农林牧渔鲜蔬菜水果中农药多残留快速检测技术

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,新鲜蔬菜、水果中农药多残留快速检测技术,第一部分 农残检测基础知识,（一） 专业术语,一 农药残留（pesticide residue）,农药使用后残存在生物体、农副产品和环境中的微量农药母体、有毒代谢物、降解物和杂质的总称。以mg/kg, ug/kg, ng/kg表示。,中国一般只检测农药母体。,发达国家检测母体、代谢物、环境降解产物、工业品杂质。,（一） 专业术语,二 农药残留分析（pesticide residue analysis）,对待测样品中微量农药残留进行定性、定量分析。,目的:,为新农药提供其在农作物上的残留动态和最终残留量。,制定农药最大残留限量和合理使用准则。,评价农药残留对农畜产品和环境的危险性。,为制定防治农药污染措施提供依据。,（一） 专业术语,二 农药残留分析（pesticide residue analysis）,特点:,分析目的物含量低，在样品中仅以ug, ng甚至pg、fg量存在,目的物种类多，化学结构差异大。,样品种类多，干扰物成分各异。,方法要求快速、简便、成本低、灵敏、准确、安全（QuEChERS)。,对样品的前处理和仪器测试要求越来越高。,（一） 专业术语,二 农药残留分析（pesticide residue analysis）,分类:,1 单残留分析（singal residue analysis),对待测样品中某类某一种农残定性定量（已知、未知）,农药注册（中国、外国）,中国国标方法,2 多残留分析（multiresidue analysis）,对待测样品中多类多种农药残留同时定性和定量（已知、未知）,单种类农药多残留分析（有机磷、有机氯等）中国国标方法,多种类农药多残留分析,未知多类多种残留分析（快速扫描-MRSM）（CDFA、FDA、Canada）,（一） 专业术语,三 农残分析基本概念,1 添加回收率（fortified recovery）,空白样品中加入一定浓度某一种或几种农药（C1）后，其样品中此农药浓度测定值（C2）对加入值的 百分率（F）。F=C2/C1*100%,添加回收率旨在衡量测定值与真值之间的误差，是制定农残分析方法准确度和可行性的指标。,一般以MRL值水平高一个数量级、低一个数量级和同一个数量级三个浓度水平进行添加，或者在1、5和10 LOQ水平添加，测定添加回收率；,可以单个农药添加测定单残留添加回收率，也可多种农药同时添加，测定多残留添加回收率。,至少重复三次。,测试样品具代表性（3-4种）。,测试农药具代表性（4类-5类）。,单残留回收率：80100%，多残留回收率：70120%。,（一） 专业术语,三 农残分析基本概念,2 变异系数（Coefficient of variation,CV）,衡量回收率偏异程度，判定农残分析方法的精确度（重现性）指标。,CV=标准偏差/平均回收率*100%,一般20%,（一） 专业术语,三 农残分析基本概念,3 检出限，定量限,（1）检出限（limit of detection）,衡量仪器或方法灵敏度（检出目的物）的指标。要求低于测定目的物的MRL值（最好低一个数量级）。,在色谱图上可清楚确认的分析目的物色谱峰的下限。通常为噪音3倍（S/N=3）。,分为仪器检出限和方法检出限,仪器检出限,无样品基质存在，在与样品测定完全相同的条件下，某种分析仪器能够检出分析目的物的最小量或最低浓度。,方法检出限,有样品基质存在，在与样品测定完全相同的条件下，某种方法能够检出分析目的物的最小量或最低浓度。,（一） 专业术语,三 农残分析基本概念,3 检出限，定量限,（2)定量限（limit of quantitation）,衡量仪器或方法灵敏度（定量目的物）的指标。,在色谱图上可准确定量分析目的物色谱峰值的下限。通常为噪音10倍（S/N=10）。,分为仪器定量限和方法定量限,仪器定量限,无样品基质存在，在与样品测定完全相同的条件下，某种分析仪器能够 准确定量分析目的物的最小量或最低浓度。,方法定量限,有样品基质存在，在与样品测定完全相同的条件下，某种方法能够准确定量分析目的物的最小量或最低浓度。,（一） 专业术语,三 农残分析基本概念,3 检出限，定量限,（3） 测定方法,仪器检出限或定量限,用某分析目的物的最低浓度标样测定。,Agilent仪器化学工作站可以直接测定S/N。