹性的物质，它是一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体。,排阻色谱被广泛应用于大分子的分级，即用来分析大分子物质相对分子质量的分布。,21,凝胶的孔穴仅允许直径小于孔开度的组分分子进入，这些孔对于流动相分子来说是相当大的，以致流动相分子可以自由地扩散出入。,凝胶的孔穴对不同大小的组分分子，可分别渗入到凝胶孔内的不同深度，大个的组分分子可以渗入到凝胶的大孔内，但进不了小孔甚至于完全被排斥。小个的组分分子，大孔小孔都可以渗入，甚至进入很深，一时不易洗脱出来。,大的组分分子在色谱柱中停留时间较短，很快被洗脱出来，它的洗脱体积很小；,小的组分分子在色谱柱中停留时间较长，洗脱体积较大。,直到所有孔内的最小分子到达柱出口，完成按分子大小而分离的洗脱过程。,22,排阻色谱的固定相一般可分为,软性、半刚性和刚性凝胶,三类。,（,1,）,软性凝胶,如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶都具有较小的交联结构，其微孔能吸入大量的溶剂，并能溶涨到它干体的许多倍。它们适用于水溶性作流动相，一般用于小分子质量物质的分析，不适宜在高效液相色谱中。,（,2,）,半刚性凝胶,如高交联度的聚苯乙烯。常以有机溶剂作流动相。,（,3,）,刚性凝胶,如多孔硅胶、多孔玻璃等，它们既可用水溶性溶剂，又可用有机溶剂作流动相，可在较高压强和较高流速下操作。,23,对仪器的一般要求,分子排阻色谱法所需的进样器和检测器与高效液相色谱法相同，液相色谱泵一般分常压、中压和高压。,在药物分析中，尤其是分子量或分子量分布测定中，通常采用高效分子排阻色谱法（,HPSEC,）。应选用与供试品分子大小相适应的色谱柱填充剂。,使用的流动相通常为水溶液或缓冲液，溶液的,pH,值不宜超出填充剂的耐受力，一般,pH,值在,2,8,范围。流动相中可加入适量的有机溶剂，但不宜过浓，一般不应超过,30%,，流速不宜过快，一般每分钟为。,24,第三节 色谱仪的比较,一、制备色谱,1,、,定义：用大直径柱分离大量纯组分的技术。,在生物化学领域，制备色谱可以分离几毫克样品，然后用合适的化学或谱学方法对结构进行鉴定；,在有机合成领域，分离出中间产品或最终产物；,在制药和化学工业领域，制备色谱要给出公斤级的产品。,25,2,、制备型液相色谱和分析型液相色谱的异同,分析型液相色谱 制备型液相色谱,进样量,够检测即可 尽可能大,以反相色谱居多 以正相色谱最方便,色谱柱内径,1-5mm 1-10cm,填料,粒度,5,m,7,m,进样量,不是问题,是个大问题,检测器灵敏度,需要提高,不是问题,样品在流动相中的溶解度,不重要 很重要,流动相的挥发性,不重要 应具有挥发性,26,3,、提高制备量的途径,高效液相色谱柱填料的量加大，从而提高柱容量；,使进样量比正常分离更多，形成超载分离（见下图）；,使用大直径色谱柱和便宜的填料，降低流速获得较好的分离度；,使用分析型色谱柱或直径稍大一些的色谱柱，多次进样，累积产品。,检测信号,时间,3,1,3,2,3,1,，,2,收集纯组分；,3,可进行再次分离的组分,27,二、液相色谱与气相色谱的比较,液相色谱所用,基本概念,与气相色谱一致：塔板数、塔板高度、分离度、选择性等。,液相色谱所用,基本理论,与气相色谱基本一致：塔板理论与速率理论。,但液相色谱与气相色谱有很大的差别：,以液体代替气相色谱中的气体作为流动相，而液体和气体的性质不相同；,液相色谱所用的仪器设备不同；,操作条件差别很大。,28,HPLC,与,GC,的不同点：,1.,应用范围不同,气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不分解的物质。对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定化合物、离子型化合物的分离、分析较为困难。致使其应用受到一定程度的限制，,据统计只有大约,20%,的有机物能用气相色谱分析,；,液相色谱则不受样品挥发度和热稳定性的限制，它可以进行大分子量、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物的分离分析，大约,占有机物的,70 80%,。