研究生实验课植物生理

单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,研究生实验课植物生理,实验课的要求,掌握实验原理，学习方法。,培养研究生的独立工作能力，科学、规范完成实验及其实验报告。,学会打时间差，提高效率。,研究生实验报告基本要求格式,实验题目：（居中）,姓名 专业 学号 日期 成绩,一、实验目的：,二、实验原理,三、实验器皿：,四、实验步骤：,1.*,2.*,五、实验记录,六、,实验结果与分析,研究生实验报告基本要求,每次实验完毕后一周内交实验报告,B209,。,A4,打印,。,中文用宋体，英文和数字用,Times New Roman,。,数据进行统计分析。,用,Excel,作图，图包括图序、图标、图线、图注等，注明参数及单位。,表格采用三线表，必要时可加辅助线；表中参数应注明量和单位，如所有栏或大部分栏的单位相同，可将单位标注在表的右上角，其余单位标注在相应的栏内；,单位一律采用中华人民共和国法定计量单位。,植物适应逆境机制,生长发育与形态结构,渗透胁迫与渗透调节,植物激素与抗逆性,活性氧及其清除系统,逆境蛋白与抗逆基因,植物抗性的交叉反应,实验内容（,40,学时）,酶联免疫法（,ELISA,）测定植物激素含量（）,1,植物的茎尖培养（）,2,气孔运动及其影响因素、钙参与,ABA,调控气孔运动的信号转导（）,3,几种逆境相关生理指标的测定（）,4,常用仪器讲座（,11,月）,5,气孔运动及其影响因素 钙参与,ABA,调控气孔运动的信号转导,B116,气孔是陆生植物与外界环境交换水分和气体的主要通道及调节机构。,目的和意义,探明植物激素和外界环境因素对气孔运动的影响,证明钙参与,ABA,对气孔运动的调控,学习剥离表皮的方法和显微镜的使用,气孔运动及其影响因素、 钙参与,ABA,调控气孔运动的信号转导,B116,取,3-4,周龄,蚕豆或鸭跖草,幼苗最上端刚完全展开的叶片,.,暗处或光下预处理,2,3h,实验材料：,1.,钾离子对气孔开度的影响（,3,种处理）,KNO,3,、,NaNO,3,与蒸馏水。,2.,CO,2,对气孔运动的影响（,2,种处理）,1 mol/L NaOH,溶液的大培养皿中，用烧杯罩住，其中,CO,2,被,NaOH,所吸收。,3. IAA,和,6-BA,对气孔的作用,用的,10mmol/L Tris,或,MES,缓冲液配制不同浓度的,IAA,和,6-BA,溶液（,0,、,10,-4,、,10,-5,和,10,-6,mol/L,）。,关,开,促进气孔张开,气孔运动及其影响因素、 钙参与,ABA,调控气孔运动的信号转导,B116,4. ABA,和,SA,等植物激素对气孔关闭的作用,用的,10mmol/L Tris,或,MES,缓冲液配制不同浓度的,ABA,和,SA,溶液（,0,、,10,-4,、,10,-5,和,10,-6,mol/L,）。,5.,Ca,2+,参与,ABA,调节气孔运动中的信号转导,用的,10mmol/LTris,或,MES,缓冲液配制不同浓度的,ABA,溶液（,0,、,10,-4,、,10,-5,和,10,-6,mol/L,）、,Ca,2+,（、,1,、,10mmol/L,）溶液、含有,2 mmol/L EGTA,的,ABA,系列浓度溶液，含有,1 mmol/L LaCl,3,的,ABA,系列浓度溶液。,处理,2-3h,，测量随机取,3,个视野，每个视野内随机取,5,（,10,）个气孔。根据测量结果，作出处理浓度和孔径的关系图。分析各处理对气孔开度的影响。