聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验六,聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段,一、实验目的和要求,通过本实验学习和掌握PCR基因扩增的原理和操作方法，并深刻理解PCR基因扩增技术在DNA操作中的重要性。,PCR用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。每个循环包个三个步骤，即，首先加热到94,-95使模板DNA变性,接着将反应液冷却到某一温度,使引物与它的靶序列发生退火,此后,退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。如此反复进行变性、退火和延伸这一循环。由于一轮扩增产物又充当下一轮扩增的模板，所以每完成一个循环，就使目的DNA产物增加一倍。,二、实验原理,2）PCR 反应系统的组成,PCR反应系统的组成主要包括：,模板DNA、引物、dNTP、Taq DNA聚合酶、缓冲液。,引物：,要扩增模板DNA，首先要设计两条引物,实际上就是两段与待扩增靶DNA序列互补的寡核苷酸片段，两引物间距离决定扩增片段的长度，两引物的5端决定扩增产物的两个5末端位置。由于引物是决定PCR扩增片段长度、位置和结果的关键， 因此，引物设计也就更为重要。,引物的设计：,长度一般最低不少于,16,个核苷酸，而最高不超过,30,个核苷酸，最佳长度为,18,21,个核苷酸。有时可在,5,端添加不与模板互补的序列，如限制性酶切位点等，以完成基因克隆和其它特殊需要。,两个引物之间不应发生互补，特别是在引物,3,端，即使无法避免，其,3,端互补碱基也不应大于,2,个碱基，否则易生成“引物二聚体”或“引物二倍体”（,Primer,dimer,）。,(G+C,）,%,含量,:,引物的组成应均匀，尽量避免含有相同的碱基多聚体。两个引物中（,G+C,）,%,含量应尽量相似。,引物内部应避免内部形成明显的次级结构，尤其是发夹结构（,hairpin structures,）。,引物在PCR反应中的浓度,一般在1M之间。浓度过高易形成引物二聚体且产生非特异性产物。一般来说用低浓度引物经济、特异，但浓度过低，不足以完成30个循环的扩增反应，则会降低PCR的产率。,引物退火温度,决定PCR特异性与产量；温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。一般可根据引物的（G+C）%含量进行推测，一般试验中退火温度Ta(annealing temperature)比扩增引物的融解温度Tm(melting temperature)低5，可按公式进行计算：,Ta = Tm - 5= 4(G+C) + 2(A+T) -5,其中A，T，G，C分别表示相应碱基的个数。,引物延伸温度,的选择取决于DNA聚合酶的最适温度。一般取7075，在72时酶催化核苷酸的标准速率可达35100个核苷酸/秒。每分钟可延伸1kb的长度，其速度取决于缓冲溶液的组成、pH值、盐浓度与DNA模板的性质。所以根据扩增片段长度的不同来设计引物延伸的温度。对于1kb以上的DNA片段，可根据片段长度将延伸时间控制在17min。,dNTP（dATP,dTTP,dCTP,dGTP）,在PCR反体系中dNTP终浓度高于50mM会抑制Taq酶的活性，使用低浓度dNTP可以减少在非靶位置启动和延伸时核苷酸错误掺入，高浓度dNTPs易产生错误掺入，而浓度太低，势必降低反应物的产量。PCR常用的浓度为50200M，不能低于1015M。四种dNTP的浓度应相同，其中任何一种浓度偏高或偏低，都会诱导聚合酶的错误掺入，降低合成速度，过早终止反应。,Taq DNA聚合酶:,Taq DNA聚合酶最早是从嗜热水生菌中提纯出来的。典型PCR反应混合物中，常用范围为14U/100l。由于DNA模板的不同和引物不同，以及其它条件的差异，,Taq DNA聚合酶,的用量亦有差异，酶量过多会导致非特异产物的增加。,模板,模板的种类,：单、双链DNA或RNA都可以作为PCR的样品。若起始材料是RNA，须先通过逆转录得到第一条cDNA,对于模板的用量:,基因组DNA：50-100 ng,质粒DNA: 5-10 ng,模板变性温度,是决定PCR反应中双链DNA解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链DNA模板，PCR也就不会启动。变性温度低则变性不完全，DNA双链会很快复性，因而减少产量。一般取9095。样品一旦到达此温度宜迅速冷却到退火温度。DNA变性只需要几秒种，不需要时间过久；反之，在高温时间应尽量缩短，以保持DNA聚合酶的活力，加入Taq DNA聚合酶后最高变性温度不宜超过95。,PCR缓冲液:,用于PCR的标准缓冲液为1050mM的Tris HCl缓冲液（）和1.5mM MgCl,2,。在72时，反应体系的pH值将下降1个单位，接近于。二价阳离子的存在至关重要，影响PCR的特异性和产量。实验表明，Mg,2+,优于Mn,2+,，而Ca,2+,无任何作用。Mg,2+,过量易生成非特异性扩增产物，Mg,2+,不足易使产量降低。首次使用靶序列和引物结合时，都要把Mg,2+,浓度调到最佳，其浓度变化范围为110mmol/L。,PCR循环次数,常规PCR循环次数一般为2540个周期。一般是循环次数过多，非特异性背景严重，复杂度增加。当然循环反应的次数太少，则产率偏低。所以，在保证产物得率前提下，应尽量减少循环次数。,3）PCR扩增过程,在微量离心管中加入适量缓冲液、微量模板DNA、四种脱氧单核苷酸（dNTP）和耐热Taq聚合酶及两个合成DNA引物，并有Mg,2+,存在。其循环的温度取决于引物的Tm值、模板的种类以及聚合酶的耐热性。,(1)变性阶段 加热使模板DNA在高温下（90-95）变性，双链解链；,(2)退火阶段 降低溶液温度，使合成引物在低温（3570,一般低于模板Tm值的5左右），与模板DNA互补退火形成部分双链；,(3)延伸阶段 溶液反应温度升至中温(72)，在 Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条双链在解链和退火之后延伸为两条双链。,三. 实验仪器及材料,PCR仪、台式离心机、灭菌的微量离心管、凝胶电泳系统等,TaKaRa Taq,(5U/,l),10PCR Buffer (Mg,2+,Plus),dNTP Mixture (each 2.5 mM),模板DNA,引物（Forward primer and Reverse primer, 10,M,),四、实验步骤,1、设计PCR反应程序,94预变性2 min后开始以下循环,94 30 sec,49 30 sec 35 cycles,72 30 sec,72 5 min；,4 冷却恒定。,2、在薄壁管中，依次加入以下各成分:,ddH,2,O:,19.875,l,10buffer: 2. 5,l,dNTPs(2.5,mM,),0.5,l,Forward primer (10,M,),: 0.5,l,Reverse primer (10,M,),: 0.5,l,Taq DNA polymerase (5U/,l,),: 0.125,l,Template DNA(20ng/,l,): 1.0,l,总体积 25,l,3、混匀后，离心2-3秒，将PCR薄壁管放入PCR仪的样品槽中，按START键，启动PCR仪。,五、结果分析,采用琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物的量、引物扩增的特异性。并可根据标准DNA的量粗略计算PCR产物的总量。,