理论课21第二十一讲免疫学检测原理

单击此处编辑母版文本样式,第二层,第三层,第四层,第五层,单击此处编辑母版标题样式,*,*,单击此处编辑母版文本样式,第二层,第三层,第四层,第五层,单击此处编辑母版标题样式,*,*,1,第二十一章 免疫学检测原理,第一节 免疫细胞的检测,一、免疫细胞的分离和纯化 二、淋巴细胞及亚群的检测,三、免疫细胞的功能测定,第二节 免疫分子的检测,一、免疫球蛋白的测定 二、补体测定,三、细胞因子及其受体的检测 四、黏附分子的检测,第三节 免疫学检测常用的标记技术,一、免疫荧光技术 二、放射免疫测定,三、免疫酶标技术,2,免疫学检测技术：包括细胞、分子、相关基因三个水平,细胞水平检测：根据免疫细胞膜表面表达的独特标志及特殊,功能，测定各类细胞及其亚群数量及效应，籍以了解细胞免疫,水平,分子水平检测：测定各类,Ig,、补体、,CK,及受体、黏附分子水,平及生物学活性，籍以了解各类免疫因子间的相互关系,基因水平检测：测定免疫应答相关基因的表达与调控，免疫,分子的遗传多态性及基因型别分析,3,第一节 免疫细胞的检测,一、免疫细胞的分离和纯化,依据细胞独特的表面标志、理化性质及黏附吞噬能力等差异,设计不同方法，按不同实验目的、拟分离细胞的种类、纯度和数,量等，选择方法,（一）白细胞的分离,根据红、白细胞比重、沉降速度不同分离,1,、自然沉降法：肝素抗凝外周血放置，红细胞沉降速度快，自,然分离,2,、高分子聚合物加速沉降法：明胶、右旋糖酐、甲基纤维素、,聚乙烯吡咯烷酮可使红细胞成钱串状凝集，加速沉降,4,（二）外周血单个核细胞（,PBMC,）的分离,PBMC,包括淋巴细胞和单核细胞，人,PBMC,来源于外周血，,动物大、小鼠单个核细胞来源于脾脏、淋巴结（,MNC,）。,标本：人肝素防凝外周血；鼠脾脏、淋巴结,机械研磨过,100,目网单个细胞悬液。,密度梯度离心法：红细胞和多核细胞密度为,1. 092,，,PBMC,为,，血小板为；,聚蔗糖,-,泛影葡胺（,F-H,）分层液法：,原理：,F-H,分层液密度为，将,PBMC,层加于分层液上离,心不同层次液体和细胞区带,5,（三）淋巴细胞的纯化与亚群分离,1,、去除红细胞：低渗溶解；,0.89%,氯化铵处理法,2,、去除单核、粒细胞：,PBMC ,玻璃、塑料平皿黏附去除,3,、尼龙毛柱分离法：,B,细胞易黏附尼龙毛，过尼龙毛柱可分离,T,、,B,细胞,4,、流式细胞术分选法：基本原理：流式细胞仪可快速、灵敏和,高度自动化地对单个细胞进行多参数定量测定分析，从而分选,特异性荧光抗体标记的阳性细胞,（四）单核,/,巨噬细胞的分离和收集,1,、平皿黏附分离法,2,、斑蝥敷贴法：原理：用斑蝥酒精浸出液贴敷前臂内侧皮肤，,诱发无菌皮炎，收集皮泡渗出液中来自皮下组织的,3,、硫基乙醇酸盐肉汤培养基小鼠腹腔收集腹腔渗出,6,二、淋巴细胞及亚群的检测,根据细胞表面标志鉴定淋巴细胞亚群及检测计数,1,、,T,细胞检测,1,）间接免疫荧光法：原理：抗,CD,抗体与,PBMC,结合加入荧光,素标记的羊,/,兔抗小鼠,IgG,抗体,(,荧光标记二抗,),荧光显微镜计数,2,）免疫组织化学法：原理：酶标记抗体与组织切片或细胞涂片,反应,结合加入底物酶催化底物显色普通光学显微镜检测,表面标志鉴