分子生物学基因突变

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As per Darwin, mutation provides new traits for species, and then the nature selects those species with advantageous heritable traits - the process Darwin called natural selection.,2,Natural Selection,3,Science and Research,4,如果要对近几年的社会话题按照“敏感指数排出一个名次的话，转基因食品的平安问题恐怕至少要入围三甲。究其背后的原因，如果不是转基因食品在平安性问题上确有遮掩、隐瞒的话，那么我们就该反思，是不是真正地了解了“转基因食品的平安性到底是怎么一回事儿？,转基因食品的平安问题,5,Evolution,Mutations are engines of natural selection,6,Spiral goat,7,George was all mouth,The eyes have it,8,Back to the Water,9,10,Science: 科学家提醒人类长相各异的原因,人类的长相各异，没有两个人长相完全一样的。是什么导致了人面部形态各异呢？遗传学证据显示父母和子女长相类似，但是哪些因素使得DNA调控如此准确，使得两个人长相不同呢？,伯克利国家重点实验室的科学家提醒了增强子在面部发育中发挥重要作用。相关报道发表在近期的Science杂志上。该文章的通讯作者Axel Visel博士称其研究结果说明很可能人类基因组中的数千个增强子都不同程度的参与到面部发育过程中。,11,该研究总共分析了四千多个可能与面部发育相关的增强子序列，建立了增强子序列的基因组图谱。此外他们还细致分析了其中200个基因增强子的活性。子女遗传了父母的基因，但是由于增强子的存在，在面部发育过程中基因活性不尽一样，最终导致面部发育结果不完全一样。该结果还提示遗传学家，增强子的特异突变也会在新生儿缺陷中发挥作用。有助于开发更好的诊断和治疗措施。,12,Fine Tuning of Craniofacial Morphology by Distant-Acting Enhancers,Catia Attanasio, Alex S. Nord, Yiwen Zhu, Matthew J. Blow, Zirong Li, Denise K. Liberton, Harris Morrison, Ingrid Plajzer-Frick, Amy Holt, Roya Hosseini, Sengthavy Phouanenavong, Jennifer A. Akiyama, Malak Shoukry, Veena Afzal, Edward M. Rubin, David R. FitzPatrick, Bing Ren, Benedikt Hallgrmsson, Len A. Pennacchio, Axel Visel,The shape of the human face and skull is largely genetically determined. However, the genomic basis of craniofacial morphology is incompletely understood and hypothesized to involve protein-coding genes, as well as gene regulatory sequences. We used a combination of epigenomic profiling, in vivo characterization of candidate enhancer sequences in transgenic mice, and targeted deletion experiments to examine the role of distant-acting enhancers in craniofacial development. We identified complex regulatory landscapes consisting of enhancers that drive spatially complex developmental expression patterns. Analysis of mouse lines in which individual craniofacial enhancers had been deleted revealed significant alterations of