生物制药第八章多肽与蛋白质类药物2

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第八章 多肽与蛋白质类药物,三、干扰素,干扰素,(Interferon,，,IFN),最早是由英国科学家,Isaacs,和,Lindemann,于,1957,年在研究病毒干扰现象时发现的。,1965,年发现了白细胞干扰素，,1969,年发现了致敏细胞干扰素。,3.1,干扰素的定义,1980,年，国际干扰素命名委员会对干扰素下的定义为：,干扰素是一种在同种细胞上具有广谱抗病毒活性的蛋白质。,现在，一般指脊椎动物细胞受干扰素诱生剂作用后合成的一类具有细胞功能调节作用的蛋白。,3.2,分类,干扰素在整体上不是均一的分子，可根据其来源细胞不同，分为,白细胞干扰素,(IFN-),、类淋巴细胞干扰素,(IFN-,与,IFN-,的混合物,),、成纤维细胞干扰素,(IFN-),、,T,细胞干扰素,(IFN-),等几类。,IFN,型干扰素又以其结构不同再分为,IFNb,、,IFN,和,IFNb,等亚型。,3.3,干扰素的作用,抑制病毒等细胞内微生物的增殖；,抗细胞增殖，,通过作用于巨噬细胞、,NK,细胞、,T,淋巴细胞、,H,淋巴细胞而进行免疫调节；,改变细胞表面的状态，使负电荷增加，组织相容性抗原表达增加；,增加细胞对双链,DNA,的敏感性。,3.4,传统方法生产干扰素,传统方法生产工艺流程：利用血库血大量制备人血细胞干扰素。,工艺过程及控制要点, 分离灰黄层,取新鲜血液,(,一般每份,400ml),，加入,ACD,抗凝剂，离心后分离出血浆，小心吸取灰黄层。每份血可吸取,1315ml,，放置,4,冰箱中过夜。,氯化铵处理,每份灰黄层加入,30ml,缓冲盐水，再加入,9,倍体积量的冷的氯化铵溶液,),，混匀，,4,放置,10min,，然后在,4,离心,(8000 r/min) 20min,。,小心弃去上清液，再用,9,倍量的氯化铵液重复处理,1,次，溶解残存的红细胞。,取沉淀的白细胞并悬于培养液中，置于冰浴，取样作活细胞计数，用预温的培养液稀释成每毫升含,10,7,个活细胞。,启动诱生,取稀释的细胞悬液加入白细胞干扰素，使其最后浓度为,100,g/ml,置,37,水浴搅拌培养,2h,。, 正式诱生,启动后的白细胞加入仙台病毒,(,在,10,天龄鸡胚中培养,4872h,，收获尿囊液,),使其最后浓度为每毫升,100150,血凝单位，在,37,搅拌培养过夜。, 收获,将培养物离心,(2500 r/min) 30min,，吸取上清液即得粗制干扰素。,纯化,将粗制人白细胞干扰素加入硫氰化钾，用,2mol/L,盐酸调节，离心弃去上清液，得沉淀,1,。沉淀,1,加入原体积,1/5,量的冷乙醇,(94,),，离心弃沉淀得上清液,1,。上清液,1,用盐酸调节，离心弃去沉淀，再调至，离心，得上清液,2,和沉淀,2,。沉淀,2,加入原体积,1/50,量的甘氨酸,-,盐酸缓冲液,(pH=2),溶解，检测，得,IFN1,。上清液,2,调节,pH,值至，离心弃去清液，得沉淀,3,。沉淀,3,加入原体积,1/50,量的，硫氰化钾,(pH=8),溶解，,pH,值降至，离心得上清液,3,和沉淀,4,。,沉淀,4,加原体积,l/25000,量的溶解，调至，对,PBS(pH=7.3),透析，过夜，离心，收集上清液，检测，得,IFN-B,。上清液,3,中加盐酸使,pH,值降至，离心，得沉淀,5,。沉淀,5,加入原体积,1/5000,量的,pH=8,、溶解，加,NaOH,调节，对,PBS(pH=7.3),透析过夜，离心收集上清液，检测，得,IFN-A,。每份灰黄层约能制备,100,万单价的纯化干扰素。,此法特点是一次纯化量大，回收率高于,60,；经济，简便，易于普及。效价可达,1.210,8,U/ml,，比活,2.210,6,U/mg(,蛋白,),。,IFN-A,中干扰素含量占回收干扰素的,82,，比活也比较高。,IFN1,的比活较低,510,4,U/mg (,蛋白,),，一般可作外用滴鼻剂或点眼剂等。