定细胞种类、亚群,2,、,B,细胞检测,1,）膜表面免疫球蛋白（,SmIg,）检测：应用抗,Ig,抗体借助直接免,疫荧光法或免疫组织化学法检测,2,）间接免疫荧光法,同,T,细胞,7,三、免疫细胞的功能测定,（一）吞噬细胞功能测定：,1,、中性粒细胞趋化功能测定,滤膜渗透法（,Boyden,小室法）：上室加待测细胞，下室加趋,化成分，中间用微孔滤膜隔开反应滤膜清洗、固定、染色,透明普通光学显微镜观察细胞穿膜移动距离判断趋化功能,2,、中性粒细胞吞噬杀菌功能测定,NBT,（硝基蓝四氮唑还原）试验：原理：中性粒细胞吞噬杀,菌代谢释放氢摄入的,NBT,接受胞浆沉积黑色颗粒,10% NBT+,8,3,、巨噬细胞吞噬功能测定：原理：用斑蝥酒精浸出液贴敷法收,集人 ，用腹腔渗出法收集鼠 ，体外进行鸡红细胞,(,有胞,核,),吞噬实验，计算吞噬百分率、吞噬指数,4,、巨噬细胞细胞毒测定：测定 对放射性核素,51Cr,、,125IUdR,标记靶细胞,P815,的杀伤活性,51Cr,标记靶细胞：,51Cr,渗透入细胞浆，细胞破坏释放,51Cr,于上清中,125IUdR,标记靶细胞：,125IUdR,掺入细胞,DNA,，细胞破坏,酶切,DNA ,释放,125I,于细胞沉淀中,将效,/,靶按一定比例混合效,/,靶相互作用靶细胞破坏释,放核素测定上清,/,细胞沉淀放射性强度（,cpm,）按公式计算,杀伤百分率,9,（二）,T,细胞功能测定,1,、,T,细胞增生（转化）实验：原理：,T,细胞受到丝裂原刺激,增生反应形态变化淋巴母细胞：体积大，染色质疏松，核,仁明显等 丝裂原：,PHA,、,ConA,（鼠）、,PWM,等,1,）放射性核素（,3HTdR,、,125IUdR,）掺入法：原理,:,细胞增生,摄取,3HTdR/125IUdR ,测放射性强度计算转化率、刺激指数,2,）细胞能量代谢测定（,MTT,四氮唑盐比色法） ：原理：活细,胞摄入,MTT ,腺粒体作用胞内、胞周蓝黑色甲臜溶解甲臜,酶标仪检测,A,值，计算转化率、刺激指数。甲臜生成量与细胞,代谢活跃程度呈正比，间接定量分析细胞增生水平,10,2,、,T,细胞细胞介导的细胞毒实验,原理,CTL,来源：免疫动物的脾脏或腹腔渗出液；将脾细胞与刺激,细胞共育，体外诱生,CTL,刺激细胞：预处理后无增殖能力，仍保持免疫源性的细胞,检测,CTL,细胞毒活性：形态学法；,51Cr,、,125IUdR,释放法；流,式细胞术等。靶细胞为免疫用细胞,/,不处理的刺激细胞,51Cr,、,125IUdR,释放法,:,效,/,靶按一定比例混合效,/,靶相互作用靶细胞破坏释,放核素测定上清,/,细胞沉淀放射性强度（,cpm,）按公式计算,杀伤百分率,11,3,、,T,细胞功能的体内检测法,接触性超敏反应：用于研究免疫调节药物对细胞免疫的影响,某些半抗原涂小鼠皮肤致敏再次接触半抗原活化的,CD4+T CK ,接触性皮炎,12,（三）,B,细胞功能测定,1,、,B,细胞增生实验：方法原理与,T,细胞同，但丝裂原为,PWM,，,LPS,（鼠），,SPA,金葡菌，抗,IgM,抗体等,2,、溶血空斑形成实验：原理：,SRBC,免疫小鼠取脾制成单,个细胞与,SRBC,在琼脂糖凝胶中混合 注入平皿或玻片脾,细胞中抗体生成细胞释放抗,SRBC,抗体（溶血素） 