,29,2.,液相色谱能完成难度较高的分离工作,气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，不参与分配平衡过程，与样品分子没有作用，样品分子只与固定相相互作用。,而在液相色谱中流动相液体与固定相共同作用于样品分子，为提高选择性增加了一个因素,。也可选用不同比例的两种或两种以上的液体作流动相，增大分离的选择性。,液相色谱固定相类型多,，如离子交换色谱和排阻色谱。 等，作为分析时选择余地大；而气相色谱并不可能的。,但是,液相色谱通常只能在室温下操作,，较小的温度选择范围，使柱温不能作为色谱分离条件被选择。,30,3.,由于液体的扩散性比气体的小,10,5,倍，因此，溶质在液相中的传质速率慢，,柱外效应就不是特别重要,；而在气相色谱中，柱外区域扩张对色谱分析影响很大。,4.,液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易，而且回收是定量的，,适合于大量制备,。,但是,液相色谱尚缺乏便宜的通用检测器，仪器比较复杂，价格昂贵。在实际应用中，这,两种色谱技术是互相补充的,。,综上所述，,高效液相色谱法具有高柱效、高选择性、分析速度快、灵敏度高、重复性好、应用范围广等优点。,该法已成为现代分析技术的重要手段之一，目前在化学、化工、医药、生化、环保、农业等科学领域获得广泛的应用。,31,三、高效液相色谱法与经典液相色谱法的差别,高效液相色谱法是继气相色谱之后，,70,年代初期发展起来的一种以液体做流动相的新色谱技术。,高效液相色谱是在气相色谱和经典液相色谱的基础上发展起来的，与经典液相色谱没有本质的区别。,不同点是现代液相色谱比经典液相色谱有较高的,效率,和实现了,自动化,操作。,32,经典液相色谱法,:,流动相在常压或减压下输送；,所用的固定相柱效低，分析周期长。,现代液相色谱法,:,引用了气相色谱的理论；,流动相改为,高压输送,（最高输送压力可达,10,7,Pa,）；,色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；,同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。,高效液相色谱具有,分析速度快、分离效能高、自动化等,特点。所以人们称它为,高效液相色谱法,。,不同之处,33,一、色谱柱,1,、键合相色谱的载体,高效液相色谱固定相,以承受高压能力,来分类，可分为,刚性固体和硬胶,两大类。,刚性固体以,二氧化硅,为基质，可承受,10,8,10,9,Pa,的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。,硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由,聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成,。可承受压力上限为,10,8,Pa,。,第四节 色谱柱和流动相,34,固定相按,孔隙深度,分类,：,1,）,表面多孔型载体,（薄壳型微珠载体），由直径为,30-40,m,的实心玻璃球和厚度约为,1-2 m,的多孔性外层所组成。,2,）,全多孔型载体,，由硅胶、硅藻土等材料制成，直径,30-50m,的多孔型颗粒。,3,）,全多孔型微粒载体,，由,nm,级的硅胶微粒堆积而成，又称堆积硅珠。这种载体粒度为,3-10m,。由于颗粒小，,所以柱效高，是目前使用最广泛的一种载体。,35,2,、化学键合固定相的类型,一般在键合反应之前，要对硅胶进行酸洗、中和、干燥活化等处理，然后再使硅胶表面上的硅羟基与各种有机物或有机硅化合物起反应，制备化学键合固定相。键合相可分为四种键型：,1,）硅,-,氧,-,碳型（,Si-O-C,）键合相,将醇与硅胶表面的羟基进行反应，在硅胶表面形成（,硅胶,Si-O-C,）键合相。反应生成单分子层键合相，易水解。一般用极性小的溶剂洗脱，分离极性化合物。,36,2,）硅,-,氮型（,Si-N-C,）键合相,如果用,SOCl,2,将硅胶表面的羟基先转化成卤素（氯化），再与各种有机胺反应，可以得到各种不同极性基团的（硅胶,Si-N-C,）,键合相。