craniofacial shape, demonstrating the functional importance of enhancers in defining face and skull morphology. These results demonstrate that enhancers are involved in craniofacial development and suggest that enhancer sequence variation contributes to the diversity of human facial morphology.,13,运动和咖啡因,会改变你的,DNA,你可能会认为不管做任何事情，自己的DNA都是不会受影响而改变的。但在某种意义上说，这一想法是错误的。在3月Cell出版社的?细胞代谢?杂志上，研究人员发表报告称当身体处于安康状态时，不怎么运动的男性和女性在运动锻炼几分钟后，他们体内的DNA会出现瞬间变化。更让人惊奇的是，这项研究说明我们早晨喝的咖啡中咖啡因成分也可能会以一样方式影响肌肉中的DNA。,14,女性携带离婚基因,A-allele,者离婚率高出五成,很多时候，当婚姻出现问题时，人们会把责任怪罪在男方头上，认为男士的花心导致了婚姻破裂。,在近期的Biological Psychiatry杂志上登载的一项研究成果说明，据瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡医学院的最新研究发现，婚姻出现破裂也有可能是女性体内携带的一种基因作祟所致。一种叫A-allele的催产素受体基因会在女性体内搞怪，让女性对婚姻关系中偶尔出现的不和谐插曲缺乏耐心，脾气暴躁，从而提高离婚率。,女性处于生产期和哺乳期时体内会自行分泌催产素，这种激素能拉近女性和后代间的关系。不过假设催产素分泌异常就会搅乱大脑对感情问题的处理能力，催生叫A-allele的“离婚基因。研究人员调查了1800名女性后发现携带这种基因的女性离婚率高50%。,15,概念与分类,诱因与特点,突变与疾病,突变与遗传工程技术,突变的检测,基因突变概要,A mutation has caused this garden,moss rose(,百叶蔷薇,),to produce flowers of different colors. This is a somatic mutation that may also be passed on in the germ line,16,概 念：,基因突变：基因组DNA分子中发生碱基的增添、缺失或改变而引起的基因构造的改变，进而引起遗传表型的改变。,一、概 念 与 分 类,17,Illustrations of five types of chromosomal mutations.,18,19,Cells with one additional set of chromosomes, for a total of 69 chromosomes, are called triploid,20,When an individual has two or more cell populations with a different chromosomal makeup, this situation is called chromosomal mosaicism.,21,In a balanced translocation, pieces of chromosomes are rearranged but no genetic material is gained or lost in the cell.,22,Mitochondria provide the cells energy.,23,24,基因突变指一个基因变为它的等位基因，是基因分子构造或化学组成上的改变。,染色体的构造与数目改变,25,突 变 分 类遗传信息的改变,突变,分类,碱基改变,密码效应,点突变point mutation,碱基插入突变base insert ,碱基缺失突变base deletion,同义突变synonymous mutation,错义突变missense mutation,无义突变nonsense mutation,移码突变frame-shifting mutation,26,碱基改变,点突变：DNA被化学修饰或复制时发生错配 ，使一个碱基变成另一个碱基。,碱基插入突变：DNA链中插入1个或多个碱基转座子Tn，突变后可引起DNA序列阅读框架改变。,碱基缺失突变：DNA链中1个或多个碱基发生丧失，突变后可引起DNA序列阅读框架改变。,突变分类,27,28,基因突变的,密码效应,分类,同义突变：碱基被替代后没有密码子改变，其产物,AA,序列也无变化。,错义突变：碱基序列的改变引起,AA,序列改变。