蛋白质化学生物化学

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,蛋白质化学生物化学,2,教学要求,掌握蛋白质基本组成单位,-,氨基酸的种类、基本结构及主要特点；蛋白质的分子结构（特别是空间结构）；蛋白质分子结构与生物学功能的关系；蛋白质的主要理化性质及其应用。理解各种氨基酸的结构；了解蛋白质的分类。,教学重点,氨基酸的结构、种类及主要理化性质；蛋白质的分子结构；蛋白质分子结构与生物学功能的关系；蛋白质的主要理化性质。,3,蛋白质的定义,蛋白质,(Protein,，,pr),：由,20,种,-,氨基酸按照一定的顺序，通过肽键连接而成的、,具有特定立体结构的、有活性的,生物大分子。,蛋白质是一切生物体中普遍存在的。其种类繁多，各具有一定的相对分子质量，复杂的分子结构和特定的生物功能；是表达生物遗传性状的一类主要物质。,4,C H O N S,（,50%,） （,7%,） （,23%,）,（,16%,）,（,0,3%,）,Others: P,、,Cu,、,Fe,、,Zn,、,Mn,、,Co,、,Se,、,I,蛋白质氮元素的含量都相当接近，一般在,15%,17,，平均为,16,。这是,凯氏定氮法,测定蛋白质含量的计算基础。,2.1,蛋白质的分类,蛋白质含量蛋白氮,6 .25,5,按分子的形状分类,A.,球状蛋白质,外形接近球形或椭圆形，溶解性较好，能形成结晶，大多数蛋白质属于这一类。但肌动蛋白属于球状蛋白却不溶于水。,B.,纤维状蛋白质,分子类似纤维或细棒。它又可分为可溶性纤维状蛋白质和 不溶性纤维状蛋白质。,不溶性纤维状蛋白质：大多数纤维状蛋白质属此类，如胶原蛋白、弹性蛋白、角蛋白、丝蛋白等。,可溶性纤维状蛋白质：如肌球蛋白和血纤蛋白原可溶于水。,6,2.1.2,按组成成分分类,A .,单纯蛋白质,单纯蛋白,不含有非蛋白质部分,。这类蛋白质水解后的最终产物只有氨基酸。,单纯蛋白质按其溶解性又可分为,:,清蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白精蛋白、组蛋白以及硬蛋白等,7,B.,结合蛋白质,结合蛋白是指由单纯蛋白和,非蛋白成分,结合而成的蛋白质。,这些非蛋白成分包括糖、脂、核酸、色素等，又称为辅基或配体。,糖蛋白：如细胞膜中的糖蛋白等。,脂蛋白：如血清,-,，,-,脂蛋白等。,核蛋白：如细胞核中的核糖核蛋白等。,色蛋白：如血红蛋白、叶绿蛋白和细胞色素等。,8,催化,蛋白质的一个最重要的生物学功能是作为有机体新陈代谢的催化剂,酶,。酶是蛋白质中最大的一类。,调节,许多蛋白质具有调节其他蛋白质执行其生理功能的能力 ，这些蛋白质称为调节蛋白,转运,功能是从一地到另一地转运特定的物质。,贮存,这类蛋白质是氨基酸的聚合物，生物体必要时可利用蛋白质作为提供充足氮素的一种方式。,2.1.3,蛋白质的功能,9,运动,作为运动基础的收缩和游动蛋白具有共同的性质：,它们都是丝状分子或丝状聚合体。,结构成分,蛋白质另一重要功能是建造和维持生物体的结构。,防御和进攻,免疫反应（,免疫球蛋白,）,异常功能,10,11,12,2.2,蛋白质的组成单位,氨基酸,氨基酸 （,amino acid,，,aa,或,AA,）是蛋白质水解的最终产物，是组成蛋白质的基本单位（,构件分子,）。从各种生物体内发现的氨基酸已有,180,多种，但参与蛋白质组成的常见氨基酸只有,20,种,，这,20,种氨基酸称为常见氨基酸或基本氨基酸。,13,完全水解,：,用浓酸、碱将蛋白质完全水解为氨基酸。,酸水解,：,无消旋作用，产物为,L-,氨基酸。,碱水解,：,多数氨基酸被破坏，有消旋现象。,部分水解,：,一般用酶或稀酸在较温和条件下，将蛋白质分子切断，产物为分子大小不等的肽段和氨基酸。蛋白酶,：,胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶等。,14,2.2.1,氨基酸的结构通式,氨基酸（,amino acid,简写,aa)：,蛋白质的基本组成单位，是含氨基的羧酸。,天然蛋白质由20种氨基酸组成。,-,氨基酸中,碳原子为不对称碳原子（除甘氨酸）。,1）组成蛋白质的,aa,都是,-,氨基酸 （除脯氨酸 外） ；,2）不同,aa,仅,R,链不同；,3）除甘氨酸外，其余,aa,的,-,碳原子均为不对称碳原子。,15,H,甘氨酸,CH,3,丙氨酸,L-,氨基酸的通式,R,16,构型：根据甘油醛构型确定,D,型和,L,型,1.,根据甘油醛原则确定构型,2.,自然界的氨基酸有两种构型，构型和旋光方向没有必然联系。,3.,组成蛋白质的氨基酸都是,L,型，除甘氨酸外都有旋光性。,L,AA,17,2.2.2,氨基酸的分类,二十种常见蛋白质氨基酸的分类、结构及三字符号,18,-,氨基酸结构通式,19,从营养学角度分：,必需氨基酸和非必需氨基酸,这些体内需要而又不能自身合成，必须由食物供应的氨基酸，称为,营养必需氨基酸。,人体必需氨基酸有八种：,Met Trp Lys Val Ile Leu Phe Thr,半必需氮基酸：,组氨酸、精氨酸,2.,根据是否组成蛋白质来分：,蛋白质中常见氨基酸、蛋白质中稀有氨基酸和非蛋白氨基酸。