,开,关,阻止气孔张开,，诱导气孔关闭。,气孔运动及其影响因素、 钙参与,ABA,调控气孔运动的信号转导,B116,用反应板反应体系为,2000,m,l,B,uffer,2000,m,l,ABA10,-4,mol/L,200,m,lA+1800,m,lB,ABA10,-5,mol/L,ABA10,-6,mol/L,E,GTA,20mm,ol/L,E+ABA10,-4,mol/L,200,m,lE+,200,m,lA+1600,m,lB,母液,A,BA10,-3,mol/L,稀释到终浓度,思考题,测量前为何要进行照光或暗处理,?,ABA,为何能影响气孔开度,?,如何进一步证明钙参与,ABA,诱导气孔关闭的过程？,附：互动显微镜的使用基本步骤,Mie-,设置（倍数、保存路径等）,-,预览（显示待观测视野）,-,测量（直线，每次一选）,-,读数。,剥离表皮的方法：,水中撕下表皮,去叶肉细胞,切,0.50.3cm,置处理液中,酶联免疫法（,ELISA,）测定植物激素含量,抗原抗体反应的高度专一性和敏感性,；,酶的高效催化特性。,原理,固相抗,原型（,间接法,）,和固相抗体,型（,直接法,）,。,目的和意义,掌握间接法测定植物激素的原理和方法,了解逆境对玉米根系,ABA,和,IAA,含量的影响,间接酶联免疫原理示意图,示反应板,（固相载体）,示激素特异抗体,（一抗）,示激素,（抗原）,示非特异二抗,示,蛋白质,激素复合物,示标记酶,间接酶联免疫原理示意图,包被,洗板,竞争,(-,抗,),洗板,二抗,洗板,底物显色,比色,酶联免疫法（,ELISA,）测定植物激素含量,实验材料,自选材料,和玉米幼苗（正常和盐胁迫，,2,个处理）,实验步骤,样品中激素的提取：,提取,：,（,4,4h,）,-,封口膜（留孔）,吹干,:,（置于低温）,样品测定,包被,3h,洗板,-,上午,11:0014:30,（,37,3h,）,竞争,30min,（,37,）,洗板,加,IgG-HRP(,二抗 ）,30min,（,37,）,洗板,加底物显色,15-20min,比色,酶联免疫法（,ELISA,）测定植物激素含量,1.,样品中激素的提取,计量,称取,1g,左右材料，加,2ml,样品提取液,，在冰浴下研磨成匀浆,(,一定要磨细,),，转入,5ml,试管，再用,2ml,提取液,分次冲洗研钵并转入试管中，摇匀。,在,4,下提取,4h,，,30004000 rpm,离心,1520min,，取上清液，沉淀中加,1ml,提取液，摇匀，置,4,下再提取,1hr,离心，合并上清液。,记录体积,，残渣弃去。 上清液（约,2-3ml,）,放青霉素小瓶中，置于真空干燥器中吹干。,或将一定体积的,上清液,转入,表面皿,中，吹干（低温,保存,）。,用,样品稀释液,定容,(,一般,1g,样品用,1ml,样品稀释液定容,),，摇匀后再用于测定。,酶联免疫法（,ELISA,）测定植物激素含量,2.,样品测定,包被,每孔加,100,m,l,。然后将酶标板放入内铺湿纱布的带盖瓷盘内。,37 3h,洗板,放在室温下平衡。用洗涤液洗,4,次，第一次迅速倒掉并甩干。,竞争,a,、配标样,： 稀释成一系列浓度,(2000 ng/ml,、,1000ng/ml,、,500ng/ml,、,250,、,125,、,0) 8,个。,b,、加标样及样品,：每个浓度加,3,孔，每孔,50,m,l,，,每个样品,重复,3,孔，每孔,50 ml,，,边缘孔不加,。,C,、,加抗体,：每孔加,50,m,l,，然后将酶标板放入湿盒内开始竞争。