,无义突变：某个碱基改变使某个,AA,的密码子成为蛋白质合成的终止密码子。,缬氨酸,G,U,A,Hb,中一条链,谷氨酸,G,A,A,29,30,基因突变的其他分类方式,形态突变,生化突变,致死突变,按突变的表型特征分类: 突变发生后出现的表型改变是多种多样的，有的可能十分微弱，需要精细的生化技术才能检测出与野生型WT)的差异，有的突变的表型效应可能如此之大，以致产生形态上的严重缺陷甚至死亡。,31,1、形态突变(morphological mutation): 突变主要影响生物体的外在可见的形态构造，故又称可见突变。如形状、大小、色泽等的改变。,2、生化突变(biochemical mutations): 突变影响生物的代谢过程。导致一个特定的生化功能的改变或丧失。,1失去功能的突变：突变事件通常是破坏性的，多数情况下，突变事件导致功能的丧失，完全丧失基因功能的突变称为无效突变(null mutation) 。通常丧失功能的突变是隐性的，有时候也可以是显性的。,2获得功能的突变:突变事件引起的遗传随机变化有可能使之获得某种新的功能。,3、,致死突变,(lethal mutation):,影响生物体的生活力，导致个体死亡的一类突变。,条件致死突变(conditional lethal mutations)：在某些条件下能成活，而在某些条件下是致死的。例如T4噬菌体的温度敏感突变型在25,时能在,E,.,coli,宿主细胞中正常生长，形成噬菌斑，但在,42,时就不能生长。,32,按发生突变的细胞分类,基因突变可以发生在体细胞或生殖细胞中，这两种突变有完全不同的后果。,体细胞,突变,生殖细胞,突变,1、体细胞突变(somatic mutations): 在保持分裂的身体组织的一个细胞发生突变，这个细胞便成为一群一样突变细胞的祖先。在发育过程中，体细胞突变事件发生的愈早，对表型的影响就愈大。体细胞突变一般不能遗传给后代。,2、生殖细胞突变(germinal mutation) ：生殖细胞突变发生在种系(germ line)中。如果突变的性细胞参与受精过程，那么突变基因就会传给下一代。最典型的例子是性连锁遗传的血友病突变在欧洲王室通过维多利亚女王在其整个家系中的遗传。,33,二、突变诱因与特点,自发性突变 DNA复制过程中偶然碱基配对出现错误 ，突变频率低 (10-9 10-10) 。,诱变剂的作用 诱变剂mutagen外源诱发突变的因素，种类繁多，突变频率高，是自然突变的100-1000倍 。主要有以下几种：,突变诱因,34,1物理因素 ：紫外线、电离辐射等。,2 生物因素 ：病毒、真菌、细菌等,3化学因素 ：,烷化剂,35,碱基类似物,:,如,5-BrU,5-BrU,引起,DNA,碱基,改变示意图,其他化学诱变剂,:,羟胺、亚硝酸盐等,36,基因突变表现出以下几个方面的普遍特征：,(一) 突变的平行性、重演性和可逆性,(二) 突变的多方向性与复等位基因,(三) 随机性生物个体发育的任何时期,体细胞突变 不遗传给后代,生殖细胞突变遗传给后代,(四) 广泛性和有害性多数,基因突变的一般特征,37,1.平行性 是指亲缘关系相近的物种因遗传根底较近似而发生相似基因突变的现象。,如小麦有早熟、晚熟的变异类型，属于禾本科的其它物种如大麦、黑麦、燕麦、水稻、玉米等同样存在这些变异类型。,2.重演性 一样的基因突变可以在同种生物的不同个体间重复发生，称为重演性。,同一基因突变在不同的个体上均可能发生。,不同群体中发生同一基因突变的频率相近。,突变的平行性、,重演性,和可逆性,38,3. 可逆性：基因突变的发生方向是可逆的。,正突变(forward mutation)：显性基因A隐性基因a ；,反突变(reverse mutation)： 隐性基因a显性基因A 。,通常认为：野生型基因是正常、有功能基因；而最初基因突变往往是野生型基因突变而丧失功能、发生功能改变，表现为隐性基因。所以反突变又称为回复突变(back mutaiton)。,通常用u表示正突变频率、v表示反突变频率，那么：,正突变u,野生型=突变型 一般 uv,反突变v,39,突变的多方向性：,指基因突变可以多方向发生，即基因内部多个突变部位分别改变后会产生多种等位基因形式。,例如：,A,基因不同部位发生改变产生突变基因,a1,、,a2,、,a3,等对,A,均表现为隐性的基因。新基因可能均是无功能的，也可能各具不同功能。这些复等位基因可以从野生型基因突变产生，也可以从其它任何一个突变基因突变产生。,突变的,多方向性,与,复等位基因,40,复等位基因,(multiple allele),：,位于同一基因位点上的多种等位基因。,在二倍体与异源多倍体中，,同一位点只能有一对基因,，最多存在两种等位基因形式；因此复等位基因的各种形式会存在于,生物群体,的,不同个体,中。,等位基因概念,41,人类红细胞外表抗原的特异性由3个复等位基因IA，IB，i决定。