,3.,据,R,基团,化学结构,分类,：,脂肪族,A,（,16,种）,;,芳香族,A (Phe,、,Tyr,、,Trp);,杂环,(His,、,Pro),20,4.,按,R,基的极性性质可以分成,2,大类：,极性氨基酸,非极性氨基酸,丙氨酸,亮氨酸,异亮氨酸,苯丙氨酸,甲硫氨酸,色氨酸,脯氨酸,缬氨酸,丝氨酸,苏氨酸,半胱氨酸,酪氨酸,天冬酰胺,谷氨酰胺,甘氨酸,天冬氨酸,谷氨酸,赖氨酸,组氨酸,精氨酸,氨基酸,不带电荷,带负电荷,带正电荷,21,非极性,R,基氨基酸,这一组中共有,9,种氨基酸,种带有脂肪烃侧链的氨基酸,丙氨酸（,Ala,）,缬氨酸（,Val,）,亮氨酸（,Leu,）,异亮氨酸（,Ile,）,22,丙氨酸,缬氨酸,23,亮氨酸,异亮氨酸,24,b. 2,种含芳香环氨基酸,苯丙氨酸,(Phe),色氨酸,(Trp),c.,含硫氨基酸,甲硫氨酸（,Met,）,d.,亚氨基酸,脯氨酸,(Pro),e.,侧链介于极性与非极性之间,甘氨酸,(Gly),25,苯丙氨酸,色氨酸,26,甲硫氨酸（蛋氨酸）,27,脯氨酸,甘氨酸,28,极性但不带电荷的,R,基氨基酸,这一组中有,6,种,氨基酸,a.,侧链的极性是由于它们的羟基造成的,苏氨酸,(Thr),丝氨酸,(Ser),酪氨酸,(Tyr),b.R,基极性是它们的酰胺基引起的,天冬酰胺,(,Asn,),谷氨酰胺,(,Gln,),c.,由于含有巯基的缘故,半胱氨酸,(Cys),29,丝氨酸,酪氨酸,苏氨酸,30,天门冬酰胺,谷氨酰胺,31,半胱氨酸,32,带负电荷的,R,基氨基酸,这一类的是两种,酸性,氨基酸,天冬氨酸,(Asp),谷氨酸,(Glu),33,天门冬氨酸,谷氨酸,34,带正电荷的,R,基氨基酸,这一类氨基酸在,pH=7,时携带净正电荷，又叫,碱性,氨基酸,赖氨酸,(Lys),：,除,-,氨基外，在脂肪链的,位置上还有一个氨基,精氨酸,(Arg):,含有一个带正电荷的胍基,组氨酸,(His):,有一个咪唑基,35,精氨酸,赖氨酸,组氨酸,36,不常见的蛋白质氨基酸,37,非蛋白质氨基酸,：,存在于生物体内，但不组成蛋白质,的呈游离或结合态的氨基酸，约,150,种，具有多种生理功能。,（,1,）,L-,-,氨基酸的衍生物,L-,瓜氨酸和,L-,鸟氨酸是合成精氨酸的中间产物。,（,2,）,D-,-,氨基酸,D-Ala,存在于肽聚糖中，,D-Phe,是短杆菌肽,S,的组分。,（,3,）,、,、,-,氨基酸,-Ala,是泛酸的前体，,-,氨基丁酸是传递神经冲动的化学介质。,38,2.2.3,氨基酸的性质,氨基酸在结晶形态或在水溶液中，并不是以游离的羧基或氨基形式存在，而是离解成两性离子。在两性离子中，氨基是以质子化(-,NH,3,+,),形式存在，羧基是以离解状态(-,COO,-,),存在。,在不同的,pH,条件下，两性离子的状态也随之发生变化。,2),氨基酸的两性解离和等电点,1),一般物理性质,无色晶体；高熔点；溶解于水。,39,pH=,pI,+OH,-,pH,pI,+H,+,+OH,-,+H,+,pH,pI,带电荷为零,带电荷为正,带电荷为负,完全质子化,完全去质子化,两性离子,(,pK1),(,pK2),不同,pH,时氨基酸以不同的离子化形式存在！,40,氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度。,等电点,(isoelectric point, pI):,在某一,pH,的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性，,在电场中既不向阳极也不向阴极移动。,此时溶液的,pH,值,称为,该氨基酸的等电点。,氨基酸等电点的特点：,1.,净电荷数等于零，在电场中不移动；,2.,此时氨基酸的溶解度最小。,41,等电点的计算,R,-,R,+,R,由上式可知解离常数：,K,1,=,R,H,+,R,+,K,2,=,R,R,-,H,+,42,R,+,=,R,H,+,R,K,2,K,1,R,-,=,H,+,R,H,+,K,1,=,R,K,2,H,+,K,1,K,2,=,H,+,2,由此可知：,已知在,pI,时， ,R,+,= R,-,，,整理可得：,43,两边取负对数：,-,lg H,+,2,= - lg,K,1,- lg,K,2, -lg H,+, = pH,- lg,K,1,=,p,K,1,- lg,K,2,=,p,K,2, 2 pH = p,K,1,+ p,K,2,令,pI,为等电点时的,pH，,则,pI = （ p,K,1,+p,K,2,）,44,氨基酸等电点的确定：,根据,pK,值（该基团在此,pH,一半解离）计算：,等电点等于两性离子两侧,pK,值的算术平均数。,pI = ,pK,1,+pK,2,2,或（,pI = ,）,pK,2,+pK,3,2,45,酸性氨基酸、碱性氨基酸的,pI,计算：,a、,先写出其解离公式；,b、,后取兼性离子两侧基团的,p,K,值的平均值。,46,酸性氨基酸，以,Asp,为例：,47,2.,含有两个羧基的氨基酸是：,A.,丝氨酸,B.,酪氨酸,C.,谷氨酸,D.,赖氨酸,E.,苏氨酸,1.,测某一生物样品含氮量为,g，,则该样品中所含蛋白质为,A.18g B.24g C.10.25g D.64g E.25g,3.,组成蛋白质的20种氨基酸中除一个外，其它氨基酸上的,位碳原子均是不对称原子，它是：,4.,组成蛋白质的氨基酸种类不同是在于：,A.,羧基位置不同,B.,氨基位置不同 基种类不同,D.,氨基酸的旋光性不同,E.,氨基酸的组成元素不同,48,5.,在20种氨基酸中，酸性氨基酸有,和,2种，具有羟基的氨基酸是,和,，能形成二硫键的氨基酸是,。,6.,组成蛋白质的20种氨基酸中，含有咪唑环的氨基酸是,，含硫的氨基酸有,和,。,7.,下列哪种氨基酸属于亚氨基酸？,A,丝氨酸,B,脯氨酸,C,亮氨酸,D,组氨酸,8.,两性离子,指在同一氨基酸分子上含有等量的正负两种电荷，又称兼性离子或偶极离子。,49,3,）紫外吸收性质,只有芳香族氨基酸有紫外吸收能力，因其含有苯环共轭双键的,R,侧链。