,如:-BHC 标样浓度为0.01ppm， S/N=30，则仪器LOD=0.001ppm,仪器LOQ=0.003ppm,方法检出限或定量限,用添加某分析目的物最低浓度水平或预测水平的样品，经过该方法的全部操作程序测定。重复实验两次 。,如:-BHC 添加在韭菜中，CDFA方法添加水平为0.01ppm，样品最终浓度为 0.01ppm ，S/N=12，方法LOD=0.0025ppm，方法 LOQ=0.008ppm。,（一） 专业术语,三 农残分析基本概念,4 农残分析方法认证指标,准确度（Accuracy）真值（true value）回收率,精密度（Precision）重现性（reproducibility），变异系数,灵敏度（sensitivity），检出限，定量限,仪器线性范围（Linearity），标准曲线（standard curves）,（五个不同浓度，覆盖三个数量级或1X,5X,10X LOQ水平）,相关系数（R0.9900),测定天数（3days）,（一） 专业术语,三 农残分析基本概念,5 农残分析质量保证和质量控制（QA/QC）,试剂空白实验（reagent blank）（每日）,基质空白实验（matrix blank） （每日）,农药标样（基质中添加农药混合标样；至少两种基质 ； 2X LOQ水平） （每日）,添加回收率（添加混标，轮换添加）（每日）,LOD、LOQ、仪器、方法（仪器、方法条件改变时）,仪器线性关系、标准曲线、相关系数（至少三天）,三 农残分析基本概念,6 最大残留限量（Maximum Residue Limit，MRLs）,在农畜产品中农药残留的法定最高允许浓度，又称最高残留限量，以每千克农畜产品中农药残留的毫克数（毫克/千克）表示。,制订目的：控制食品中过量农药残留以保障食用者安全，对超标的产品采取措施，即禁止食用。推行和指导合理用药，农产品监测超标时，表明未按规定用药。减少国际贸易纠纷，各国均制订本国的MRLs，国际组织FAO/WHO也制定其相应的MRLs标准。,制订方法：按照农药标签上规定的施药剂量和方法使用农药后，在农产品中的最大残留浓度，其数值必须是毒理学上可以接受的，由各国政府部门按法规公布。,在农残检测中，以MRL值判断是否超标。,（一） 专业术语,食品中农药的最大允许残留限量（mg/kg）（强制性国家标准）,谷类,稻谷,蔬菜,水果,食用油,茶叶,辛硫磷,敌百虫,亚胺硫磷,甲胺磷,乙酰甲胺磷,二嗪磷,杀螟硫磷,甲拌磷,倍硫磷,敌敌畏,呋喃丹,久效磷,甲基对硫磷,毒死蜱,乐果,马拉硫磷,对硫磷,0.05,0.1,0.5,0.2,0.1,5.0,0.02,0.05,0.1,0.1（成品粮）,0.05,3（成品粮), 8,0.1,0.1,0.5,0.02,0.1,0.05,0.1,0.5,0.2,0.5,0.5,不得检出,0.05,0.2,1（叶菜）,1,不得检出,不得检出,0.05（全果）,0.1,0.5,0.5,0.5,0.5,不得检出,0.05,0.2,1（梨果）,0.3（柑桔）,1,不得检出,不得检出,不得检出,不得检出,0.01,不得检出,0.05（棉籽油）,0.1 （棉籽油）,0.05 （棉籽油）,不得检出,不得检出,0.5,摘自“农产品农药残留限量标准汇编” 农业部农药检定所2001.9,（二） 基本程序,前处理,仪器分析,预处理,农残分析,提取,净化,浓缩,ECD、ELCD,FPD、NPD,AED、XSD,GC,HPLC,GC/MS,LC/MS,EI、CI,其它,UV、FLD、DAD,样品采集,贮藏,ESI、APCI,TLC、CE,ELISA,（三）农残分析结果计算与表述,（外标法，单点定量）,第二部分 农残检测技术综述,（一）农残检测前处理技术简介,一 样品予处理,取样：均匀、代表性,处理：水样，过滤；,土样，阴干、研细、过筛（40目）；,动植物样：,高水分（水果、蔬菜），切块、食品加工器中加工,低水分（粮食）磨碎，过筛,高脂肪（畜产品），切块，搅肉机中加工。,（一）农残检测前处理技术简介,二 提取,用溶剂把分析目的物从样品中溶解抽提出来。,溶剂的选择：目的物溶解度大，基质干扰物溶解度小，纯度高（农残级、HPLC级、分析纯重蒸，浓缩200X，仪器检测）,（一）农残检测前处理技术简介,二 提取,按溶剂类型分类,乙腈法CDFA（US） Dr.Mill,乙酸乙酯法欧盟法 (Sweden),丙酮法FDA（US） Dr.Luke,混合溶剂法（乙腈-丙酮-甲醇） FDA （US） （测定牛奶中有机磷、有机氯）,（一）农残检测前处理技术简介,二 提取,按样品类型分类,浸泡、振荡、索氏提取-土壤（非结合残留）,匀浆,外搅拌器 ：水果、蔬菜、茶叶、粮食，（脂肪2%）,其它SFE，超声波提取,（一）农残检测前处理技术简介,三 净化,1 液液萃取法（LLE）,分析目的物在两种不相溶的溶剂中进行分配。