与周围,SRBC,结合加入补体抗体生成细胞周围溶血肉眼可见的,溶血空斑，每空斑代表,1,个抗体生成细胞空斑计数,3,、酶联免疫斑点法（,ELISPOT,）：原理：已知抗原包被于固,相载体加入待测抗体生成细胞释放特异性抗体结合抗原,抗体生成细胞结合于固相载体加入酶联二抗与结合于固相,载体的细胞上抗体结合加底物显色反应着色的斑点形成细,胞镜检计数斑点（计算机软件计算、统计）,13,（四）,NK,细胞活性测定：,靶细胞：人,K562,； 鼠,YAC-1,1,、放射性核素释放法：,51Cr,、,125IUdR,标记靶细胞效,/,靶相,互作用靶细胞破坏释放核素测定上清,/,细胞沉淀放射性,强度（,cpm,）公式计算,NK,杀伤百分率,2,、酶释放法：原理：效,/,靶相互作用靶细胞破坏释放乳酸,脱氢酶（,LDH,）加底物显色取上清比色测,LDH A,值（光,密度值）公式计算,NK,杀伤百分率,3,、流式细胞术：原理：碘化丙叮（,PI,）与死亡靶细胞,DNA/RNA,结合激发荧光流式细胞仪检测靶细胞死亡率,14,第二节 免疫分子的检测,一、免疫球蛋白的测定,常用方法：,单向免疫扩散法、火箭免疫电泳法、免疫比浊法,免疫化学自动分析仪测定,二、补体测定,血清总补体活性测定,CH50,原理：应用兔抗,SRBC,抗体,-SRBC ,免疫复合物 激活待测,血清中补体经典途径,SRBC,溶血 以,50%,溶血为判定结果,的终点，称,CH50,。诊断总补含量减少或补体成分缺失,15,（三）补体各种成分测定,C1q,、,C3,、,B,、,C1INH,单向免疫扩散法、火箭免疫电泳法、免疫比浊法,ELISA,（酶免疫吸附检测）、,RIA,（放射免疫测定）,（四）补体裂解产物测定,C3a,、,C3d,、,C5a,免疫电泳、交叉免疫电泳、,ELISA,、,RIA,用于某些疾病诊断和病情监测,（五）补体受体（,CR,）测定,酶,荧光素,胶体金标记抗,CR,抗体等,诊断补体受体缺陷,16,三、细胞因子及其受体的检测,（一）,CK,生物学活性检测法,原理：根据,CK,特定的生物学活性，采用相应的检测系统（各,种依赖性细胞株,/,靶细胞），通过与标准品比对，判定样品中,CK,活性，用活性单位（,U/ml,）表示,1,、细胞增生或增生抑制法：原理：用对特定,CK,依赖,/,抑制的细,胞株与待测,CK,培养，检测细胞增生或增生抑制，与标准品比对,判断活性单位。如,IL-2,，,TGF-,。用,3HTdR,掺入法，,MTT,法,3,、细胞毒活性测定：原理： 以结晶紫染色法、,MTT,法等测,TNF,对特定靶细胞（,L929,、）的细胞毒活性,4,、细胞病变抑制法：原理：以,VSV-WISH,（人）、,VSV-L929,（鼠）系统，检测,IFN,对,VSV,易感细胞株的,50%,病变抑制效应,与标准品比对，判定活性单位,17,（二）,CK,免疫学检测,ELISA,、免疫,PCR,、,RIA,、免疫印迹法,（三）,CKR,检测,RIA,、标记的抗,CKR,单抗法；,ELISA,检测,sCKR,四、黏附分子的检测,（一）细胞表面,AM,检测,间接免疫荧光法、流式细胞术、,ELISA,、,RIA,法等,（二）可溶性,AM,检测,ELISA,法,18,第三节 