狂犬病及疫苗

,单击此处编辑母版标题样式,2020/11/3,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2020/11/3,*,狂犬病及疫苗,2020/11/3,1,狂犬病,狂犬病又称恐水症（hydrophobia）：是,狂犬病,病毒引起的一种人畜共患的中枢神经系统急性传染病。,多见于狗、狼、猫等食肉动物，人多因被病兽咬伤而感染。死亡率几乎100%。,2020/11/3,2,狂犬病毒,狂犬病病毒,(Rabies virus),是一种嗜神经性病,毒。属于,弹状病毒科 (Rhabdoviridae)、狂,犬病毒属 (Lyssavirus)。,病原学,2020/11/3,3,病原学,A .,病毒的子弹状外形；,B.,蜂窝状核衣壳（RNP）；,C.,病毒外表面双层脂质突起,2020/11/3,4,狂犬病毒,形态,子弹状，一端圆形，,另一端平凹，宽75-80nm，,长140-180nm。,2020/11/3,5,2020/11/3,6,核酸,：-ssRNA。,衣壳,：螺旋对称排列。,包膜,： M2蛋白（内层）；脂蛋白（主要成分）；,刺突,：与病毒的感染性、血凝性和毒力等相关。,结构,2020/11/3,7,结构,病毒主要编码5种蛋白：,糖蛋白（G）、核蛋白（N）、聚合酶（L）、磷蛋白（NS）和膜蛋白（M）。,糖蛋白能与乙酰胆碱受体结合，决定了病毒具有嗜神经性，产生中和抗体有保护作用；,核蛋白抗原，是荧光免疫法检测的靶抗原，有助于临床诊断。,2020/11/3,8,狂犬病病毒的动物感染范围较广，主要在野生动物及家畜中自然感染与传播。,在易感动物或人的中枢神经细胞、主要是,大脑海马回的锥体细胞,中增殖时，可以在胞质内形成一个或多个、圆形或椭圆形、直径为20nm30nm的嗜酸性包涵体，称,内基小体（Negri body）,。通过检查动物或人脑组织标本中的内基小体，可以辅助诊断狂犬病。,培养特性,2020/11/3,9,Negri body of rabies virus in infected neuron,(intra-cytoplasmic),2020/11/3,10,内基小体为圆形或卵圆形嗜酸性小体，大,小为120um，一般在510um之间，见于,胞浆内任何部位或树突中，可有一个或多,个，其形状与所在部位有关。包涵体所在细,胞可无明显病变，或可仅有尼氏体减少。,2020/11/3,11,病原学,来源于世界各地的狂犬病病毒分离株的抗原性不同。根据病毒表面,糖蛋白G,的抗原性差异，狂犬病病毒可分为,4个血清型,。,狂犬病病毒的主要抗原包括:,糖蛋白G,:病毒表面，刺激机体产生中和抗体、血凝抑制抗体和细胞免疫应答；,核蛋白N,：病毒核心，属特异性抗原，能够以核蛋白(RNP)的形式诱生保护性的细胞免疫应答，但刺激机体不能产生保护性抗体。,抗原性,2020/11/3,12,狂犬病毒的血清型,1、血清1型：典型的狂犬病毒株，犬类传播。,2、血清2型：Lagos蝙蝠株，分离自尼日利亚和中非共和国。,3、血清3型：Mokola病毒株，分离自尼日利亚田鼠,4、血清4型：Duvenhage病毒株，分离自南非狂犬病人,5、血清2型：EBL1蝙蝠株，分离自乌克兰蝙蝠,6、血清2型：未定型株，分离自乌克兰蝙蝠,2020/11/3,13,病原学,野毒株（wild strain）或街毒株（street strain）:,从自然,感染的动物体内分离到的病毒。,固定毒株（fixed strain）:,将野毒株在家兔脑内连续传,代后，病毒对家兔致病的潜伏期可以随传代次数,的增加而逐渐缩短；传代至50代左右时，潜伏期,可由原来的4周左右缩短为4天6天；但继续进行,传代，潜伏期不再缩短。