,利用目的物与干扰物在两种不相溶的溶剂中溶解度差异而达到分离目的。,根据目的物与干扰物性质，选择溶剂对。,传统方法多采用（如国标法）。,逐渐被取代（费时、费试剂、回收率易偏低）。,乙酸乙酯,高,丙酮,乙腈,农药回收率,高,较好,高,除脂肪,一般,好,好,好,较好,一般,好,一般,低,低,除蛋白,较好,好,好,除糖份,较好,除水分,一般,一般,较好,GC 兼容性,较好,SPE 兼容性,一般,一般,好,GPC兼容性,一般,挥发性,一般,一般,成本,较高,毒性,低,低,较低,较低,有机溶剂提取效果比较,（一）农残检测前处理技术简介,三 净化,2 固相萃取法SPE 固相微萃取法 SPME,分析目的物在键合硅吸附剂与溶剂中进行分配，而与干扰物分离。,原理：,如图1,，图2,适用范围广，各种不同结构类型的SPE商品柱适用于各种结构类型的农药分析。,如表1,优点：,如表2,已成为农残分析主要前处理手段，代替LLE。发达国家广泛应用，我国正在推广。,Next,（一）农残检测前处理技术简介,图 1,（一）农残检测前处理技术简介,图 2,Back,（一）农残检测前处理技术简介,键合官能团,分析官能团,基质,典型洗脱溶液,应用范围,非极性萃取,C18-Ocatadecyl,C8-Octyl,C2-Ethyl,CH-Cyclohexyl,PH-Phenyl,CN-End-capped Cyanopropyl,疏水基：,芳香环,烷基链,水基质：,水,缓冲溶液,生物流体,甲醇,乙腈,乙酸乙酯,氯仿,酸化甲醇,己烷,滥用药物,肽,农药,治疗类药物的监测,极性萃取,CN-Cyanopropyl,2OH-Diol,Sl-Silica,NH2-Aminopropyl,亲水基团：,羟基,胺基,杂原子（S.O.N),非极性基质：,己烷,油类,氯仿,脂肪类,甲醇,异丙醇,丙酮,维生素D代谢物,脂肪分离,油类添加剂,碳水化合物,酚类,阳离子交换萃取,SCX-Benzenesulfonic Acid(Strong),PRS-Propylsulfonic Acid(Strong),CBA-Carboxylic Acid,(weak),阳离子：,胺类,嘧啶类,水基质：,水,酸性缓冲溶液,生物流体,碱性缓冲溶液,高离子强度缓冲溶液,儿茶酚胺类,除草剂,药物,阴离子交换萃取,SAX-Quaternary Amine(Strong),PSA-Primary/Secondary Amine,NH2-Aminopropyl(Weak）,DEA-Diethyl-aminopropyl(Weak),阴离子：,羧酸,磺酸,磷酸盐（或酯）,水基质：,水,碱性缓冲溶液,生物流体,酸性缓冲溶液,高离子强度缓冲溶液,有机酸,维生素,脂肪酸,磷酸盐（或酯）,表 1,（一）农残检测前处理技术简介,键合官能团,分析官能团,基质,典型洗脱溶液,应用范围,共价萃取,PBA-Phenyl-boronic Acid,连位二醇,水基质：,碱性缓冲溶液,生物流体,酸性缓冲溶液,酸化甲醇,核苷酸类,核苷类,碳水化合物,儿茶酚胺类,特殊相,Bond Elut Certify,阳离子型滥用药物,药物,水基质：,水,酸性缓冲溶液,生物流体,强酸,强碱,酸/碱性有机混合物,碱性药物,中性药物,Bond Elut Certify II,阴离子型滥用药物,药物,羧酸,磺酸,水基质：,水,碱性缓冲溶液,生物流体,强酸,强碱,酸/碱性有机混合物,酸性药物,EnvirElut,疏水基：,芳香环,烷基链,水基质：,水,流体,己烷,二氯甲烷,油、油脂、脂肪,农药,酚类,多环芳烃,续表 1,（一）农残检测前处理技术简介,键合官能团,分析官能团,基质,典型洗脱溶液,应用范围,特殊相,AccuCAT,阴，阳离子,水基质：,水,生物流体,缓冲溶液,酸性/碱性缓冲溶液,高离子强度缓冲溶液,有机酸,儿茶酚胺类,碱性药物,TCA,疏水基：,芳香环,烷基链,水基质：,生物流体,甲醇,碱性甲醇,Tricyclics,Benzodiazepines,LMS,疏水基：,芳香环,烷基链,水基质：,水,流体,乙腈,药物,ENV,疏水基：,芳香环,烷基链,水基质：,水,流体,乙腈,甲醇,乙酸乙酯,爆炸物,农药,PPL,疏水基：,芳香环,烷基链,水基质：,水,流体,甲醇,乙酸乙酯,酚类,续表 