,IAA,、,ABA,，,洗板,四人一组,2000,1000,500,250,125,62.5,2000,1000,500,250,125,62.5,31.25,0,CK,根,CT,根,CK,叶,CT,叶,31.25,0,CK,根,CT,根,CK,叶,CT,叶,酶联免疫法（,ELISA,）测定植物激素含量,2.,样品测定,加,IgG-HRP(,二抗 ）：,每孔加,100,m,l,，然后将其放入湿盒内，,37,下温育,30min,。,洗板,加底物显色：,每孔加,100,m,l(,在暗处操作,),，然后放入湿盒内，当显色适当后，即,0 ng/ml,孔,OD490nm,为，而本底即完全抑制孔不超过，,(,两者之差为,1,左右,),。每孔加入,50 ml 23 mol/L,硫酸终止反应,。,15-20min,比色：,用标准曲线最高浓度孔调,0,，测定,OD490nm,计算,软件,酶联免疫法（,ELISA,）测定植物激素含量,注意事项,洗板（,低上,-,高下,）,时间安排,样品吹干,真空干燥器,-,有机溶剂,植物的茎尖培养,原理,植物细胞具有,全能性,，即每个植物细胞包含着能产生完整植株的全部遗传基因。从理论上讲，只要条件合适，包含着全部遗传基因的细胞都能分裂分化，产生完整的植株。,在,茎尖和根尖,的分生组织中一般是无毒或仅含极低浓度的病毒粒子，而较老的组织中，病毒含量随离茎尖距离的增加而提高。根据这一原理采用,茎尖组织培养可获得无毒植株,。,目的和意义,掌握茎尖培养的原理和方法,植物的茎尖培养,实验材料：,自己感兴趣的任何植物材料,-,幼嫩植株初生芽,15-20,个,实验步骤：,1.,配置基本培养基,MS,；,半天（上午）,2.,灭菌 （包括无菌水和器皿）,半天（中午）,3.,接种（解剖镜剥离茎尖,接种）（下午）,练习使用解剖镜剥离茎尖,植物的茎尖培养,1.,配置培养基,大量元素：,20,倍,微量元素：,1000,倍,EDTA-Fe,：,200,倍,CaCl,2,H,2,O,：,200,倍,KI,：,1000,倍,BA,：,IAA,：,NAA,：,肌醇：,50mg/L,水解乳清蛋白：,300mg/L,蔗糖：,30g/L,琼脂：,8-9g/L,需要自己计算称量的试剂,已配母液,1,、,MS,（,pH,）,2,、,3,、,4,、,5,、,6,、,分组添加,植物的茎尖培养,1.,配置培养基,在制作培养基时，,按照以下顺序加入各种试剂：,先吸取,-,，再加入蔗糖，溶解后，加母液,，混匀后加蒸馏水，用,0.5N NaOH,调,pH,至,5.86,并用试纸检验。,加水定容至所计算体积后，调整,pH,至。,然后将混匀的溶液倾入烧杯中，加入琼脂,8g/L,，在微波炉上加热融化（如果琼脂质量不好，含杂质较多时，可事先在水中浸泡，清洗后使用）。待琼脂彻底融化后，就可以开始分装。,培养基的分装：,将制作好的培养基分装到组织培养用的三角瓶中，分装时，小心地将培养基倒入三角瓶中，以免瓶口沾上培养基容易引起污染。分装量可根据三角瓶大小而定，一般使培养基体积占瓶体的,1/4,到,2/5,比较合适。装好后，塞上棉塞，用羊皮纸包严，线绳扎紧，准备消毒灭菌。,植物的茎尖培养,2.,灭菌,培养基,消毒压力为,0.9lkg,cm2,消毒,20min,。,玻璃器皿及用具、无菌水,消毒应适当增加压力和延长时间，一般为，,3050min,。在消毒用具前，每人应准备好蒸馏水，用棉塞塞好，纸包严，线绳扎紧，同时再准备两套培养皿、皿底内铺两张与培养皿大小相应的滤纸，盖好皿盖，用羊皮纸分别包好，两包合起来，再用一块纱布包好，扎上线绳，一起灭菌。