这种变异的狂犬病病毒,被称为固定毒株（fixed strain） .,其,重要特点:,是对家兔的致病性增强，对人或犬的,致病性明显减弱；并且从脑外途径对犬进行接种,时，不能侵入脑神经组织引起狂犬病。,变异,2020/11/3,14,病毒抵抗力不强。,对热敏感，60经30min或1002min即可灭活。,易被,紫外线、甲醛、,强酸、强碱、乙醇、乙醚等灭活。,肥皂水、离子型或非离子型去垢剂亦有灭活作用。,在冰冻干燥下可保存数年。,病原学,抵抗力,2020/11/3,15,传染源,发展中国家主要传染源是病犬，由病犬传播者约占8090%，其次为猫和狼。一般认为，动物发病前5天唾液中可含有病毒；,发达国家野生动物如狐狸、食血蝙蝠、臭鼬和浣熊等逐渐成为重要传染源；,无症状带毒的犬、猫等兽类亦有传染性；,流行病学,2020/11/3,16,BAT,armadillo,2020/11/3,17,Cat,fox,raccoon,dog,2020/11/3,18,传播途径,被患病动物咬伤、抓伤，病毒自皮肤损伤处进入人体；,粘膜也是病毒的重要侵入门户，如眼结合膜被病兽唾液沾污等；,也可由染毒唾液污染外环境（石头、树枝等）后，再污染普通创面而传染。,流行病学,2020/11/3,19,流行病学,易感人群,人群普遍易感，兽医、动物饲养者与猎手尤易遭感染；,接触家犬或野兽机会多的农村青壮年和儿童居多，男性多于女性。,流行特征,温血动物传染病，分布广泛，以家犬密度大的地方多见；,全年发生，冬季发病率略低。,2020/11/3,20,2006，1至2007，5狂犬病发病情况图,2020/11/3,21,20022006狂犬病发病情况,2020/11/3,22,发病机理,人被病犬咬伤,病毒随犬唾液经伤口进入人体,（病毒在入侵部位的肌肉细胞中增殖）,通过神经肌肉接头侵入周围神经,细胞-细胞间传递形式,神经节直至中枢神经系统（脑组织中病毒迅速增殖扩散）,沿传出神经传至唾液腺及其他组织。,2020/11/3,23,临床表现,潜伏期,人被狂犬咬伤，发病率为30%60%。,咬伤后能否发病，与受伤部位、伤势程度及病畜唾液中的病毒量有关,.,短的5日，长的达10余年，多数13个月；,儿童、头面部咬伤、伤口深、扩创不彻底者潜伏期短；,2020/11/3,24,典型临床表现,：,前驱期,发热、头痛、乏力、周身不适等症状，对痛、声、光等刺激较敏感，并有咽喉紧缩感。约5080%病人伤口部位及其附近有麻木或蚊走感；,兴奋期或痉挛期,处于兴奋状态，如极度恐惧、烦燥，对水声、风等刺激非常敏感，易于引起发作性咽肌痉挛、呼吸困难等。部分患者出现特殊的恐水症状，在饮水、见水、流水声或谈及饮水时，可引起严重咽喉肌痉挛，称为“,恐水症”（hydrophobia）,。随后，部分病人出现精神失常、定向力障碍、幻觉、谵妄等。病程进展很快；,麻痹期,痉挛减少或停止，出现弛缓性瘫痪，神志不清，最终因呼吸麻痹和循环衰竭而死亡。,2020/11/3,25,体液免疫,：,感染后机体产生,中和抗体,。有中和游离 状态的病毒、阻断病毒进入神经细胞内的作用。,接种疫苗所获得的防止发病效果可能与此 有关。但抗体对已进入神经细胞内的病毒难以 发挥作用。同时也可能产生免疫病理反应而加 重病情。,细胞免疫,：,杀伤性T淋巴细胞,特异性地作用于病毒的蛋白抗原，引起病毒溶解；单核细胞产生的,IFN和IL-2,具有抑制病毒复制和抵抗病毒攻击的作用。,免疫性,2020/11/3,26,预防,加强动物管理，控制传染源,大力宣传养狗及其他野生动物的危害；,野犬应尽量捕杀；,家犬应严格进行登记和疫苗接种；,狂犬或患狂犬病的野兽应立即击毙焚毁或深埋，严禁剥皮吃肉。