,其中IA，IB对i均为显性；, IA，IB间为共显性。, 3种基因两两组合可能形成6种基因型、4种红细胞外表抗原反响类型，如下表所示(其中用IO表示i)：,人类,ABO,血型的复等位基因,42,三、基因突变与疾病,人类所有疾病均可视为基因病,按照参与疾病发生过程的基因性质和来源，基因病可分为三种,：,Gene Mutations and Disease,基因型,genotype,表型,phenotype,正常,/,异常,单基因病,多基因病,获得性基因病,正常,/,异常,43,基因突变与疾病,代谢性疾病,神经肌肉系统疾病,发育缺陷,肿瘤,早老症,44,No Symptoms,Severe Symptoms,Mild Symptoms,No Symptoms,Disease Inheritance is Complex,45,Searching Disease Families,46,47,血友病突变在维多利亚女王,与其整个家系中的遗传,48,突 变 与 疾 病,Tumor / Cancer,49,早 老 症,早衰症全称早年衰老综合症，又称儿童早老症，属遗传病。Hutchinson于1886年首先报告虽然本病为一种先天遗传性疾病，但还不能确定是常染色体隐性还是显性遗传。本病为一综合征，特点为发育延迟，至婴儿时期就发生进展性老年性退行性改变。患者身体的老化过程十分快速。而罹患此病孩童的年龄很少超过13岁，大约每八百万个新生儿之中有一位患有此疾。,50,赫,-,吉综合征,(HGPS),51,日本京都大学灵长类研究所副教授大石高生的研究小组发现了年龄小但面相衰老的“早衰症猴子，并将此发现发表在了美国科学杂志上。,该小组目标通过猴子细胞制造出的人工多功能干细胞(iPS)使机体各种细胞变异，体外再现早衰症病状，以此帮助衰老研究。大石教授表示“不仅希望揭开早衰症的病理，同样想要研究人类正常衰老的课题。,52,着色性干皮病XP,着色性干皮病,( xroderma pigmentosa XP),与共济失调毛细血管扩张症一样，属,DNA,修复缺陷所致的遗传性共济失调综合征。,XP,是常染色体隐性遗传病，具有遗传异质性。 着色性干皮病是一种发生在暴露部位的色素变化，萎缩，角化与癌变的遗传性疾病，属常染色体隐性遗传病。,53,21,三体综合,症患儿,（先天愚型）,白化病患者,Duchenne,肌营养不良症（假性,肌,肥大型）,唇裂与腭裂,54,Mitochondrial Mutator Mice Validate the mtDNA Mutation Theory for Mammalian Aging,55,56,57,58,研究基因突变与疾病关系时应注意的问题,致病突变与基因多态性：基因中某种突变在人群中发生频率1%，属于基因多态性，该突变为中性突变。发生频率80%而受到普遍欢送，光是2021年的前9个月就有超过400篇发表的论文中用到这个产品。,81,多位点定点突变,在改造酶的活性或者动力学特性，研究蛋白之间的相互作用位点等研究过程中，单点突变不能满足实验的需要，重复进展单点突变也非常浪费时间。因而Stratagene公司又推出了QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis kit。最多一次实验可以引入5个定点突变。原理就是准备多个带突变的引物同方向，对同一单链模版，退火后全部突变引物不超过5个都结合在同一环状单链模版，PfuTurbo聚合酶延伸，碰到下一个引物就停顿，各片断经连接成环，和单链模版组成杂和环，DpnI消化双链模版，也消化杂和环中的模版，只留下新合成的带多个突变的单链环mutant ssDNA，得以转化，形成双链质粒。资料说明，引入3个定点突变的效率为60%，5个定点突变的效率为30%。得到的其他质粒是带有较少定点突变的质粒。这样，一次实验可以得到不同数目突变的质粒，对于研究蛋白质构造和功能的关系也是有用的。,82,PCR,定点突变,_,重叠延伸PCR诱变,试验概要：扩增的DNA片段在预设突变处重叠(2次PCR)，再与两 个与原始片段互补的侧翼引物进展第3次PCR,特点：需两个突变诱导引物，两个侧翼引物，3次PCR。诱变率极高,大引物PCR定点诱变,试验概要：两轮PCR，2个侧翼引物，其中一个为预设突变引物，第一轮PCR后，大引物不需纯化，第一轮退火温度较低，第二轮较高72,特点：简单，经济，平均诱变效率可达80,83,PCR,原理示意图,84,PA,5,PA,5,PA,5,PA,5,PA,5,PA,5,PA,5,PA,5,PB,5,PC,5,PA,5,PB,5,PA,5,PC,5,5,5,PCR-1,PCR-1,PCR-2,PCR-2,混合，变性 ，退火,重叠延伸,PCR,定点突变,85,5,5,5,5,PB,5,PC,5,5,5,PCR-3,DNA,聚合酶,86,87,大引物,PCR,定点诱变,5,3,5,3,引物,2,引物,3,PCR,产生大引物,引物,1,突变体,PCR2,88,89,五、突变的检测,限制性片段长度多态性restriction