,灭菌,121126,灭,20min,， 放气，,2,次,植物的茎尖培养,3.,接种,接种室的消毒,：,材料表面消毒：,植物器官,(,茎尖,),用水冲净用,70,的酒精漂洗材料,半分钟,放入的升汞中进行表面消毒,2-10min,用无菌水冲洗材料。,茎尖剥离,：表面消毒的茎尖和解剖镜都置于超静工作台上。剖取茎件尖时，把茎芽置于解剖镜下，一手用镊子将其按住，另一手用解剖针或解剖刀将叶片和叶原基剥掉。解剖针或解剖刀要常常浸入酒精，并用火焰灼烧，冷却。当形似一个晶亮半圆球形的顶端分生组织充分露出来后，将其切下一般,0.11mm,（实际操作时可,24mm,），再用同一工具接到培养基上。,接种,：每瓶中放置,1-3,个茎尖,放置好材料的培养瓶，立即塞好瓶塞。用一小块锡铂纸包好瓶口；并用线绳或橡皮绳缠两圈结成活头，便于以后解开。记录个人信息。,植物的茎尖培养,1.,配置培养基,每人做三种配方，,相同配方的同学原则上,6,人一组配置培养基（,pH,）,400ml,每人量取,60ml MS,培养基，,3,名同学搭配分别要配置的培养基添加不同激素，分装到,3,个三角瓶中。,32,套培养皿（,32*3=96,）及,2L,蒸馏水进行高压湿热灭菌。,实 验 流 程,母液配制,培养基配制,培养基等的灭菌,接 种,培 养,外植体表面消毒,4,1,2,3,5,6,逆境胁迫（盐）对玉米幼苗的影响,材料,-,根、叶片,处理,-1mol/L NaCl,（自选逆境）,指标,：,激素,ABA-IAA,(,选一,),膜,-MDA,渗透物质,脯氨酸,保护酶,-,活性氧代谢,-SOD,、,POD,(,选一,),几种逆境相关生理指标的测定,自己查阅文献，设定胁迫条件（高温、低温、盐害、干旱，等等），或处理材料；自己配制部分药品。,任选选,3,个指标。,SOD,活性测定（,B112,）,POD,活性测定（,B112,）,丙二醛含量的测定（,B112,）,游离脯氨酸的测定（,B116,）,实验仪器：,紫外可见分光光度计 离心机,二、实验原理,因此光还原反应后，反应液蓝色愈深说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。,本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（,NBT,）在光下的还原作用来确定酶活性大小。,核黄素,被氧化物质,还原的核黄素,氧,氮蓝四唑,蓝色的化合物,（,560nm,）,2 + 2H,+,H,2,O,2,+ O,2,SOD,植物组织中超氧物歧化酶活性的测定,实验步骤,试 剂（酶）,用量,(ml),终浓度（比色时）,0.05mol/L,磷酸缓冲液,130mmol/L Met,溶液,750mol/L NBT,溶液,100mol/L EDTA-Na,2,液,20mol/L,核黄素,酶液,蒸馏水,3,0.6,0.6,0.6,0.6,0.2,0.4,13mmol,75mol,10mol,2.0mol,对照管加缓冲液代替酶液,总体积,6.0,1,、酶液提取,2,、显色反应,表,1,各溶液加入量,，加,1ml,磷酸缓冲液,(pH7.8),研磨成浆，加缓冲液使终体积为,4ml,。取,23ml,于,10000rpm,下离心,10,分钟,3,、,SOD,活性测定,以不照光的对照管作空白，在,560nm,下分别测定其它各管的光密度值，,SOD,活性单位以抑制,NBT,光化还原的,50%,为一个酶活性单位表示。按下式计算,SOD,活性。