,酪氨酸 (,Tyr) ,max,：270nm,苯丙氨酸(,Phe) ,max,：259nm,色氨酸 (,Try) ,max,：279nm,所以，测样品280,nm,处的光吸收值，可知溶液中蛋白质浓度。此法快速简便。,50,4,） 氨基酸的化学反应,51,（,1,）与亚硝酸反应,在室温下亚硝酸能与,含游离,-,氨基,的氨基酸起反应，定量地放出氮气，氨基酸被氧化成羟酸,(,注：,含亚氨基的脯氨酸则不能与亚硝酸反应,),。,52,（,2,）与,2,，,4-,二硝基氟苯的反应,(Sanger,反应）,在,弱碱,性溶液中，氨基酸的,-,氨基很容易与,2,，,4-,二硝基氟苯（,DNFB,）,作用，生成稳定的,黄色,2,，,4-,二硝基苯基氨基酸（简写为,DNP-,氨基酸）。,53,+,DNFB,（,dinitrofiuorobenzene,）,氨基酸,弱碱中,DNP-AA(,黄色,),（,sanger,反应）,+,HF,54,（,3,）与异硫氰酸苯酯反应,（,Edman,反应）,在,弱碱,性条件下，氨基酸中的,-,氨基还可以与,异硫氰酸苯酯（,PITC,）,反应，产生相应的苯氨基硫甲酰氨基酸（,PTC-,氨基酸）。在无水酸中，,PTC-,氨基酸即环化为苯硫乙内酰脲（,PTH,），后者在酸中极稳定。,这个反应首先被,Edman,用于鉴定多肽或蛋白质的,N-,末端氨基酸。,55,+,PITC,弱碱中,(40,0,C),苯硫乙内酰脲,(PTH-AA),(,无水氢氟酸中,),H,+,苯氨基硫甲酰氨基酸（,PTC-,氨基酸）,（,Edman,反应）,56,（,4,）与丹磺酰氯反应（,DNS,）,丹磺酰氯是二甲氨基萘磺酰氯的简称,+,HCI,有荧光,57,（,5,）与茚三酮反应,茚三酮在,弱酸性,溶液中与,-,氨基酸共热，氨基酸被氧化成醛、,CO,2,和,NH,3,，最后茚三酮与反应产物氨和还原茚三酮发生作用，生成,蓝紫色,化合物。,两个亚氨基酸,脯氨酸和羟脯氨酸,与茚三酮反应形成,黄色,化合物。,OH,羟,58,NH,3,CO,2,RCHO,+,还原性茚三酮,+,(,弱酸,),加热,3H,2,0,氨基酸与茚三酮反应,水合性茚三酮,+,2NH,3,+,水合性茚三酮,还原性茚三酮,蓝紫色化合物,59,(6),与甲醛反应：氨基酸的甲醛滴定法,OH,中和滴定,60,反应特点,A.,为,-,NH,2,的反应,B.,在常温，中性条件，甲醛与,-,NH,2,很快反应，生成羟甲基衍生物，释放氢离子。,应用：氨基酸定量分析,甲醛滴定法（间接滴定）,A.,直接滴定，终点,pH,过高（,12,），没有适当指示剂。,B.,与甲醛反应，滴定终点在,9,左右，可用酚酞作指示剂。,C.,释放一个氢离子，相当于一个氨基（摩尔比,1,：,1,）,D.,简单快速，一般用于测定蛋白质的水解速度。,61,肽,： 一个氨基酸的,-,羧基和另一个氨基酸的,-,氨基脱水缩合而成的化合物。,肽键,：氨基酸之间脱水后形成的键称肽键（酰胺键）。,肽链写法,：游离,-,氨基在左，游离,-,羧基在右，氨基酸之间用,“,-,”,表示肽键。,H,2,N-,丝氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-,COOH,Ser-Leu-Phe,（,S-L-F,）,2.3.1,肽(,peptide),和肽键(,peptide bend),2.3,肽,62,肽键和肽的结构如图所示,丝氨酰 甘氨酰 酪氨酰 丙氨酰 亮氨酸,63,1,）肽键的结构特点：,肽键中的,C-N,键具有部分双键性质，不能自由旋转。所以连接在肽键两端的基团处于一个平面上，这个平面称为,肽平面,。在大多数情况下，相邻肽平面以反式结构存在。,64,C,N,C,H,a,N,C,O,C,a,0.123nm,0.132nm,0.153nm,0.147nm,C-N 0.149 nm,C=N 0.127 nm,1）肽键具高度稳定性；,2）具双键性质，不能自由转动；,3）肽单元呈平面化和刚性性质；,4）,C=O,与,NH,反式排列。,65,酰胺平面与,-,碳原子的二面角（,和,）,二面角,两相邻酰胺平面之间，能以共同的,C,为定点而旋转，绕,C-N,键旋转的角度称,角，绕,C-C,键旋转的角度称,角。,和,称作二面角，亦称构象角。,66,2,）相关名词,肽平面：参与肽键的,6,个原子被约束于一个平面上，与此相应,的,-C-CO-NH-C-,则称为肽平面。,多肽主链：在多肽链中由肽键连接的各氨基酸残基形成的长,链骨架,(C-CO-NH-C.),为多肽链的主链。,或：肽链的骨干是由肽单元重复排列而成长链，,称为主链。,多肽侧链：在多肽链中的各氨基酸残基所连接的侧链基团为多肽侧链。或：氨基酸残基的,R-,基连在主链上,成为侧链。,说明：,各种不同的肽链主链都是一样的，但侧链（,R-,基）的顺序即氨基酸的顺序各不相同 。,67,2.3.2,肽的理化性质,类似于氨基酸性质,）旋光性,）两性解离及等电点,）化学反应,双缩脲反应：含有两个或两个以上肽键的化合物,与碱性硫酸铜作用，生成蓝紫色的复合物，肽键越多颜色越深，受蛋白质特异性影响小，可用于肽和蛋白质定量测定及测定蛋白质水解程度。,68,2.3.3,天然存在的活性肽,在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白,质的亚单位。,有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在，这,类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为,活性肽,。,如：,脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽,等。