免疫学检测常用的标记技术,一、免疫荧光技术,基本原理：以荧光素标记的特异性抗体或抗原作为标准试剂用,于相应抗原或抗体的分析鉴定和定量测定,（一）免疫荧光显微技术 荧光显微镜观察,1,、直接免疫荧光法：特异性抗体直接检抗原检出荧光,+,细胞,2,、间接免疫荧光法：二抗标荧光检出荧光阳性细胞,（二）流式细胞术（,FCM,） 流式细胞仪,1,、分析单个细胞表面标志,2,、分选收集不同类型细胞,3,、对同一细胞进行多参数如,DNA,、,RNA,、蛋白质、细胞体积等,信息分析,19,二、放射免疫测定（,RIA,） 放射性检测仪器,以放射性核素为示踪剂的免疫标记技术，将核素分析的高灵敏,度和抗原抗体反应的特异性相结合,（一）,RIA,原理：以放射性核素标记的抗原（,Ag,）和待测的未标记抗,原与固定量的特异性抗体竞争结合，或进行竞争抑制反应,当,Ag,和,Ab,量固定时，,Ag,-Ab,形成量受,Ag,含量制约； 若,Ag,量高时,Ag-Ab, Ag,-Ab, Ag,-Ab,形成量与未标记,Ag,呈负相关,关系,即放射性,(cpm),待测,Ag,含量 ，,cpm,待测,Ag,含量,（二）免疫放射测定（,IRMA,）,原理：将待测,Ag,与过量,Ab,反应 ,Ag-Ab,加入固相,Ag ,Ag-Ab,和固相,Ag-Ab ,离心沉淀去除固相,Ag-Ab ,检测上清,Ag-Ab,cpm,推算待测,Ag,含量,20,三、免疫酶标技术,基本原理：以酶标抗体,/,抗原与细胞,/,组织中抗原,/,抗体结合，通,过相应酶底物的显色反应，对待检细胞,/,组织中抗原,-,抗体定位、,定性分析，亦可据显色深浅定量分析,（一）酶免疫组织化学技术（,EIH,）,通过底物被酶显色示踪组织中抗原,-,抗体结合物的存在,普通光镜、电镜观察,ABC,法：用生物素,(B),标记过氧化物酶，可携带多个酶分子，,可提高酶反应敏感性。将亲和素,(A),与生物素,(B),标记的过氧化物,酶结合，形成可溶性亲和素,-,生物素化过氧化物酶复合物,(ABC),检测时，将生物素,(B),标记抗体,/,二抗结合于标本加入,ABC,ABC,上的亲和素,(A),结合于抗体的生物素,(B) ABC,结合于标本,加底物显色检出着色阳性细胞,21,（二）酶联免疫吸附测定（,ELISA,） 酶标仪检测,非均相酶免疫测定：常用方法为以聚苯乙烯培养板和,NC,膜等,为固相载体,1,、间接法：测抗体,抗原包被固相载体,(Ag),加入待检抗体,(Ab) Ag -Ab ,加入酶标二抗,(Ab) Ag-Ab-Ab ,加底物显色酶标仪检,测,/,着色于,NC,膜，肉眼观察或扫描定量分析,2,、双抗体夹心法：测抗原,抗体包被固相载体,(Ab),加入待检抗原,(Ag) Ab-Ag,加入酶标抗体,(Ab) Ab-Ag-Ab,加底物显色酶标仪检测,22,小 结,检测方法特点,1.,反应系统,抗原,-,抗体反应,受体,-,配体结合,2.,指示系统,显色,酶标,荧光,放射性核素,cpm,3.,检测系统,各种仪器,免疫学检测常用的标记技术,免疫荧光技术,1.,免疫荧光显微技术,2.,流式细胞术,放射免疫测定,1.RIA 2.,免疫放射测定,免疫酶标技术,1.,酶免疫组化技术,ABC,法,2.,酶免疫测定 间接法,.,双抗体夹心法,