fragment length polymorphism，RFLP,单链构象多态性 single-strand conformation,polymorphism ,SSCP ,等位基因特异性PCR allele specific PCR ,毛细管电泳法capillary electrophoresis,测序sequencing,DNA 芯片chip,90,PCR-RFLP: 多聚酶链反响(PCR)-限制性片段长度多态性 (Restriction fragment length Polymorphism，RFLP),原理：PCR产物限制性内切酶切多态性分,析，DNA发生重排后，酶切位点发生改变。,优点：具有分辩率高，无需标记,重复性好，,简便快速直观等。主要用于核酸变异性分析,与比较, 微生物的分群分型分亚型，癌基因,分析，遗传病的诊断等。,局限：只能应用突变引起限制性酶切位点改变,的情况下，一次只能完成一个特定位点突变,筛选，检测效率低。,限制性片段长度多态性,91,PCR-RFLP,原理示意,92,聚合酶链反响一单链构象多态性 PCR-SSCP,原理：是将经扩增的DNA片段经过变性处理，形成单链，由于序列不同，单链构象就有差异，在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳的迁移率不同，通过与标准物的比照，即可检测出有无变异。,刚建立时是将同位素掺入PCR扩增的产物中，通过放射自显影显示结果。后用银染取代同位素显示DNA带型，大大降低了本钱，具有经济、快速、灵敏等特点。1993年起用EB染色法显示DNA带型，使得SSCP操作更简单，更经济，更迅速。,单链构象多态性,93,94,在引物设计中将3端和/或附近设计一碱基，使其仅能与突变型或野生型一样正链引物或互补反链引物，从而只扩增突变型或野生型基因，根据扩增带的有无进展突变纯合子、杂合子或野生型的判断。,M 1 2 3,左图,AS-PCR,检测两个基因突变位点。,M-Marker,，,1, 2-,正常组，,3-,突变组,等位基因特异性PCR (AS-PCR),根据PCR产物的有无直接进展突变分析的方法。,95,1、高效毛细管电泳技术简介,毛细管电泳(capillary electrophoresis)又称高效毛细管电泳(high-performance capillary electrophoresis, HPCE)，是20世纪80年代中期问世的一种高效液相别离法，是经典电泳技术与现代微柱别离相结合的产物。是离子或荷电粒子以电场为驱动力,在毛细管中按其淌度或/和分配系数不同进展高效、快速别离的一种电泳新技术。,2、高效毛细管电泳技术根本原理,最根本的高效毛细管电泳仪器如下图：,毛细管电泳根本仪器构造示意图,HV. 高压电源(030kV)； C. 毛细管；E. 电极槽；Pt. 铂电极；D. 在柱检测器；S. 样品； DA. 数据采集处理系统,高效毛细管电泳High Perfor-mance Capillary Electrophoresis,96,DNA突变分析与DNA排序 Analysis of Nucleic Acids and Sequence of DNA,CGE模式别离碱基对相差1000倍的DNA图谱,Separation by Electro-osmotic Flow,97,基因芯片gene chips),DNA芯片 (DNA chips),DNA微阵列DNA microarray),将数以万计的DNA探针按照一定的顺序排列固化于支持物外表上，产生二维DNA高密度的分子探针阵列，然后与标记的样品进展杂交，再利用计算机控制的信号产生、识别与图象处理系统进展结果分析来实现对生物样品快速、并行、高效地检测。,基因芯片技术是分子生物学、信息科学、材料科学、微加工技术、光学检测技术、计算机技术等多学科相互结合的产物。,基因芯片技术检测基因突变,98,DNA,方阵的构建,芯片制作,硅片、玻璃片、瓷片或聚丙烯膜、尼龙膜等支持物,带标记,样品,DNA,或,mRNA,的准备,分子杂交,杂交图谱的检测和分析,计算机控制的信号产生、,识别与图象处理系统,二维,DNA,高密度,的分子探针阵列,生物样品快速、并行、高效地检测,通常是荧光标记,PCR,扩增,99,基因芯片突变检测原理示意,DNA,芯片,100,High-throughput gene expression analysis,101,DNA,测序,DNA,测序：,测序,PCR,产物直接测序法被视为突变,检测的,金,标准和筛查方法的定性诊断方法 。,102,Technical Concerns,103,国际人类基因组单体型图方案,International HapMap Project,104,谢谢,105,谢谢！,