,69, 谷胱甘肽,(glutathione, GSH),-,70,GSH,过氧化物酶,H,2,O,2,2GSH,2H,2,O,GSSG,GSH,还原酶,NADPH,+,H,+,NADP,+,谷胱甘肽在体内参与氧化还原过程，作为某些氧化还原酶的辅因子，作用是保护巯基酶，或防止过氧化物积累。,71,抗生素类多肽,短杆菌肽,S,72,体内许多激素属寡肽或多肽,激素类多肽,73,均为9肽，第3位和第8位氨基酸不同。,催产素,使子宫和乳腺平滑肌收缩，具有催产和促使乳腺排乳作用。,加压素,促进血管平滑肌收缩，升高血压，减少排尿。,催产素和加压素,肽类的营养价值高于游离氨基酸和完整蛋白质，其原因有以下几个方面：,一般来说，小分子肽的抗原性要比大的多肽或原型蛋白质的抗原性低；,与转运游离氨基酸相比，机体转运小分子肽通过小肠壁的速度更快；,肽类的渗透压比游离氨基酸低，因此可提高小分子肽的吸收效率，减少渗透问题；,小分子肽还具有良好的感官,/,味觉效应。,74,75,2.4,蛋白质的结构,构型,（,configuration,）,：,一个有机分子中各个原子特有的固定的空间排列。这种排列不经过共价键的断裂和重新形成是不会改变的。构型的改变往往使分子的光学活性发生变化。,指在立体异构体中原子或取代基团在空间的取向。,构象（,conformation,）,：,指这些原子或取代基团在单键旋转时可能形成的不同的立体异构体。,蛋白质的构象：,指蛋白质特有的空间结构。,蛋白质的空间结构：,是指蛋白质分子中所有原子在三维空间的排列分布和肽链的走向。,76,蛋白质结构的组织层次,蛋白质的结构层次,一级结构,空间结构,二级结构,三级结构,四级结构,超二级结构,结构域,77,定义,1969,年，国际纯化学与应用化学委员会（,IUPAC,） 规定：,蛋白质的一级结构指蛋白质多肽,链,中氨基酸的排列顺序，包括二硫键的位置。,在基因编码的蛋白质中，这种序列是由,mRNA,中的核苷酸序列决定的。一级结构中包含的共价键（,covalent bonds）,主要指肽键（,peptide bond）,和二硫键（,disulfide bond）,。,一级结构的,意义,2.4.1,蛋白质的一级结构（化学结构）,78,N-,端,N-,端,C-,端,C-,端,牛胰岛素的一级结构,79,80,蛋白质分子的多肽链按一定方式折叠、盘绕或组装成特有的空间结构，亦称,高级结构,。蛋白质的高级结构即蛋白质的构象。,目前已知，一个蛋白质的多肽链在生物体内只有一种或很少几种构象，且相当稳定，这种构象称为天然构象，此时蛋白质具有生物活性。,2.4.2,蛋白质的空间结构,81,肽链的主链可看成是由被,C,a,隔开的许多平面组成的。,N,端,C,端,R,H,H,O,C,C,a,N,C,a,C,R,O,N,O,C,N,C,a,C,R,O,N,C,a,H,H,H,H,C,a,H,事实上，一个天然蛋白质多态链在一定条件下只有一种或很少几种构象，而且相当稳定。,82,化学键,共价键,次级键,肽键,二硫键,氢键,疏水键,盐键,范德华力,一级结构,二、三、四级结构,三、四级结构,蛋白质分子中的共价键与次级键,83,84,（,1,）蛋白质的二级结构,蛋白质的二级结构（,secondary structure）,指肽链主链不同区段通过自身的相互作用，形成氢键，沿某一主轴盘旋折叠而形成的局部空间结构,。,是蛋白质结构的构象单元，,它只涉及肽链主链的构象及链内或链间形成的氢键。,85,绝大多数天然蛋白质都是,右手螺旋。,每隔个氨基酸残基螺旋上升一圈；每圈间距，即每个氨基酸残基沿螺旋中心轴上升，旋转,100,。,-,螺旋结构的主要特点：,1)-,螺旋,(-helix),86,每个氨基酸残基的,N-H,都与前面第四个残基,C=O,形成,氢键,。,87,螺旋体中所有氨基酸残基侧链都伸向外侧；链中的全部,C=O,和,N-H,几乎都平行于螺旋轴,氢键几乎平行于中心轴。,88,*,R,为,Gly,时，由于,C,a,上有,2,个氢，使,C,a,-C,、,C,a,-N,的转动的自由度很大，即刚性很小，所以使螺旋的稳定性大大降低。,R,基大,(,如,Ile),也不易形成,-,螺旋。,*,-,螺旋遇到,Pro,就会被中断而拐弯，因为脯氨酸是亚氨基酸且有刚性的环状结构。,* 带,相同电荷的氨基酸残基,连续出现在肽链上时，螺旋的稳定性降低。,侧链在,a,-,螺旋结构的影响：,*,R,基较小,且不带电荷的氨基酸利于,-,螺旋的形成,如多聚丙氨酸在,pH7,的水溶液中自发卷曲成,-,螺旋。,89,2)-,折叠,(-pleated sheet),-,折叠是由两条或多条伸展的多肽链靠氢键联结而成的锯齿状片状结构。,在,-,折叠中，,-,碳原子总是处于折叠的角上，氨基酸的,Rnm,。,90, ,-,折叠结构的氢键主要是由两条肽链之间形成的；也可以在同一肽链的不同部分之间形成。几乎所有肽键都参与链内氢键的交联，氢键与链的长轴接近垂直。,-,折叠有两种类型。一种为平行式，即所有肽链的,N-,端都在同一边。另一种为反平行式，即相邻两条肽链的方向相反。后者更为稳定。,91,（,a,）平行式,（,b,）反平行式,92,3) -,转角（,-turn,）,也称,-,回折，存在于球状蛋白中。其特点是肽链回折,180,，使得氨基酸残基的,C=O,与第四个残基的,N-H,形成氢键。第二个氨基酸通常是,pro,。,-,转角都在蛋白质分子的表面，多数为亲水氨基酸组成。,93,94,4),无规则卷曲（,non-regular coil,）,又称自由卷曲，是指没有一定规律的松散肽链结构，但是其结构是明确而稳定的，常常构成酶的功能部位。,无规卷曲常出现在,a-,螺旋与,a-,螺旋、,a-,螺旋与,-,折叠、,-,折叠与,-,折叠之间。