可用非极性或强极性的溶剂作为流动相，对有机溶剂和,pH=3-8,的水介质很稳定。,37,3,）硅,-,碳型（,Si-C,）键合相,将硅胶表面氯化后，使,Si-Cl,键转化为（硅胶,Si-C,）键。在这类固定相中，有机基团直接键合在硅胶表面上。,38,4,）硅,-,氧,-,硅,-,碳型（,Si-O-Si-C,）键合相,将硅胶与有机氯硅烷或烷氧基硅烷反应制备。这类键合相具有相当的耐热性和化学稳定性，对有机溶剂和的水介质很稳定，是目前应用最为广泛的键合相。,or,39,5,）键合固定相的性质,表面覆盖度,由于空间效应，硅胶表面的羟基在反应中不能被完全覆盖，所以好的填料要把残余的羟基掩蔽起来，以免影响保留作用。,键合相链长的影响,在反相色谱中，等覆盖度的键合固定相其链越长，保留能力也越强；对于正相色谱，链的长度影响不明显。,键合固定相基质性质的影响,以硅胶为基质的键合固定相，硅胶的性质对保留能力有一定影响。,40,由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲合力，并参与固定相对组分的竞争，因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是：,1.,溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。,2.,低粘度,若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、甲醇和乙腈等，这样才能有较高的渗透性和柱效；但粘度过低的溶剂也不宜采用，例如戊烷和乙醚等，它们容易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。,二、流动相,41,3.,高纯度,由于高效液相色谱灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。,4.,溶剂与检测器匹配,对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比,溶剂的紫外截止波长,要长。,所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收测量。,对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达到最高灵敏度。,42,5.,容易精制、纯化、毒性小，不易着火、价格尽量便宜等。,6.,化学稳定性好,能溶解样品，但不能与样品发生反应。与固定相不互溶，也不发生不可逆反应。,为了获得合适的溶剂极性，常采用两种或更多种不同极性的溶剂混合起来使用，如果样品组分的分配比,-,k,值范围很广则使用梯度洗脱。,43,三、梯度洗脱,1,、简介,液相色谱的梯度洗脱和气相色谱中的程序升温类似,。,所谓,梯度洗脱,，就是有两种（或两种以上）不同极性的溶剂，在分离过程中按一定程序连续的改变，以改变流动相的配比和极性。,梯度洗脱具有（相对于等梯度洗脱）的优点,1.,避免早流出组分分离度不好,2.,避免晚流出组分峰变宽、峰高降低,3.,避免混合物性质差异大时分析时间长,4.,避免保留时间长的组分残留，污染色谱柱,44,梯度洗脱液相色谱适合以下情况：,具有性质差别较大的样品，即组分在等梯度洗脱时保留时间差别很大；,有大分子化合物的样品，相对分子量大于,1000,的，尤其是生物样品；,样品中含有高保留时间的干扰成分，在一次分析中如不把它洗脱出去，就会污染色谱柱，影响下一次分析；,使用梯度洗脱选择最佳等梯度洗脱的比例。,45,正相色谱：以疏水性溶剂或混合物作流动相，梯度洗脱时将强极性溶剂,B,逐渐加入到弱极性溶剂,A,中。,反相色谱：以可以和水混溶的有机溶剂做流动相，梯度洗脱时将弱溶剂,B,逐渐加入到强溶剂,A,中。,溶剂,A+B=100 %,t,100 % B,100 % A,0,线性梯度,t,t,t,曲线梯度,分 段 梯 度,2,、梯度洗脱的梯度方式,46,3,、建立梯度洗脱的方法,实现梯度洗脱程序的最佳化，可按下列基本步骤进行：,用一个较慢的线性梯度进行探索试验，观察各组分的分离情况；,调整梯度范围，尽可能减少分离开始和结束的时间浪费；,调整分离度，如果色谱图中有很多组分分离度不好，可以调整梯度，也可以使用分段梯度。