,3.5,基因工程干扰素的生产,1973,年,Cohen,将两种不同的,DNA,分子进行体外重组，并用大肠杆菌表达，使大量、廉价制备单组分干扰素成为可能。,1980,年和,1982,年利用基因工程成功地获得了,IFN-,、,IFN-,和,IFN-,的,cDNA,，标志着第二代干扰素的诞生。,1987,年，,3,种干扰素的生产开始工业化，并大量进入市场。,克隆及基因文库的构建,干扰素的基因文库构建一般是用诱导剂对可以产生干扰素的肿瘤细胞株进行,诱导，从中取出,mRNA,，通过相应的引物对干扰素的,mRNA,进行,逆转录,-PCR,扩增,，将其与一定的质粒相连接后用合适的宿主菌进行培养、扩增即可。,以从,Namalva,细胞中克隆,IFN-,、,为例。,将,Namalva,细胞,用,Senda,病毒诱导,后从上清中用酚,提取,mRNA,，通过,oligo(dT),纤维素柱纯化及,5,20,(W/V),蔗糖密度梯度离心,25000r/min 20 h,后,取,618S,的组分,。用逆转录酶合成第一条互补链后用,DNA,聚合酶,合成第二条链，用核酸酶,S1,切成平头末端后,5,20,(W/V),蔗糖密度梯度离心进行纯化，取大于,600 bp,的组分。,将,g,平头末端,cDNA,用末端转移酶加,15,个,dC,，并将,2,g,质粒,pBB322,在,Pst,位点线性化，用末端转移酶加,15,个,dG,，再将两者连接，利用这种方法可产生新的,Pst,位点，利于从载体上再次切下,cDNA,。将产生的质粒转化大肠杆菌,HB101,后，用微量板培养。合成,引物,5-CCTTCTGGAACTG- 3,，,该序列是,IFN-,、,最长的不间断保守序列，用其作引物可同时调出,IFN-,、,。,在,T4,激酶的作用下，用,-32P-ATP,对其进行标记，并用,Sephadex G-25,进行纯化。用,cDNA,作为引物对其进行延长，并再用,Sephadex G-50,进行纯化，使可得到标记后的,cDNA,。,将微量板上的菌落转移到纤维素膜上，当菌落直径长到,2mm,后与事先分离的末端标记的,cDNA 37,杂交,2d,。然后用,50,甲酰胺、,0.2SSC(1SSC,为，柠檬酸钠,),室温,洗膜,3h,。在上述杂交液中加入,50,g/ml poly(U),、,10,g/ml poly(I)poly(C),进行杂交，用,50,甲酰胺、,1SSC,洗脱后在,室温干燥,，并于,-70,曝光，检测,细胞中质粒与,cDNA,杂交的情况。,为进一步检测转入的质粒的准确性，还要用菌落与原始诱导细胞中的,DNA,进行杂交。,经过以上两次杂交筛选的菌落，还要对其产物进行定性。,如产物为干扰素，则说明所建立的文库可供以后基因的调取使用。,基因文库的调用,从构建好的噬菌体文库中调用,IFN,基因，可以用,32,P,标记的,DNA,探针,与噬菌体文库进行,Southern,印迹,，探针可以是根据,IFN,的编码序列人工合成的一段,DNA,短链或其他种属的,IFN,外显子编码序列。由于,IFN,的种属特异性，因此印迹的条件不能太严格，这种方法可以用人,IFN-,的全部外显子从噬菌体文库中调出鼠,IFN-,的基因。,表达方法,鼠,干扰素的抗病毒活性主要位于氨基酸序列上的,1040,位、,78107,位、,123166,位的,A,、,B,、,C,区,，尤其是位于,78,和,79,位的氨基酸对抗病毒活性十分重要。,人,IFN-1,的,121136,位,对抗病毒活性作用较大，,人,IFN-,的,N,端,10,个氨基酸也是保持其活性所必需的。,嵌合表达,的干扰素往往优于单一干扰素。,IFN-,的表达,用家蚕核型多角病毒,BmNPV,体外感染的家蚕传代细胞株,BM-N,通过噬菌斑法纯化得到,BmNPV,的,T3,亚型。利用从感染脂肪体,mRNA,制得的,cDNA,为探针，对其多角蛋白序列进行检验，其中的,EcoR,片段及的,Hind,片段可与探针杂交，将的,EcoR,片段克隆到,pBR322,中，产生,质粒,pBmE36,。对其用,Hind ,酶切，得到片段，其中含有多角蛋白全部序列，将该片段插入,pUC9,的,Hind,位点，产生质粒,p9H18,。