它是形成蛋白质三级结构所必需的。,95,无规则卷曲,96,1,.,下列哪一项不是蛋白质,-,螺旋结构的特点？,A,天然蛋白质多为右手螺旋,B,肽链平面充分伸展,C,每隔3.6个氨基酸螺旋上升一圈。,Dnm.,2.,关于,-,折叠片的叙述，下列哪项是错误的？,A-,折叠片的肽链处于曲折的伸展状态,B -,折叠片的结构是借助于链内氢键稳定的,C,有的,-,折叠片结构都是通过几段肽链平行排列而形成的,Dnm,97,（,3,）超二级结构和结构域,1,）,超二级结构,概念：,指蛋白质中相邻的二级结构单位（,-,螺旋或,-,折叠或,-,转角,）组合在一起，形成有规则的、在空间上能够辨认的,二级结构组合体,。,超二级结构的基本类型：,、 ,、,98,超二级结构类型, , ,99,2）结构域(,domains),概念：多肽链在超二级结构基础上进一步绕曲折叠而成的紧密的相对独立的三维实体称结构域。具有部分生物学功能。,Wetlaufer,于1973年根据对蛋白质结构及折叠机制的研究结果提出了结构域的概念。,100,101,结构域,1,结构域,2,-,折叠,-,转角,二硫键,-,螺旋,卵溶菌酶的三级结构中的两个结构域,102,结构域有时也称功能域，功能域是指有功能的部分。功能域可以是一个结构域，也可以是两个或两个以上的结构域组成。,从动力学的角度耒看,，一条长的多肽链先折叠成几个相对独立的区域，再缔合成三级结构要比直接折叠成三级结构更合理。,从功能的角度耒看,，酶蛋白的活性中心往往位于结构域之间，因为连接各个结构域的常常是一条松散的肽链，使结构域在空间上摆动比较自由，容易形成适合底物结合的空间。,103,（,4,）蛋白质三级结构,概念：指蛋白质多肽链上所有原子在三维空间的分布。,较小蛋白质分子：,多为单结构域，即三级结构；,较大蛋白质分子：,由2或2个以上结构域结合成三级结构。,在三级结构中，,具有极性侧链基团的,AA,残基几乎全部在分子的表面,而非极性残基则被埋于分子内部,不与水接触,.,而形成疏水的核心。,104,三级结构的特征：,含多种二级结构元件；,有明显的折叠层次；是紧密的球状或椭球状实体；,分子表面有一空穴,(,活性部位,),可结合配体；,亲水侧链暴露在分子表面，疏水侧链埋藏在分子内部。,实例,：,肌红蛋白,105,肌红蛋白三级结构,106,肌红蛋白,是1957年由,John Kendrew,用,X,射线晶体分析法测定的有三维结构的第一个蛋白质。,功能：,哺乳动物肌肉中储存氧并运输氧。,典型的球形蛋白质，高度折叠成紧密结构，疏水氨基酸残基大部分埋藏在分子内部，极性残基在表面。肌红蛋白中有8条,-,螺旋。由多肽的折叠形成的疏水空隙内是,血红素辅基,，通过肽链上的,His,残基与肌红蛋白分子内部相连，它对肌红蛋白的生物活性是必需的（与,O,2,结合）。,107,（,5,）蛋白质的四级结构,四级结构,是指由两个或两个以上具有三级结构的多肽链通过非共价键聚合而成的特定构象的蛋白质分子。,其中每条,具有三级结构的,多肽链称为,亚基。,通常,亚基,只有一条多肽链，但有的,亚基由两条或多条多肽链组成,，这些多肽链间多以,二硫键,相连，亚基单独存在时无生物学活性。,亚基是指一条多肽链或以共价链连接在一起的几条多肽链组成的蛋白质分子的最小共价结构单位。,一般来说具有四级结构的蛋白属于寡聚蛋白。,1),定义,108,有多个亚基；,稳定性主要靠亚基间的,非共价键,维持；,亚基单独存在时无生物活性或活性很小，,只有通过亚基相互聚合成四级结构后，蛋,白质才具有完整的生物活性；,亚基间具有,协同性,和,别构效应,。,2,）蛋白质四级结构的特点,109,3,）,血红蛋白的结构与功能,血红蛋白的结构特点：,a.,是四个亚基的寡聚蛋白，,574,个,AA,残基，分子量为,65000,。,b.,是由相同的两条,链和两条链组成四聚体,22,c.,链由,141AA,残基组成， 链由,146AA,残基组成。,四条肽链的三级结构与肌红蛋白相似，各自内部有一个血红素辅基。,血红蛋白的功能：,存在于动物血液的红细胞中，具有运输,O,2,和,CO,2,的功能；血红蛋白还能和,H,+,结合，从而可以维持体内,pH,。,110,111,一氧化碳（,CO,）也能与血红素,Fe,原子结合。由于,CO,与血红素的结合能力是,O,2,的,200,倍，因此，人体吸入少量的,CO,即可完全抑制肌红蛋白或血红蛋白与,O,2,的结合，从而造成缺氧死亡。,急救方法是尽快将病人转移到富含,O,2,的环境中（如新鲜空气、纯氧气或高压氧气），使与血红素结合的,CO,被,O,2,置换出来。,112,2.,维持蛋白质二级结构稳定的主要作用力是：,A,盐键,B,疏水键,C,氢键,D,二硫键,3.,维持蛋白质三级结构稳定的因素是：,A,肽键,B,二硫键,C,离子键,D,氢键,E,次级键,4.,蛋白质是生物大分子，但并不都具有四级结构。,5.,在具有四级结构的蛋白质分子中，每个具有三级结构的多肽链是一个亚基。,1.,下列关于蛋白质结构的叙述，哪一项是错误的？,A,氨基酸的疏水侧链很少埋在分子的中心部位,B,带电荷的氨基酸侧链常在分子的外侧，面向水相,C,蛋白质的一级结构在决定高级结构方面是重要因素之一,D,蛋白质的空间结构主要靠次级键维持,113,2.5.1,蛋白质一级结构与功能的关系,（,1,）同功蛋白质一级结构的种属差异性,细胞色素,C,是真核细胞线粒体内膜上一种含,Fe,的蛋白质，在生物氧化中起传递电子的作用。通过植物、动物和微生物等数百种生物的细胞色素,C,一级结构的研究表明：,亲缘关系越近，,AA,顺序的同源性越大；,尽管不同生物间亲缘关系差别很大，但与细胞色素,C,功能密切相关的,AA,顺序却有共同之处，即,保守顺序,不变。