,47,四、色谱方法的选择,要正确地选择色谱分离方法，首先必须尽可能多的了解样品的有关性质。,选择色谱分离方法的主要根据是样品的相对分子质量的大小，在水中和有机溶剂中的溶解度，极性和稳定程度以及化学结构等物理、化学性质。,1,、相对分子质量,分子质量在,200,2000,的化合物，可用液,-,固吸附、液,-,液分配和离子交换色谱法。相对分子质量高于,2000,，则可用空间排阻色谱法。,48,2,、溶解度,水溶性样品最好用离子交换色谱法和液,-,液分配色谱法；微溶于水，但在酸或碱存在下能很好电离的化合物，也可用离子交换色谱法；油溶性样品或相对非极性的混合物，可用液,-,固色谱法。,3,、化学结构,若样品中包含离子型或可离子化的化合物，或者能与离子型化合物相互作用的化合物（例如配位体及有机螯合剂），可首先考虑用离子交换色谱，但空间排阻和液,-,液分配色谱也都能顺利地应用于离子化合物；异构体的分离可用液,-,固色谱法；具有不同官能团的化合物、同系物可用液,-,液分配色谱法；对于高分子聚合物，可用空间排阻色谱法。,49,五、色谱分析实例,1.,反相高效液相色谱分析举例,这里介绍食品中山梨酸、苯甲酸和糖精钠的,HPLC,测定方法。,样品：汽水、果汁、配制酒类等（需经过前处理再进样）,色谱条件：色谱柱为,C,18,；,流动相为甲醇,-,乙酸铵溶液（）（,5,：,95,）；,流速为,1mL/min,；,进样量为,10,L,；,紫外检测波长,230nm,。,结果：保留时间（,min,）,添加剂 苯甲酸 山梨酸 糖精钠,50,2.,正相高效液相色谱分析举例,这里介绍果汁和果酒中糖类化合物的,HPLC,测定方法。,样品：苹果汁等果汁、果酒（需经过前处理再进样）,色谱条件：色谱柱为,Zorbax Rx-SIL,硅胶柱，以二胺动态涂层（，,5,m,）；,流动相为水,-,乙腈（,1,：）,+0.03%,乙二胺,+0.05%NH,4,OH,（均为体积比）；,进样量为,10,L,；,蒸,发光散射检测,器,（,ELSD,）。,说明：糖类样品无紫外吸收，可以采用示差折光检测,器,（,RID,），采用,ELSD,也是一种比较好的通用检测方式。,51,3.,梯度洗脱分析举例,52,六、色谱技术,1,、四元泵,53,54,55,与溶剂接触的材料：金，红宝石，蓝宝石，陶瓷，塑料,主动阀打开，向下移动的活塞将溶剂抽入第一个泵头，完成一个冲程长度（冲程长度由流速控制）后主动阀关闭。,在第一个活塞向上移动时，泵头里的溶剂通过输出球形阀压入第二个泵腔。第二个活塞抽取第一个活塞的一半体积，余下另一半体积直接运送至系统中。,在第一个活塞抽取过程中，第二个活塞将抽取的体积运送到系统中。,如此循环往复，得到持续的稳定流动相。,56,2,、检测器,DAD,57,58,3,关于溶剂和相关组件,59,60,61,62,选择题,1.,热导池检测器的组成部分有（ ）。,A.,离子室,B.,氘灯,C.,发射极,D.,热敏元件,2,下列哪种途径不可能提高柱效（ ）。,A,降低担体粒度,B,减小固定液液膜厚度,C,调节载气流速,D,将试样进行预分离,63,3,、某色谱峰，其峰高倍处色谱峰宽为,4mm,，标准,偏差为（ ）。,A.2mm B.6.66mm,4,、气相色谱分析中，理论塔板高度与载气流速（,u,）,之间的关系为（ ）。,A.,随,u,的增加而出现一个最小值,B.,随,u,的增加而减小,C.,随,u,的增加而出现一个最大值,D.,随,u,的增加而增加,64,作业题,7,、,HPLC,的常用检测器有哪几种,?,试述其测量原理及应用范围。,RID,，,UV-VIS,，,DAD,，,ELSD,8,、说明下面这种情况对组分的检测有何影响：使用紫外吸收检测器时，流动相为含有杂质,(,芳烃,),的己烷。,65,附：化学试剂的级别,试剂级别 标签颜色,优级纯（一级）,G.R.,绿色,分析纯（二级）,A.R.,红色,化学纯（三级）,C.P.,蓝色,实验纯（四级）,L.R.,棕色（或黄色）,除了上诉四种级别的试剂外，还有适合某一方面需要的,特殊规格试剂,，如基准试剂、色谱试剂、生化试剂等，另外还有,高纯试剂,，它又细分为高纯、超纯、光谱纯试剂等。,The End,谢谢您的聆听！,期待您的指正！,