,2020/11/3,27,预防,狂犬病暴露后预防,（2006年10月卫生部发布狂犬病暴露后处置工作规范（试行）,2020/11/3,28,2020/11/3,29,伤口处理,立即用肥皂水、消毒剂或单用清水反复清洗伤口，时间不低于15分钟，伤口深时要用注射器灌注反复冲洗；,然后用酒精反复消毒，最后涂上碘酒；,伤口不止血、不包扎、不缝合；,使用人抗狂犬病免疫球蛋白（HRIG）10 IU/kg或马抗狂犬病免疫血清20 IU/kg在伤口底部和周围行局部浸润注射；同时以相同剂量做臂部肌肉注射。,必要时使用抗菌药物；伤口深时还要使用破伤风抗毒素。,2020/11/3,30,预防接种,接种,狂犬疫苗,是预防发病的重要措施。即所谓的,预防性治疗,。由于狂犬病的潜伏期长，从被咬伤到发病一般经过几十天或几个月，在此期间尽早接种疫苗可免于发病。,严重咬伤者，除应给予,高效价免疫血清,进行被动免疫外，仍需要接种狂犬疫苗，可收到更佳效果。,2020/11/3,31,疫苗注射,暴露前预防：适用于高危人群如兽医、山洞探险者、相关实验人员、动物管理员，0、7、21天各2ml肌肉注射；23年加强注射一次；,暴露后预防：,咬伤后注射越早越好,一般患者接种5次，0、3、7、14、30各接种一次；,严重咬伤患者接种10次，前6天每日一针，10、14、30、90天各1针。,1年内再次咬伤者，0、3天各接种一次；13年内再次咬伤，0、3、7各接种一次；超过3年，重新接种。,注意疫苗储存在2,。,2020/11/3,32,疫苗的历史,公元七世纪： 印度的佛教徒以喝蛇毒的方式获得对毒蛇的免,疫应为最早的预防免疫的记载；,公元十世纪： 据1932年在天津出版的中国医学史记 载，中国已有种痘的记载，但无法考证；,公元十六世纪： 据1742出版的 医宗金鉴记载，至少在,1695年中国已确有用干的天花痂粉吹鼻种痘、用棉花蘸天花痂粉塞鼻和健康小孩穿几天出天 花小孩内衣等方式种痘免疫的记载.,公元十八世纪：英国Edward Jenner 接种牛痘预防天花,2020/11/3,33,疫苗的历史,公元十九世纪： 七十年代法国 Louis Pasteur研究减毒鸡霍 乱菌1885年Louis Pasteur 狂犬病疫苗的试验成功；,公元十九世纪末: 美国 Salmon, Smith,法国 Chamberlain和 Roux分别研究的细菌疫苗: 伤寒、霍乱和鼠疫菌苗；,公元二十世纪： 1927年上市的卡介苗，法国Calmette和 Guerin从牛分离的结核菌通过牛胆汁传代获得的减毒株制成的疫苗，1936年Wilson Smith,和 Thomas Francis分别在禽胚中研 制成功灭活的甲型流感疫苗。,2020/11/3,34,疫苗的历史,人用疫苗发展一览表,减毒活疫苗 全病原体灭活疫苗 纯化蛋白/多糖疫苗 基因工程疫苗,十八世纪 天花疫苗，1798,十九世纪 狂犬病疫苗，1885 伤寒疫苗1896,霍乱疫苗1896,鼠疫疫苗1897,二十世纪 BCG（结核）1927 百日咳，1926 （全细胞） 白喉，1923,早 期 黄热疫苗， 1935 流感疫苗，1936 破伤风，1927,立克次体，1938,二次大战 脊灰（口服） 脊灰（ 注射） 肺炎球菌 乙型肝炎（酵母,以 后 麻疹、腮腺炎 狂犬病疫苗（新） 脑膜炎球菌 或哺乳细胞表达）,乙型脑炎 乙型脑炎 流感嗜血杆菌 百日咳类毒素,风疹、水痘 甲肝疫苗 乙型肝炎（血浆,腺病毒 出血热 森林脑炎,轮状病毒 伤寒（Vi多糖）,伤寒 流感嗜血（结合）,百日咳（无细胞）,2020/11/3,35,狂犬疫苗的应用,一、狂犬疫苗的种类,二、狂犬疫苗的接种程序,a. 暴露前程序,b. 暴露后程序,c. 