,2.5,蛋白质分子结构与功能的关系,114,生物,与人不同的,AA,数目,黑猩猩,0,恒河猴,1,兔,9,袋鼠,10,牛、猪、羊、狗,11,马,12,鸡、火鸡,13,响尾蛇,14,海龟,15,不同生物与人的,Cytc,的,AA,差异数目,金枪鱼,21,角饺,23,小蝇,25,蛾,31,小麦,35,粗糙链孢霉,43,酵母,44,115,35个不变的,AA,残基，是,Cyt C,的生物功能所不可缺少的。其中有的可能参加维持分子构象；有的可能参与电子传递；有的可能参与,“,识别,”,并结合细胞色素还原酶和氧化酶。,细胞色素,c,分子的空间结构,不变,的,AA,残基,116,胰岛素分子中氨基酸残基的差异部分,胰岛素来源 氨基酸残基的差异部分,A5 A6 A10 B30,人,Thr Ser Ile Thr,猪,Thr Ser Ile Ala,狗,Thr Ser Ile Ala,兔,Thr Ser Ile Ser,牛,Ala Ser Val Ala,羊,Ala Gly Val Ala,马,Thr Gly Ile Ala,抹香鲸,Thr Ser Ile Ala,117,（,2,）蛋白质一级结构的变异与分子病,分子病,指蛋白质分子中由于,AA,排列顺序与正常蛋白质不同而发生的一种遗传病,(,基因突变造成的,),。,镰刀形贫血病：,病因：血红蛋白,AA,顺序的细微变化,-,链,N,端氨基酸排列顺序,1 2 3 4 5 6 7 8,Hb-A,（正常人）,Val-His-Leu-Thr-Pro-,Glu,-Glu-Lys,Hb-S,（患 者）,Val-His-Leu-Thr-Pro-,Val,-Glu-Lys,镰刀形贫血病：,病人体内血红蛋白的含量乃至红细胞的量都较正常人少，且红细胞的形状为新月形，即镰刀状。此种细胞壁薄，而且脆性大，极易涨破而发生溶血；再者，发生镰变的细胞粘滞加大，易栓塞血管；由于流速较慢，输氧机能降低，使脏器官供血出现障碍，从而引起头昏、胸闷而导致死亡。,118,正常红细胞,镰刀形红细胞,正常红细胞与镰刀形红细胞的扫描电镜图,谷氨酸在生理,pH,值下为带,负电荷,R,基氨基酸,，而缬氨酸却是一种,非极性,R,基氨基酸,，就使得,HbS,分子表面的荷电性发生改变，引起等电点改变，,溶解度降低,，使之不正常地聚集成纤维状血红蛋白，致使红细胞变形成镰刀状,输氧功能下降,细胞脆弱易溶血,.,镰刀型贫血病,119,2.5.2,蛋白质构象与功能的关系,蛋白质高级构象破坏，功能丧失,实例：核糖核酸酶的变性与复性,蛋白质在表现生物功能时，构象发生变化（,变构效应,）,实例：血红蛋白的变构效应和输氧功能,120,核糖核酸酶变性与复性作用,Native ribonuclease,Denative reduced ribonuclease,Native ribonuclease,8,M urea and,-mercapotoethanol,Dialysis,变性,复性,121,血红蛋白输氧功能和构象变化,O,2,Hb,Hb-,O,2,O,2,血红蛋白和肌红蛋白的氧合曲线,活动肌肉毛细血管中的,PO,2,0 20 40 60 80 100,肺泡中的,PO,2,Myoglobin,Hemoglobin,122,协同效应,(cooperativity),一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为,协同效应,。,如果是促进作用则称为,正协同效应,(positive cooperativity),如果是抑制作用则称为,负协同效应,(negative cooperativity),变构效应,(allosteric effect),蛋白质表现其生物学功能时，空间结构发生改变，导致整个分子的性质发生变化，这种现象称为,变构效应,。,123,蛋白质构象改变导致疾病的机理,：,有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。,这类疾病包括,：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。,124,疯牛病中的蛋白质构象改变,疯牛病是由朊病毒蛋白,(prion protein, PrP),引起的一组人和动物神经退行性病变。,正常的,PrP,富含,-,螺旋，称为,PrP,c,。,PrP,c,在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为,-,折叠的,PrP,sc,，从而致病。,PrP,c,-,螺旋,PrP,sc,-,折叠,正常,疯牛病,125,2.6,蛋白质的性质与分离、分析技术,2.6.1,蛋白质的性质,蛋白质是由氨基酸组成，因此蛋白质的性质与氨基酸相似，但由于蛋白质是由许多氨基酸通过肽键形成了大分子化合物，也就出现了一些新的性质。,（,1,）相对分子质量,Pr,为高分子有机物，分子量几千,几千万。,分子量测定方法：,渗透压法；超速离心法；凝胶过滤法；聚丙烯酰胺,电泳法等。,126,最准确可靠的方法是,超离心法,（,Svedberg,于1940年设计）：蛋白质颗粒在2550,10,4,g,离心力作用下从溶液中沉降下来。,沉降系数（,s）：,单位（,cm）,离心场里的沉降速度。,s,= ,v,2,x,v,=,沉降速度（,dx/dt）,=,离心机转子角速度（弧度/,s）,x,=,蛋白质界面中点与转子中心的距离（,cm）,沉降系数的单位常用,S，,1S=110,-13,（s）,127,（,2,）两性电离与等电点,蛋白质在等电点,pH,时为两性离子。,128,蛋白质的等电点：,当溶液在某一定,pH,值时，使某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中即不向阳极移动也不向阴极移动，此时溶液的,pH,值即为该蛋白质的等电点（,pI,）。