,SOD,总活性,=,单位：酶单位,/g,鲜重表示；,Ack,照光对照管的光密度值；,A,E,样品管的光密度值；,V,样液总体积（,ml,）；,a,测定时样品用量（,ml,）；,W,样重（,g,）；,思考题,1,、在,SOD,测定中为什么设暗中和照光两个对照管？,2,、影响本实验准确性的主要因素是什么？应如何克服？,实验原理：,硫代巴比妥酸,TBA,丙二醛,3,5,5-,三甲基恶唑,2,4-,二酮,（三甲川）,逆境,膜脂的过氧化作用,丙二醛,酸性,粉红色,植物组织或器官中丙二醛含量的测定,实验步骤：,1 MDA,的提取,称,2g,叶片，加入,5ml,磷酸缓冲液（,50mmol,，,pH,值为）及少量石英砂，于冰浴中研磨提取，匀浆液以,12000g,离心力作用下（,4,度）离心,10min,，其上清液即为,MDA,提取液。,2 MDA,的测定,取,1ml MDA,提取液，加,3ml 27,三氯乙酸和,1ml 2%TBA,。混和液在,95,度水浴中保温,30min,后，立即置于冰浴中冷却，然后离心,10min,，于波长,532nm,和,600nm,下测定,OD,值。,结果计算,以测得的,OD532,减去,OD600,的非特异吸收值，按,155mmol,-1,cm,-1,消光系数计算,MDA,含量。 分别计算衰老和对照组的值。,MDA,浓度,(mol/L)=6.45(D532-D600)-0.56D450,MDA,含量,(mol/g FW),D450,、,D532,、,D600,分别代表,450nm,、,532nm,和,600nm,波长下的光密度值。,注意事项：,的三氯乙酸对,MDATBA,反应较合适，若高于此浓度，其反应液的非专一性吸收偏高；,MDA-TBA,显色反应的加热时间，,最好控制沸水浴,10-15min,之间。时间太短或太长均会引起,532nm,下的光吸收值下降；,如待测液浑浊，可适当增加离心力及时间，最好使用低温离心机离心。,低浓度的铁离子能增强,MDA,与,TBA,的显色反应，当植物组织中铁离子浓度过低时应补充,Fe,3+,（最终浓度为,0.5 nmolL,-1,）,可溶性糖与,TBA,显色反应的产物在,532 nm,也有吸收（最大吸收在,450 nm,），当植物处于干旱、高温、低温等逆境时可溶性糖含量会增高，必要时要排除可溶性糖的干扰。,植物组织中过氧化物酶活性测定,原理,在过氧化物酶,(peroxidase),催化下,H,2,O,2,将愈创木,酚,氧化成茶褐色产物。此产物在,470nm,处有最大光吸收,故可通过测,470nm,下的吸光度变化测定过氧化物酶的活性。,方法,和步骤,1.,酶液的制备,取,2g,材料,切碎,加适量的磷酸缓冲液,（）,研磨成匀浆。将匀浆液全部转入离心管中,于,3000g,离心,l0min,上清液转入,10ml,容量瓶中。,2.,过氧化物酶活性测定,-l,磷酸缓冲液,；,1.0m12%H,2,0,2,；,-l,愈创木,酚,和,0.1ml,酶液。用加热煮沸,5min,的酶液为对照,反应体系加入酶液后,立即于,37,水浴中保温,15min,然后迅速转入冰浴中,并加入,2.0ml20%,三氯乙酸终止反应,然后,过滤,，,适当稀释,470m,波长下测定吸光度。,计算,以每分钟内,A470,变化,0.01,为,1,个过氧化物酶活性单位,(u),。,过氧化物酶活性,=(A470 Vt) /,（,0.01WVs t,）,-1,式中,：,A470,一 反应时间内吸光度的变化,；,w,一 马铃薯鲜重,(g),；,t,一 反应时间,(min),；,Vt,一 提取酶液总体积,(ml),；,Vs,一 测定时取用酶液体积,(ml),。