其它免疫程序,2020/11/3,36,狂犬疫苗的接种程序,1 .,暴露前免疫程序,标准免疫程序,0 7 28天,0 28 56天,2020/11/3,37,暴露后免疫程序,标准免疫程序,0 3 7 14 28,标准加强免疫程序,0 3 7 14 28 90,首剂加倍程序,2 1 1,皮内多点免疫程序,8 4 1 1,2 2 2 0 1 1,2020/11/3,38,非标准免疫程序（暴露后）,2 1 1免疫程 0 7 21 （天）,上臂三角肌注射：,几种疫苗接种后的抗体反应,疫苗 第七天,抗体 iu/ml 血清阳转率,HDV 0.5 (0-6.7) 17/26 (65%),PCEC 1.2 (0.1-21.9) 19/23 (83%),PVRV 1.0 (0.1-2.3) 18/23 (78% ),2020/11/3,39,非标准免疫程序（暴露后）,8-4-1-1免疫程序 0 7 21,91（天）,注射时间 上 臂 肩胛 大腿 腹壁,（天） 三角肌 上 方 内侧,0, , ,7,28 ,91,每点0.1ml,2020/11/3,40,非标准免疫程序（暴露后）,皮内多点免疫程序,2-2-2-0-1-1,注射时间,0 3 7 14 28 96（天）, ,2 2 2 0 1 1,2020/11/3,41,狂犬疫苗接种后的效果评价,血清中和抗体：,WHO：血清中和抗体 0.5IU/ml,方法：,小鼠脑内测定法 (,MNT ),荧光灶抑制试验 (,RFFIT ),ELISA、,乳胶凝集试验等只作参考,2020/11/3,42,狂犬疫苗的种类,WHO,推荐的狂犬疫苗,HDCV人二倍体细胞培养疫苗,PCEC 鸡胚细胞培养疫苗,PDEV 纯化鸭胚疫苗,PVRV 纯化Vero 细胞疫苗,我国生产的狂犬疫苗,PHKC地鼠肾,细胞培养疫苗,PVRV 纯化Vero 细胞疫苗,2020/11/3,43,各类人用狂犬病疫苗,疫苗种类 毒种 纯化方法 生产国家,-,原代地鼠肾细胞 aG株 柱纯析 中国,原代狗肾细胞 AM 末精制 荷兰,原代鸡胚细胞 Fluly-LEP-C25 超速离心 德国,原代鸡胚细胞 Fluly-HEP 超速离心 日本,胚鸭细胞 PM,株 梯度密度离心 瑞士,人胚肺二倍体细胞 PM株 超速离心 英国瑞士,（,WI-38 ） 德国法国美国,人胚肺二倍体细胞,SAD 超速离心 加拿大,(MRC-5),Vero细胞 PM 梯度密度离心 法国,aG株 CTN-1株 中国,-,2020/11/3,44,佐剂疫苗和无佐剂疫苗 免疫效果的比较,采血时间 抗体GMT 抗体阳转率,IU/ml(血清) (%),天 佐剂 无佐剂 佐剂 无佐剂,7 0.1 0.4 8.1 45.2,14 1.2 2.3 59.5 100,45 16.5 17.5 100 100,2020/11/3,45,我国生产狂犬疫苗的企业,北京生物制品研究所,V,沈阳安迪生物高科技公司,H,V,上海生物制品研究所,V,长春长生实业股份公司,H,V,长春生物制品研究所,H,V,辽宁生物工程公司,H,V,兰州生物制品研究所,H,V,大连高新生物技术公司,H,武汉生物制品研究所,V,吉林亚太,H,宁波荣安生药业公司,V,河北省医药技术公司,H,常州延申生物药业,V,河南普新生物工程有限公司,H,海南生物制品研究所,V,2020/11/3,46,生产用细胞用于疫苗生产的优缺点,原代细胞： 地鼠、沙鼠肾细胞、鸡胚细胞,优点：,来源容易，这些动物的繁殖快，尤其是地鼠是哺乳动 物中繁殖,最快的动物之一；,4-5周出现性周期，怀孕期15-18天，哺乳期20,天，产后24-36小时即可发情排卵，一年可产8-10胎。,制备的细胞没有遗转物质的突变，比较安全，不必考虑疫苗中的,残余DNA；,病毒容易在这些细胞中适应。