,在等电点时，,蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。,在,pH,低于等电点的溶液中，,蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动；,在,pH,高于等电点的溶液中，,蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动。这种现象称为蛋白质,电泳,。,电泳,带电粒子在电场中移动的现象。,129,电泳,蛋白质在等电点,pH,条件下，不发生电泳现象。,利用蛋白质的电泳现象，可以将不同,带电性质,和,分子大小,、,所带电荷量,不同的蛋白质分子,进行分离纯化。,根据蛋白质净电荷的差异来分离蛋白质的一种方法是,电泳法,。,130,（,3,）蛋白质的变性（,denaturation),1,）概念,：天然蛋白质受物理或化学因素的影响，其共价键不变，但分子内部原有的高度规律性的空间排列发生变化，致使其原有性质发生部分或全部丧失，称为蛋白质的,变性,。,分子内部,结构,改变：次级键破坏；,分子表面结构改变：疏水基团暴露。,主要标志,：,生物功能的丧失。,除去变性因素，在适当条件下变性蛋白质可恢复其天然构象和生物活性，这种现象称为蛋白质的复性（,renaturation）,。,131,核糖核酸酶变性与复性作用,天然状态，有催化活性,非折叠状态，无活性,8,M,尿素,-,巯基乙醇,变性,天然状态,S-S-,键恢复,而且是正确配对,复性,去除尿素及,巯基乙醇,132,2,）,变性蛋白在性质上的变化,溶解度降低；,二、三级结构破坏，但肽键未破坏，故其组成和分子量不变；,化学反应基团增加；,失去螺旋结构，对称性下降，结晶能力丧失；,对蛋白酶水解敏感性增加；,生物活性降低或全部丧失。,变性蛋白质分子互相凝集为固体的现象称,凝固,。,133,3）使蛋白质变性的理化因素,物理因素,：加热、激烈振荡、超声波、,-,射线、紫外线等；,化学因素：,A .,酸碱破坏盐键；,B .,乙醇、丙酮等有机溶剂进入,pr,间隙与之形成氢键，破坏,pr,分子内各弱键；,C .,浓脲溶液、盐酸胍及某些去垢剂(,SDS),可破坏氢键，暴露巯基，强化酸碱的破坏作用。,134,如：,NH3,、,COO, 、,OH,、,-SH,、,-CONH-,等，它们都具有高度的亲水性，当与水接确时，极易吸附水分子，使蛋白质颗粒外围形成一层水化膜，将颗粒彼此隔开，不致因互相碰撞凝聚而沉淀。,（,4,）蛋白质胶体性质,由于蛋白质分子量很大，在水溶液中形成直径,1-100nm,之间的颗粒，已达到胶体颗粒范围的大小，因而具有胶体溶液的通性。,蛋白质的水溶液能形成稳定的亲水胶体的原因：,蛋白质表面含有许多极性基团。易与水结合形成水膜。,蛋白质是两性电解质，在非等电状态时，相同蛋白质颗粒带有同性电荷，,与周围的反离子构成稳定的,双电层,。,使蛋白质颗粒之间相互排斥，保持一定距离，不致互相凝聚而沉淀。,蛋白质溶液由于具有,水膜,与,双电层,两方面的稳定因素，所以作为胶体系统是相对稳定的。,135,蛋白质胶体性质的应用,由于胶体溶液中的蛋白质不能通过,半透膜,，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。,透析法：,以半透膜提纯蛋白质的方法叫透析法。,半透膜：,只允许溶剂小分子通过，而溶质大分子不能通过，如羊皮纸、火棉胶、玻璃纸等。,136,137,（,5,）蛋白质的沉淀,蛋白质在溶液中的稳定性是有条件的、相对的。如果加入适当的试剂使蛋白质分子处于,等电点状态,或,失去水化层,（,消除相同电荷，除去水膜,），,蛋白质胶体溶液就不再稳定并将产生沉淀。,定义：,蛋白质在溶液中靠水膜和电荷保持其稳定性，水膜和电荷一旦除去，蛋白质溶液的稳定性就被破坏，蛋白质就会从溶液中沉淀下来，此现象即为,蛋白质的沉淀作用。,138,可逆沉淀,定义：,在,温和条件下,，通过改变溶液的,pH,或电荷,状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。在沉淀过程中，,结构和性质都没有发生变化,，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液,。,可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如,等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法,等。,139,1,）,盐析,在蛋白质的水溶液中，加入大量,高浓度,的强电解质盐,如硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等，可破坏蛋质分子表面的水化层，中和它们的电荷，因而使蛋白质沉淀析出，这种现象称为,盐析,。,而,低浓度,的盐溶液加入蛋白质溶液中，会导致蛋白质的溶解度增加，该现象称为,盐溶,。,盐析的机理,：,破坏蛋白质的水化膜，中和表面的净电荷,。,盐析法是最常用的蛋白质沉淀方法，该方法不会使蛋白质产生变性,。,各种蛋白质的亲水性及荷电性均有差别，因此不同蛋白质所需中性盐浓度也有不同，只要调节中性盐浓度，就可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分散沉淀析出，这种方法称为,分段盐析,。,140,2,）等电点沉淀,用弱酸或弱碱调节蛋白质溶液的,pH,处于等电点处,，,使蛋白质沉淀。