1,Back,（一）农残检测前处理技术简介,项目,方法,液-液萃取法（LLE),固相萃取法(SPE),取样量,1000ml,4,2-200ml,4,包装运输贮藏,大量水样,少量柱或溶剂,（田间过柱、洗脱或实验室洗脱）,萃,取,有机溶剂用量,操作时间,100ml/样,0.5小时/样（萃取），48小时（脱水）/样,8ml/样,510分钟（过柱，100ml),6分钟/样（转移、定容）,浓缩,100,ml,1ml(100倍）,20 分钟,不需浓缩,过键柱时100ml 1ml(100 x),净化,过净化柱,不需净化,总耗时间,610小时/样,1020分钟/样,优缺点,费时、费溶剂、设备复杂,结果准确度、精密度较低,省时，省溶剂、操作简单、易实现半自动化、自动化，结果准确度、精密度较高,表2 固相萃取法与液-液萃取法操作比较,Back,（一）农残检测前处理技术简介,三 净化,3 凝胶渗透法（GPC）.,原理：基于物质分子大小和形状不同来实现分离的。主要依据相对分子量的差别，通过GPC将农药与农药、农药与共提取物分开。从而使之得到分离和净化。（大多数农药分子量小于500）如图3,优点：净化容量大，适用于有机磷、有机氯农药的提取，去除脂肪和色素。大多数农药回收率较高。容易实现自动化。,缺点：凝胶柱成本较高，溶剂用量大。,欧洲应用的较多。,（一）农残检测前处理技术简介,图 3,（一）农残检测前处理技术简介,三 净化,4 超临界萃取法（SFE）,用超临界流体为萃取剂，从复杂组分中把目的物组分提取出来。,原理：依据超临界流体中不同物质的溶解度不同达到分离的目的。,优点：快速方便、选择性强；流体密度、溶解度、粘度都能通过压力控制；超临界流体常温下可自然挥发，省去了浓缩步骤；可与GC、LC及超临界色谱联机；样品用量少、回收率高等。,缺点：设备投资大、技术要求高；分析物质浓度过高干扰检测；基质对萃取过程影响较大；适用的农药和样品范围较窄,SFE是农药多残留分析中具有发展前景的技术。,（一）农残检测前处理技术简介,三 净化,5 其它：磺化法、冷冻法、凝结沉淀法。,磺化法：利用脂肪和蜡质能与浓硫酸进行磺化反应的原理，有效去除基质中的脂肪和蜡质（前提是测定的农药不与硫酸反应，常用于有机氯农药检测）。,冷冻法：低温下有机溶液里，动植物中脂肪、蜡质沉淀析出，而农药留在溶液中，达到分离目的。,凝结沉淀法：用凝结剂将脂肪和色素等杂质沉淀的净化方法，适用于极性较强，在水中有一定溶解度的农药。,（一）农残检测前处理技术简介,四 浓缩,真空旋转蒸发法：处理溶剂量大、速度快、损失率高。,KD浓缩器：处理量大、农药提取较充分、损失率较真空旋转蒸发器低、耗时较长。,氮吹仪：浓缩效率高，农药损失率低，溶剂处理量小，与SPE净化方法结合是理想的浓缩装置。,自然挥发法：浓缩慢，适于体积小，易挥发的溶剂。,（二）国外农残检测技术发展趋势,一 趋势:,对农产品,食品安全高度重视,表现在:,- 体系完备；法规、标准健全；机构、人员、设备完善,- 监控、检测及时有力；确保消费者身体健康和商品在国际市场,上的竞争力,为达到 ISO9000 和各国政府法律法规和标准（如GLP），要求检测技术：,- 检测能力大,- 方法指标严,- 样品处理量小,- 分析目的物种类,数量多,- 准确度精确度灵敏度要求高,- 数据文件处理量大,（二）国外农残检测技术发展趋势,二 概况:,GC-挥发性农药,快速筛选,HPLC-半挥发,不挥发,极性,热不稳定性农药,确证(结构鉴定)-GC/MS , LC/MS,分析目的物-母体,农药代谢物,降解产物,结合残留,（二）国外农残检测技术发展趋势,1 前处理技术,(1)传统技术如液-液萃取(LLE);索式提取(Soxhlet Extraction);振荡-过滤(Shake-Filter);匀浆(blending)等仍在使用(参考文献1)。,(2)最大进展是固取萃取(SPE)广泛用于农残分析,集萃取、净化、浓缩于一步,具有缩短分析时间,降低成本,节省有机溶剂,可实现半自动化,全自动化操作等优点(参考文献2,3)。,(3) 用活性碳柱和SPE柱净化,GC/MS和HPLC-FLD，检测水果,蔬菜中200多种有机氯、有机磷、含氮和氨基甲酸酯类农药残留方法已发表(参考文献7)。