,缺点：,需要建设相应的动物房，污染环境；,制备疫苗需要宰杀大量的动物,动物容易污染细菌、病毒、寄生虫等外源物质。,大量处死动物不符合“动物论理学”要求，,2020/11/3,47,生产用细胞用于疫苗生产的优缺点,传代细胞系： Vero细胞、BHK-21,优点：,传代细胞系，几乎可以取之不竭,已经全面检定，其特性符合人用疫苗的生产，细胞库一经,建立，细胞质量可高度控制,该细胞生长条件要求不高，容易培养繁殖；,可用生物反应器大规模生产,大多数病毒能在该细胞系中复制繁殖,疫苗生产是不要动物,缺点：,由于是传代细胞系，有一定的致肿瘤性；,疫苗必须纯化，且细胞DNA含量须达到标准（10ng/剂）,目前不适合活疫苗的生产,2020/11/3,48,狂犬疫苗的质量标准,物理检查,乳白色疏松体,PH值,7.2 8.0,溶解时间, 1 分钟,硫柳汞含量 (mg/ml), 0.10,蛋白含量（ug/剂）,120,残余水份含量 % (g/g ), 3.0,残余牛血清蛋白(ng / 剂), 50,灭活试验,小鼠应健在,残余DNA含量 (ng/剂), 10,无菌试验,应无细菌生长,异常毒性试验 小鼠试验,小鼠应键在, 体重增加,豚鼠试验,豚鼠应键在, 体重增加,效力试验 (IU/剂), 2.5,热稳定试验 (IU/剂), 2.5,2020/11/3,49,狂犬疫苗中添加剂安全性问题,人白蛋白问题,人血白蛋白在疫苗中作为添加剂起到,保护和稳定疫苗的作用,我国有1亿人为乙型肝炎病毒携带者,有为数众多的丙型肝炎患者,80-100万的HIV感染者,全球几乎无AIDS患者的国家,2020/11/3,50,狂犬疫苗中添加剂安全性问题,人白蛋白:,目前人白蛋白的生产工艺为“低温乙醇法”,（,Cohn 6法）,经不同浓度的乙醇反复沉淀的 第五组分中所得，所用血源须严格反复筛查，最终产品还须经60,10小时的巴氏法专项病毒灭活，经验证该产品有可靠的安全性，国内外至今尚无使用该产品而感染,HIV、HBV、HCV等报道。,2020/11/3,51,狂犬疫苗中添加剂安全性问题,牛血清：,是细胞培养疫苗在细胞培养过程中必须的添加剂,纯化过程中已基本去除，质量标准50,n g/剂,最担心,疯牛病（,传染性海绵状脑病、,BSE,）,源于 英国的BSE愈演愈烈，已经蔓延到法国、德国、比利时等31个国家。最近日本、加拿大、韩国也相继报告了BSE,WHO ：,人及动物传染性海绵状脑病相关的医用或 其他制品的研讨会报告（1997. 3）,Report of a WHO Consultation on Medicinal and Other Products in Relation to Human and Animal Transmissible Spongiform,Encephalitis,2020/11/3,52,牛组织及体液的传染性分类,I 类 高度感染 脑脊髓（ 眼）,II,类 中度感染 脾脏、扁逃体、淋巴结、回肠、近端大,肠、脑脊液、脑垂体、肾上腺、（硬脑,膜、松果体、胎盘）,III,类 低感染性 周围神经、鼻黏膜、胸腺、骨髓、肝、,肺、胰腺,IV,类 无感染性 骨骼肌、心脏、乳腺、牛奶、血清、粪,便、肾脏、甲状腺、唾液腺、唾液、卵,巢、子宫、睾丸、附睾、胎儿组织、（初,乳、胆汁、骨骼、软骨组织、结缔组织、,毛发、皮肤、尿液）,2020/11/3,53,CJD和vCJD问题,源于英国的BSE愈演愈烈，已经蔓延到法国、德国、比利时等31个国家。BSE又与人类vCJD有关。到2002年6月，在英国已确认为vCJD病人有122人，其中113人已死亡。对113个死亡病历因果分析，89例确定是BSE感染，其他24人可能与BSE有关。