,植物体内游离脯氨酸含量的测定,原理,在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，用甲苯萃取后，此缩合物在波长,520nm,处有一最大吸收峰。脯氨酸浓度的高低在一定范围内与其光密度成正比。,1,标准曲线制作,表,各试管中试剂加入量,管 号,0,1,2,3,4,5,6,标准脯氨酸量,(ml),0,0.2,0.4,0.8,1.2,1.6,2.0,H,2,O(ml),2.0,1.8,1.6,1.2,0.8,0.4,0,冰乙酸,(ml),2.0,2.0,2.0,2.0,2.0,2.0,2.0,显色液,(ml),3.0,3.0,3.0,3.0,3.0,3.0,3.0,脯氨酸含量,(g),0,2,4,8,12,16,20,以光密度值为纵坐标，脯氨酸含量为横坐标，绘制标准曲线，求线性回归方程。,步 骤,2,样品测定,（,1,）脯氨酸提取,取不同处理的材料，分别置于大试管中，加入,5ml 3%,磺基水杨酸溶液，管口加盖玻璃球塞，于沸水浴中浸提,10min,。,（,2,）取出试管，待冷却至室温后，吸取上清液,2ml,，加,2ml,冰乙酸和,3ml,显色液，于沸水浴中加热,40min,。,（,3,）取出冷却后向各管加入,5ml,甲苯充分振荡，以萃取红色物质。静置待分层后吸取甲苯层，以空白管为对照，在波长,520nm,下比色测定。,结果计算：,从标准曲线中查出测定液中脯氨酸浓度，按下式计算样品中脯氨酸含量的百分数：,脯氨酸（,g/g FW,或,DW,）,=(CV/a)/W,式中,C,提取液中脯氨酸含量（,g,），由标准曲线求得；,V,提取液总体积（,ml,）；,a,测定时所吸取提取液的体积（,ml,）；,W,样品重（,g,）。,实验原理,植物吸收的硝酸根离子，首先通过硝酸还原酶的,催化，被还原成亚硝酸根离子。其反应如下：,NO,3,-,+NADH+H,+,NO,2,-,+NAD,+,+H,2,O,产生的亚硝酸根离子可以从组织内渗到外界溶液中，测定反应液中亚硝酸含量，通过一定公式计算就可得硝酸还原酶活性的大小。,硝酸还原酶,(NR),活性的测定,亚硝酸离子的测定用比色法。其反应如下：,对氨基苯磺酸,(,或磺胺,)+2H+NO,2,-,叠氮化合物,叠氮化合物,+-,萘胺（或盐酸萘乙二胺）,偶氮化合物,(,红色,),生成的红色偶氮化合物在,520nm,波长比色，其光密度值与,NO,2,-,含量成正比。,方法步骤,1,绘制标准曲线：,试剂（,ml,）,1,2,3,4,5,6,7,NaNO2,标准液,(5,微克,ml),0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1,蒸馏水,1,0.9,0.8,0.6,0.4,0.2,0,对氨基苯磺酸,(,或磺胺,),2,2,2,2,2,2,2,盐酸萘乙二胺,(,或,-,萘胺,),2,2,2,2,2,2,2,每管含,NaNO2,的微克数,0,0.5,1,2,3,4,5,试管号,2.,取样,按下式计算酶活性：,3. NaNO,2,含量测定,实验结果,查表值,(46/69),材料鲜重（,g,）,反应时间,NR,活性,（,gNO,2,-,/gFWh,）,思考题,活性测定时取材前为什么要进行一段时间光合作用？,2.,测定酶促反应时为什么要在暗处保温？,活性测定时加入磺胺、盐酸萘乙二胺和,KNO,3,的作用各是什么？,汇报结束,谢谢大家,!,请各位批评指正,