,二 概况:,（二）国外农残检测技术发展趋势,二 概况:,1 前处理技术,(4)非极限萃取(nonexhaustive extraction)、用SPE拄(Cartridges)和膜(disks)结合GC和GC/MS方法，在线和非在线液体提取；固相微萃取(SPME)；超临界萃取(SFE)；基质固相分散萃取(Matrix solid-phase dispersion extraction)；苯乙烯-二乙烯基苯共聚物萃取；多孔碳柱和SPE拄或膜(特别是C8,C18)结合使用；加速溶剂萃取(accelerated solvant extraction)；微波萃取；钝化扩散聚合物膜(passive diffusion through polymeric membranes)；离心分离层析；自动液-液、索氏和SPE萃取；自动化凝胶渗透层析；液体样品经固相沉淀后，SFE萃取水中挥发和半挥发农药；顶空SPME等前处理技术，在制备液体和固体样品时如何应用均有报导(参考文献4,5,6)。,（二）国外农残检测技术发展趋势,二 概况:,2 GC,GC/MS,(1) 高效毛细管柱(非极性和中等极性固定相）,双柱定性定量代替,传统填充柱。,(2) 广泛使用元素选择捡定器(ECD,FPD,NPD等)。,(3) GC/MS和GC/MS-MS作确证和结构鉴定。,(4) SPE结合GC/MS，提供了有效和强有力的分析系统。,(5) 用原子发射捡定器(AED)可以筛选400多种农药残留。,(6) 手性高分辨率GC/MS用于选择性检测农药异构体和对映异构体。,（二）国外农残检测技术发展趋势,二 概况:,3 HPLC，LC/MS,(1) C8、C18 反相柱最常用于HPLC农残检测。,(2) 吸附柱 (silica,gel)；极性键合柱 (cyano,amino)；离子交换；,离子色谱 (IC)；离子对；混合官能度柱(multimodal) 也用于特殊分,析。,(3) HPLC-SFC/MS 改善选择性,达到净化测定一体化,(4) 固定和可调波长UV-VIS 检定器常用于HPLC农残分析， 二极管陈列,UV-VIS检定器和MS，提供农药结构鉴定,其他如FLD和电化学检定器,用于单个或多个检定器系统。,(5) LC/MS和LC/MS-MS (ES)用于农药多残留分析已有报导。,（二）国外农残检测技术发展趋势,二 概况:,4 CE(capillary electrophoresis),IC(ion chroniatography)和其他色谱,(1) SFC(超临界色谱)结合SFE用于土壤中农药分析。,(2) 欧洲广泛应用高效自动化薄层层析(TLC)定量检测饮用水中污染,物。,(3) CE,CE/MS和IC分离,测定作物和其他基质中农药、农药代谢物残留和,无机物残留是很大进展。用CE分析大豆中多种极性农药是一个典型例,子。,(4) CE,IC和AAS(原子吸收),ICP-AES,ICP-MS结合用于重金属分析,（二）国外农残检测技术发展趋势,二 概况:,5 生物技术方法,(1) 特异性抗体的开发，导致免疫分析方法(Immunoassay)用于,实验室和田间农残分析。,(2) 免疫分析商品化检测试纸，在分析有机磷、氨基甲酸酯、硫代,氨基甲酸酯、氯代苯氧羧酸、均三氮苯、苯胺、有机氯等农,药残留成为有价值的方法。,(3) 免疫分析用于大监测项目、农药登记、代谢物研究、亲合色谱,(affinity chromatography) 、食品调查、人类和环境对农,药暴露研究等方面。,（三）国内农残检测面临任务,形势:,1.农药生产,产量40万吨,居世界第二位(仅次于美国)，其中杀虫剂占总,量70%；有机磷杀虫剂占杀虫剂产量70%；甲胺磷,甲基对硫,磷,对硫磷,氧乐果，久效磷又占有机磷杀虫剂产量70%。,2.农药使用,年使用量27万吨 居世界前列；使用区域集中(江苏,浙江,山东等)；施用作物-,蔬菜,播种面积占农作物10%,单位面积,施药量最大,年人均占有量最大(300公斤),（三）国内农残检测面临任务,3.农药污染(蔬菜),1) 2001年 全国23个城市181种蔬菜检测,超标率47.5%。,2) 某省五个菜市场抽检48个菜样,44个不合格,高毒农药检出率达 30%。,3) 北京部分市场检测超标率18%,自产有机磷超标率17%,进京菜,农药超标率69%。,4) 上海,广西,天津相继发生甲胺磷污染蔬菜造成急性中毒事件,中,毒人数达数百人。,5) 调查结果表明，有机磷(甲胺磷,乙酰甲胺磷,氧乐果,敌敌畏等)和氨基甲酸酯(克百威)是造成蔬菜中农残超标,引发急性中毒的主要农药品种。,（三）国内农残检测面临任务,基于上述情况造成农产品(蔬菜),污染严重,国际市场-出口受阻(面临法规,标准;检测技术,方法的严重挑战)。,国内市场-消费者忧心重重(放心工程)。