,目前虽无证据表明经血、血液成分和血液制品转播vCJD，但是由于vCJD是新出现的疾病，现在就认为vCJD无传染性还为时过早。动物试验表明血液中传染因子含量低，但有传染性。而且实验证明牛BSE可以传染给羊。因此有理论上的风险。应特别关注经人血传染vCJD的可能性。,2020/11/3,54,狂犬疫苗安全性问题,（ Vero 细胞残余DNA）,质量标准,10,n g/剂,100pg,/剂,检测灵敏度 ：,1-10pg/ml,2ug (2x10,6,pg) SV40DNA可使,50%动物致瘤,为一个致瘤剂量,如100pg则为100/2 x10,6,=0.5x10,-4,致瘤剂量,如每个细胞基因组DNA为,10pg, 而一个癌基因为10Kb(约10,-5,pg ),则致瘤基因为细胞基因组的,1/10,6,，,100pg细胞DNA中含100 X10,-6,pg致瘤基因,则致瘤剂量为 10,-4,/2x10,6,=0.5x10,-10,个致瘤剂量。,一个致瘤剂量的细胞DNA10000ng .,2020/11/3,55,Vero细胞的致肿瘤性,Montagnon实验：,用裸鼠进行肿瘤实验，10,6,或10,7,细胞注射裸鼠，,同时用Hela细胞作对照,137-169代： 注射部位结节呈退行性变，全部,动物无肿瘤发生,190-210代： 注射部位结节呈进行性变，全部,动物出现肿瘤，且半数动物发生,肺和淋巴节的肿瘤转移。,结论：170代以前的细胞是安全的,2020/11/3,56,Vero细胞残余DNA的标准,Vero 细胞残余DNA,质 量 标 准：,80年代： 美国 FDA 10pg /剂,欧盟、WHO 100pg /剂,我国卫生部 100pg /剂,90年代后期： WHO 推荐为 10ng/剂,2005年版中国药典,100 pg /剂,检测灵敏度： 1-10pg/ml,2020/11/3,57,狂犬疫苗安全性问题,（ Vero 细胞残余DNA）,Melissa Duxbury的实验：,人血浆的DNA平均浓度为,250-1500ng/ml, 500ml的全血含60%的血浆， DNA浓度按1500ng/ml计，一次输入500ml的全血，侧会有450ug的DNA由静脉进入体内，经多年观察未发现与DNA相关的肿瘤发生。,接受了后来被证实为白血病的供血者的血，受血者经7年观察未发现白血病和淋巴瘤患者。,1ug的病毒致癌基因DNA可使动物发生肿瘤，,50u 的细胞致癌基因DNA不能使动物发生肿瘤。,2020/11/3,58,狂犬疫苗安全性问题,（B-丙内脂）,B-丙内脂：,* 1981年美国 Alabama州Auburn 大学的兽医学生暴,露前程序免疫接种HDCV疫苗（用B-丙内脂灭活、）,* 1983年131个学生进行加强免疫， 10天后其中20人,出现荨麻疹等较严重的副反应。,* 13人查到了抗人白蛋白IgE,* BPL-HAS,变性的,HSA,产生抗人白蛋白IgE, 出现过敏反应。,2020/11/3,59,狂犬疫苗安全性问题,（B-丙内脂）,原因：,生产工艺：,细胞培养扩增病毒时需加入人白蛋白,灭活病毒,浓缩病毒液,纯化,配制,分装,+, ,B-丙内脂 密度梯度区带离心法 添加剂,2万 / PRM、危险,冻干,成品,（有变性的BPL-HAS),2020/11/3,60,狂犬疫苗安全性问题,（B-丙内脂）,改进措施和解决办法,生产工艺：,细胞培养扩增,加毒种培养,收获病毒液,加人白蛋白,纯化,灭活病毒,配制,分装,柱层析纯化,B-丙内脂 添加剂（人白蛋白）,具有浓缩、高度纯化功能、不危险,冻干,成品,（无变性的BPL-HAS),2020/11/3,61,谢 谢！,2020/11/3,62,