,将,p9H18,用,EcoR,切后于,50U BAL 31,外切核酸酶缓冲液中,23,水浴,10min,，更换缓冲液，并加入倍体积的终止反应。,将截短的,p9H18,片段用,Hind,酶切，并通过琼脂糖凝胶电泳分离的,Hind ,平头末端片段，将其插入,pUC9,即,p9B310,的,Hind-Sma,位点。,另外，将,pBmE36,的的,Hind ,片段连接到,pUC8,上，得到质粒,p8H225,，用,EcoR,及,Aat,切，得含有多角蛋白基因下游基因的片段，将其连接列,p9H18,的的,EcoR-Aat,片断上，产生杂交质粒,p89B310,，它在启动子上游含有多聚接头,(EcoR,、,BamH,、,Sma,、,Sal,、,Pst,位点,),。,将从基因文库中用,183bp,探针调出的在,ATG,后含有,Sma,位点,(,即有序列,CCCGGGATG),的,IFN-J,基因片段连接到,p89B310,上，使构建成质粒,pIFN2B310,。,将,pIFN2B310,与病毒基因组,DNA,便可共转染,BM-N,细胞系或家蚕幼体，即可得到重组病毒,BmIFN2B310,、用两个噬菌斑单位的病毒感染,310,6,个,BM-N,细胞或用,50,l 310,5,个噬菌斑单位的病毒溶液注入家蚕幼体，培养,24h,后收集培养液使可得到干扰素。,3.6,基因工程干扰素的生产工艺,制备基因工程,-,干扰素的工艺流程如下：,下面以基因工程人干扰素,b,为例说明其生产过程。,发酵,a,生产种子,人干扰素,b,基因工程菌,SW-IFN-b,E,coli-DH5,。质粒用,P,L,启动子，含氨苄西林抗性基因。,b,种子培养基,1,蛋白胨、酵母提取物、,NaCl,。,c,种子摇瓶培养,在,4,个,1000mL,三角瓶中，分别装入,250mL,种子培养基，分别接种人干扰素,b,基因工程菌，,30,摇床培养,10h,，作为发酵罐种子使用。,d,发酵培养基,1,蛋白胨、酵母提取物、,NH,4,Cl,、,NaCl,，,Na,2,HPO,4,、,CaCl,2,、,KH,2,PO,4,、,MgSO,4,、葡萄糖、,50mg/ml,氨苄西林、少量消泡剂。,e,发酵 用,15L,发酵罐进行发酵，发酵培养基的装量为,10L,，,pH,，搅拌转速,500 r/min,，通风比为,11m,3,(m,3,min),，溶氧为,50,。,30,发酵,8h,，然后在,42,诱导,23h,即可完成发酵。同时每隔不同时间取,2ml,发酵液，在,10000 r/min,离心除去上清液，称菌体湿重。,产物的提取与纯化,a,提取 离心,去上清液，,得湿菌体,。,湿菌体重新悬浮于磷酸缓冲液,(pH,7.0),中，于,冰浴,条件下进行,超声破碎，离心,30min,，取沉淀,。,室温搅拌抽提,2h,，离心，,取上清液,。,用磷酸缓冲液,(pH,7.0),稀释，加二硫基苏糖醇至，,4,搅拌,15h,，,15000 r/min,离心,30min,，除去不溶物。,上清液经截流量为,10,4,相对分子质量的中空纤维,超滤器浓缩,，将浓缩的人干扰素,b,液经过,Sephadex G-50,分离,，层析柱,(2cm100 cm),先用,20mmol/L,磷酸缓冲液,(pH,7.0),平衡，上柱后用同一缓冲液,洗脱,分离，收集人干扰素,b,部分，经,SDS-PAGE,检查。,b,纯化 将,Sephadex G-50,柱分离的人干扰素,b,组分，再,经,DE-52,柱,(2cmcm),纯化,，人干扰素,b,组分上柱后,用含，的,20mmol/L,磷酸缓冲液,(pH,7.0),分别洗涤,，收集含人干扰素,b,的洗脱液。全过程蛋白质回收率为,20,25,，产品不含杂蛋白、,DNA,及热原质。干扰素,b,含量符合要求。,4,、白细胞介素,4.1,白细胞介素（,interleukin,，,IL,）又称白细胞间素，简称白介素。,白细胞介素是指由活化的单核,-,巨噬细胞及淋巴细胞等所产生的一类细胞因子,，它作用于淋巴细胞、巨噬细胞或其他细胞，负责信号传递，联络白细胞群的相互作用。在细胞的活化、增殖和分化中起调节作用。