,农业部实施无公害食品行动计划，建立农药残留检测系统。,急需建立与国际接轨的农残检测技术,标准操作程序(SOP)和GLP,实验室,取代我国现有检测农药品种数量单一、前处理复杂、费时、灵,敏度，准确度差的农残检测方法，以出具科学,公正,国际认可的农残,检测数据。,（四）CDFA-MRSM特点,一 简介,CDFA-MRSM,是由,California Department of Food and Agriculture (CDFA),下属,Center of Analytical Chemistry(CAC),开发的农药多残留快速扫描技术,(Multiresidue screen method-MRSM),适用于新鲜蔬菜水果中四大类（有机磷、有机氯、拟除虫菊酯、氨基甲酸酯）200多种农药母体 、代谢物、降解产物的检测,固相萃取代替液-液萃取, 氮吹仪浓缩代替旋转蒸发仪,双毛细管柱、双检定器、GC、HPLC定性定量，GC/MS确证,是美国农业部(USDA)、FDA、EPA认可的官方方法,在加州CDFA、佛罗里达州FDOACS(Florida Department of Agriculture and Consumer Services)和 Washington Department of Agriculture等实验室使用，,质量保证和方法认证程序，遵从美国农业部农药数据库项目(USDA、PDP)和EPA、FDA的GLP规定,97年引入中国，在农业部环境监测总站（天津），Agilent实验室，北京锦绣大地农业股份有限公司检测中心验证和应用，即将批准为国家标准和农业行业标准检测方法。,二 CDFA-MRSM在中国实验室验证技术指标表,项目,类别,添加浓度范围,（ppm）,平均回收率（%）,变异系数,MDL（ppm）,Agilent实验室,CH: 0.01-1.00,OP: 0.05-3.00,CARB: 0.05-0.50,70-120%,20%,CH: 0.0001-0.0480 (ECD),OP: 0.0250-0.6000 (FPD),CARB: 0.0010-0.0030 (FLD),农业部环境监测总站,（天津）,CH: 0.01-4.25,OP: 0.05-2.00,CARB: 0.10-0.55,70-120%,20%,CH: 0.0011-0.1154 (ECD),OP: 0.0065-0.1725 (FPD) 0.0104-0.8625 (NPD),CARB: 0.0051-0.0106 (FLD),北京锦绣大地检测中心,CH: 0.01-1.00,OP: 0.05-3.00,CARB: 0.05-0.50,70-120%,20%,CH: 0.0001-0.0170 (ECD),OP: 0.0100-0.2000 (FPD),CARB: 0.0010-0.0020 (FLD),CDFA,CH: 0.2 1.6,OP: 0.25,CARB: 0.25,70-120%,20%,0.005-0.2,三 方法评价,CDFA-MRSR与传统方法比较,MRSM（CDFA),传统方法(国标方法),萃,取,方 式,固相萃取,液-液萃取,溶 剂 用 量,15ml 士/样,100ml 士/样,时 间,10-15分/样（不需脱水）,60-120分/样（脱水）,浓,缩,仪 器,氮吹仪,旋转蒸发仪或K-D浓缩器,时 间,3-5分/样,15-20分/样,损 失 率,3%,10-20%或10%,净,化,时 间,不需净化,柱层析（有机氯），30-60分/样,溶 剂 用 量,0ml/样,50-100ml/样,前处理总消耗时间,0.5-1小时/样,2-3小时/样（有机磷）,8-12小时/样（有机氯）,检测农药类型,一次处理可同时检测有机磷、有机氯、菊酯、氨基甲酸酯类,不同农药采用不同方法分别处理,检测农药数量,200种（一次处理）其中：有机磷80种、,有机氯、菊酯100种氨基甲酸酯20种,34种（分类处理）其中：,有机磷20种有机氯11种菊酯3种,检测准确度、灵敏度,步骤简单、损失小；毛细管柱，双柱、双检定器同时定性、定量。检测准确度、灵敏度高。