,机理,：,破坏蛋白质表面净电荷,。,141,3,）有机溶剂沉淀法,：,在蛋白质溶液中，加入能与水互溶的有机溶剂如乙醇、丙酮等，蛋白质产生沉淀。,有机溶剂沉淀法的机理,：,破坏蛋白质的水化膜,。,注意：,有机溶液沉淀蛋白质通常在,低温,条件下进行，否则有机溶剂与水互溶产生的溶解热会使蛋白质产生变性。,142,不可逆沉淀,定义：,在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也,破坏了蛋白质的结构和性质,，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。,加热沉淀,（次级键）,强酸碱沉淀,（影响电荷）,重金属盐沉淀（,Hg,2+,、,Pb,2+,、,Cu,2+,、,Ag,2+,）,某些酸类或生物碱试剂沉淀,143,（,6,）蛋白质的颜色反应,双缩脲反应,酚试剂反应,蛋白质定量、定性,茚三酮反应,常用测定方法,考马斯亮蓝法,另外还有：,黄色反应、米伦氏反应、乙醛酸反应,等。,144,反应 试剂 颜色 反应基团,双缩脲反应,NaOH,稀,CuSO,4,紫或粉,2肽以上,Millon,反应,Millon,试剂,红色,酚基,黄色反应,HNO,3,及,NH,3,黄、橘黄,苯环,乙醛酸反应,乙醛酸,H,2,SO,4,紫红,吲哚,坂口反应,次氯酸钠,萘酚，,NaOH,红色,胍基,Folin,试剂反应,CuSO,4,磷钨酸-钼酸,兰色,酚基,茚三酮反应,茚三酮,紫兰色,游离氨羧基,145,(7),蛋白质的分析测定,蛋白质含量测定,蛋白质纯度鉴定,常用电泳法、,HPLC,法、免疫学方法等,蛋白质相对分子质量的测定,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳法、凝胶过滤法,146,凯氏定氮法,消化：含氮的有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢二元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。,蒸馏：浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸气将产生的氨蒸馏到一定量。在一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中原来氢离子浓度降低。,滴定：用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来氢离子浓度为止。,最后根据所用标准酸的摩尔数（相当于待测物中氨的摩尔数）计算出待测物中的总氮量。,147,双缩脲法,双缩脲（,NH,2,一,CO,一,NH,一,CO,一,NH,2,）,在碱性溶液中能与,Cu,2+,产生紫红色的络合物，这一反应称为,“,双缩脲反应,”,。蛋白质分子中的肽键也能与铜离子发生双缩脲反应。溶液颜色的深浅与蛋白质含量成正比，而与蛋白质的氨基酸组成及相对分子质量无关。故双缩脲反应常用于谷物蛋白质含量的测定。,148,福林（,Folin,）,-,酚试剂法,蛋白质（或多肽）分子中含有酪氨酸，酪氨酸中的酚基能将酚试剂中的磷钼酸及磷钨酸还原成蓝色化合物（钼蓝和钨蓝的混合物）。蓝色的深浅与蛋白质浓度成正比，可用比色法在650或660,nm,处测定光吸收值，既可测定蛋白质浓度。,149,紫外吸收法,蛋白质分子中的酪氨酸、色氨酸等氨基酸残基在波长280,nm,处具有最大吸收峰。由于各种蛋白质都含有酪氨酸，且含量变化不大，因此 280,nm,处的光吸收是蛋白质的一种普遍性质。在一定程度上，蛋白质溶液在280,nm,处的光密度值与其浓度成正比关系，故可作定量测定。核酸在紫外线区也有强吸收，可通过校正加以消除，但是，测定结果还存在着一定的误差。,蛋白质（,mg/mL）（145A,280nm260nm,）,150,SDS-PAGE,电泳法测定分子量,蛋白质在,PAGE,中的电泳速度取决于蛋白质分子大小、所带电荷的量以及分子形状。而,SDS-,PAGE,电泳与此不同的是在样品及电泳缓冲液中加入了十二烷基硫酸钠,。,SDS,是一种阴离子去污剂，可使蛋白质变性并解离成亚基。当蛋白质样品中加入,SDS,后，,SDS,与蛋白质分子结合，使蛋白质分子带上大量的负电荷，这些电荷量远远超过蛋白质分子原来所带的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质之间的电荷差异。所有结合,SDS,的蛋白质,-,SDS,复合物的形状近似于长的椭园棒，它们的短轴是恒定的，而长轴与蛋白质分子量的大小成正比。这样，消除了蛋白质之间原有的电荷和形状的差异，电泳的速度只取决于蛋白质分子量的大小。,151,分子筛 凝胶过滤法,152,2.6.2,蛋白质的分离、纯化和分析,（,1,）蛋白质分离纯化的一般原则,前处理,要选择合适的材料;合适的破碎方法;合适的提取液。,分离,要方法简便，处理量大。常用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法，有时可用超过滤或凝胶过滤等方法。,纯化,主要使用各种层析、电泳，方法要精心选择，巧妙配合。后期可用结晶法。,153,（,2,）蛋白质的分离纯化方法,1,）根据分子大小不同的纯化方法,透析和超滤,A.,透析,透析是把待纯化的蛋白质溶液装在半透膜的透析袋里，放入透析液（蒸馏水或缓冲液）中进行的，透析液可以更换，直至透析袋内无机盐等小分子物质降到最小值为止。,原理：利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使