白细胞介素与相应细胞的结合，这种连续的细胞因子与细胞间相互作用，可以扩大和调节免疫应答。,白细胞介素,2(IL-2),于,1983,年克隆成功。,IL-2,是一种糖蛋白，含,133,个氨基酸；分子量为,15,35kD,，无抗原特异性，可在经激活后的,T,细胞培养上清液中收集。,IL-2,在,pH,29,范围内稳定，,56,加热,1h,仍具有活性，但,6530min,即丧失活性,。在,4mol/L,尿素溶液中稳定，对,2-,巯基乙醇还原作用不敏感。,对各种蛋白酶均敏感,，对,DNA,酶和,RNA,酶不敏感。,在人,IL-2,的第,58,位、,105,位、,125,位是半胱氨酸,(Cys),残基，其中第,58,位和,105,位的两个半胱氨酸间形成,分子内二硫键,，这对,IL-2,保持其生物活性是必不可少的。,第,125,位的,Cys,呈游离态,，很不稳定，在某些情况下可与,58,位或,105,位的巯基形成错配的二硫键，从而使,IL-2,失去活性。,图,5-7,人,IL-2,基因结构、,IL-2mRNA,和,IL-2,分子,4.2,白细胞介素的制备,IL-2,的传统制备工艺,(1),工艺流程,(2),工艺过程及控制要点,诱生,用鸡瘟病毒和,PHA,联合刺激人外周血白细胞，,37,培养。,病毒灭活和固液分离,用,6mol/L HCl,调节,pH,，再用,6mol/L NaOH,调回到,pH,，离心除去变性杂蛋白。,硫酸铵分级沉淀,取上述离心后的培养上清液，加饱和硫酸铵至,35,饱和度，,4,静置,4h,，离心弃去沉淀。上清液补加固体硫酸铵至,85,饱和度，,4,静置,24h,，离心，收集沉淀。, 除盐,将沉淀溶于,10mmol/L PBS,中,(,内含,2,正丁醇和,0.15mol/L NaCl),，,pH,。对,10mmol/L PBS(pH,6.5),透析,24h(,更换,5,次透析外液,),。,蓝色琼脂糖层析,将上述透析内液通过,Sepharose 4B,层析柱，用,200ml,起始,PBS,洗去不吸附的蛋白，再用含的,PBS,洗涤亲和柱，最后用含的,PBS,解吸,IL-2,活性组分。, 凝胶层析,将解吸的,IL-2,活性组分经,PEG(MW,6000),浓缩，再上,ACA44 Ultrogel,层析柱。用含,PEG,、,2,正丁醇和,pH,的甘氨酸的洗脱，得,IL-2,。,2,基因工程,IL-2,的制备,(1),IL-2 cDNA,克隆的制备,从,ConA,激活,的,Jurkat-,细胞,(,人白血病,T,细胞株,),取高活性,IL-2 mRNA,作为模板，,逆转录,单链,cDNA,，经末端脱氧核苷酸转移酶催化，在,cDNA,末端连接若干,dCMP,残基，再以寡聚,(dG)1218,为引物，利用,DNA,聚合酶,双链,cDNA,，经,蔗糖密度梯度离心法分离出此,cDNA,片段,。,通过,G-C,加尾法将此,cDNA,片段,插入到,pBR322,质粒,的,Pst,位点，用重组质粒,转化大肠杆菌,K12,株,X1776,，得到,IL-2 cDNA,文库。利用,mRNA,杂交,试验筛选,IL-2 cDNA,文库得到,含,IL-2 DNA,质粒的菌株,。,(2) IL-2,的表达和纯化,IL-2,基因工程菌经发酵培养和诱导表达，收集裂解菌体，,离心沉淀收集包涵体,。包涵体主要含内,IL-2,单体分子聚合而成的多聚体，不溶于水，且其中的重组,IL-2,无生物活性,。,重组,IL-2,可用,6mol/L,盐酸胍或,8mol/L,尿素使包涵体变性解聚成中分子,(,变性后的还原型,IL-2,分子仍无生物学活性,),，再利用空气氧化或用还原型谷胱甘肽,(GSH),复性,，恢复,IL-2,二硫键和正常分子结构，获得生物学活性。,b,凝胶过滤层析,将,Sephacryl S-200,柱用缓冲液,(pH,7.0),平衡过夜。上柱后，用同一平衡液洗脱，收集,IL-2,活性峰组分。,再用醋酸铵,pH,缓冲液、,2,mol/L,硫酸铜复性，得到,IL-2,纯品，纯度高于,96,，回收率约为,50,。,经鉴定，各项质量指标均符合标准，比活性超过,1.710,7,U/mg,蛋白。,