,步骤多、易损失；一般用填充柱、单检定器定性、定量,检测时间,未知扫描200种（一次处理）,1-1.5小时/样,80%,成本高，步骤多（LLE，CH,2,CL,2,),灵敏度、准确度高,CDFA,（GC、HPLC、GC/MS),乙 腈,FL,NH,2,-Propyl,200,70-120%,成本较低,快速简便,（无LLE，少量CH,2,CL,2,),Canada,(GC/MS),乙 腈,C,18,Envirocarb NH,2,-Propyl;,Chorcoal-celite,201,70-110%,DDVP、甲胺磷、乙酰甲胺磷、百菌清、氯硝铵 R70%,成本较高,简便快速,（无LLE，CH,2,CL,2,),（五）CDFAMRSM要求的仪器配置,农药,类别,仪器,进样器,色谱柱,检定器,数据处理,有机氯、,菊酯类,GC,Agilent,6890,自动进样器,HP-1 或 DB-1,30m0.25mm0.25m,HP-50+ 或 DB-17,30m0.25mm0.25m,ECD,ECD,一台化学工作站控制二台气谱,有机磷类,GC,Agilent,6890,自动进样器,HP-1或DB-1,30m0.53mm1.5m,HP-17或DB-17,30m0.53mm1.0m,FPD,FPD,氨基甲酸酯类,HPLC(带,柱后衍生系统),Agilent11,00,Pickering5200,自动进样器或手动进样,C,8,4.6mm250mm，5,C,18,4.6mm250mm，5,FLD,积分仪或化学工作站,确证,GC-MS,Agilent,5973,自动进样器,HP-5MS 30m0.25mm0.25m,MSD,化学工作站,（六）保留时间锁定功能,保留时间锁定软件（Retention Time Locking）介绍,气相色谱是现代分析仪器当中分析复杂有机样品的有力工具。气相色谱,依据样品当中不同化合物在同一根色谱柱上保留时间的差异对其进行定,性分析。在不同的操作条件下，不同的仪器上同一化合物的保留时间会,发生漂移。即使在同一台仪器上，相同的操作件下，由于载气压力的变,化或者由于色谱柱的长度发生变化同样会导致化合物的保留时间发生变,化。所有这些都给化合物的定性带来困难。,Agilent 公司独有的保留时间锁定软件利用6890N气相色谱精确的EPC控制技术，通过绘制保留时间与载气压力的关系曲线，可将目标化合物的保留时间牢牢锁定。而分析方法一旦被锁定，在其被移植到其它仪器上时，也能确保目标化合物的保留时间保持恒定。,第三部分 CDFA-MRSM标准 操作程序(SOP),（一） 流程示意图,技术关键:,1.前处理采用固相萃取,2.气相色谱配置双柱双检定器,液相色谱配置荧光检定器和,柱后衍生系统,3.用气质确证,称 样,溶剂提取,静止分层，取3份,蒸发浓缩,溶 解（己烷）,固相萃取柱,（FL，1g）,定 容,GC-ECD,（100种）,溶 解（丙酮）,定 容,确 证,GC-MS,溶解（甲醇/二氯甲烷）,固相萃取柱,（NH,2,，0.5g）,微孔滤膜,LC-FLD,（20种）,定 容,微孔滤膜,GC-FPD,（80种）,（二） 操作程序,一 目的,为了保证新鲜水果和蔬菜中的农药残留在法定的最大残留允许限,量（MRLs）以下，达到安全农产品的要求，提供CDFAMRSM方,法的一个标准操作程序，以便对有机磷（OP），有机氯（包括拟,除虫菊酯）（CH）和 N甲基氨基甲酸酯（CARB）类农药准确定,性、定量。,（二） 操作程序,二 内容提纲,1仪器设备,2试剂和实验材料,3样品制备方法,4分析方法,5定性,6定量,7确证,8报告,9每日仪器状态测试,10农药标准品的管理及标样配制操作规程,11仪器常规维护,三 正文,1 仪器设备,食品加工器 Hobart Chopper model 8181或博郎食品加工机（1L, 德国）,恒温水浴锅（六孔或八孔),旋涡混合器,匀浆机 OMNI MIXER HOMOGENIZER 17106,氮吹仪 NEVAP Nitrogen Evaporation System Models 112,气谱配有双电子捕获检测器（ECD）,气谱配有双火焰光度检测器（FPD）,液谱（梯度淋洗）配有柱后反应装置和荧光检测器（FLD）,（二） 操作程序,三 正文,2 试剂和材料,乙腈（农药残留级）,丙酮（农药残留级）,已烷（农药残留级）,甲醇（农药残留级、色谱纯级）,氯化钠（ACS级）检验不含有机干扰物，在120下烘过夜,试剂1：NaOH溶液（0.5N） pickering,(cat.NO CB130),试剂2：OPA diluent pickering,(cat.NO CB910,O-Phthaladehyde(OPA) pickering,(cat.NO 0120),Thiofluor pickering (cat.No 3700-2000),（二） 操作程序,三 正文,2 试剂和材料,具塞量筒（100ml）,玻璃注射器（5.0ml，1.0ml）,玻璃漏斗（60,9公分，短颈3-4吋）,刻度离心试管（15ml）,聚乙烯塑料并（300ml，可在-18冷冻柜中放置）,定量滤纸 检验无干扰物（15公分）,烧杯 （100ml）,移液器 10.0ml,Florisil,固相萃取柱（1g，Agilent，AccuBOND II，Part No. 188-2460 或Supelco，Supelclean Envi-Florislil， Reorder No.57053),Aminopropyl,固相萃取柱（500mg，Agilent，AccuBOND II，Part No.188-1050 或 Supelco，Supelclean LC-NH2，Reorder No.57014）,（二） 操作程序,三 正文,2 试剂和材料,微孔滤膜（0.2m 25mm，0.45m 13）,样品瓶（棕色或无色，2ml，Agilent Part No.5182-0554或5018-0864）,标样储备瓶 Agilent Part No.5183-4529（16ml），5183-4530（40ml）,GC预柱 1.0m（Agilent脱活石英柱0.25mm Part No.19091-60610；,0.53mm Part No.19095-60610）,HPLC预柱 C-18预柱（Pickering，4.6mm4.5cm Part No.18ECG002）,分析柱：,ECD 100%聚二甲基硅氧烷（DB-1或HP-1）30m0.25mm0.25m，,HP-1 Part No.19091Z-433 或 J&W，DB-17 Part No.122-1732,（二） 操作程序,三 正文,2 试剂和材料,FPD 100%聚二甲基硅氧烷(DB-1或HP-1),30m0.53mm1.50m ，HP-1 Part No.19095Z-323；或J&W，,DB-1 Part No.125-1032,50%聚二苯基甲基硅氧烷(DB-17或HP-50+),30m0.53mm1.0m ，HP-50+ Part No.19095L-023；或J&W，,DB-17 Part No.125-1732,MSD HP-5MS 30m0.25mm0.25m，HP-5MS Part No.190191S-433,HPLC C8 4.6mm25cm，5m Pickering，Part No.1846250,C18 4.6mm25cm，5m Pickering，Part No.1846150,（二） 操作程序,三 正文,3 样品制备方法,3.1样品处理,a.每日从市场抽测蔬菜水果样品进行OP、CH、CARB类农药快速扫描，样品数量,不少于5个，重量不少于454克。,样品按照联邦法规40#(40-Code of Federal Requlations)第180.1条规定的方法,处理。不进行洗涤。,（二） 操作程序,下面列举某些样品的处理方法,种 类,处 理,杏仁和所有坚果,去壳取果肉,鳄 梨,去 籽,香蕉、芭焦,去冠、去干、去皮,豆类、利马豆、豆角,全 部,甜菜、日本萝卜、小红萝卜,根茎和叶子分别取样，检测,胡萝卜,去 顶,樱 桃,去 籽,柑橘类(桔子、柠檬、酸橙、柚子),剥 皮,椰 子,取果肉、果汁,玉 米,去种皮,日本萝卜,同甜菜,大蒜、洋葱,去茎、去皮(剥净),葡 萄,去 茎,韭 葱,去 根,芒 果,去 核,下面列举某些样品的处理方法,瓜,去 茎,油 桃,去 核,葱,去 根,番木瓜果,去 核,豌 豆,全 部,桃,去 核,花 生,只要花生仁,青 椒,全 部,菠 萝,去 皮,李 子,去 核,小红萝卜,同甜菜,草,莓,去 帽,小南瓜,带 茎,西红柿,全 部,种 类,处 理,三 正文,3 样品制备方法,3.1样品处理,b.对于较大样品如西瓜、土豆、,茄子等先切成块，以适于在食品,加工器中加工，切样品时，菜板,上要垫牛皮纸，每个样品换一张，,菜刀每个样品要冲洗一次。要保,证样品均匀有代表性，不要切的,太碎或成为液体。,c.在食品加工器中加工样品，将,加工好的样品装入聚乙烯瓶中（图4）。,（二） 操作程序,图 4. 样品处理-切块、食品加工器加工,三 正文,3 样品制备方法,在匀浆机的玻璃瓶中准确称取50.0g或25.0g在食品加工器中加工好的样品（图5）。聚乙烯瓶中剩余的样品放入冷冻柜中保存。,在样品中加入农药标样，测定添加回收率,(图6)。,（二） 操作程序,图 5. 样品萃取-匀浆机瓶中称取样品,图 6. 在样品中加入农药标样，测定添加回收率,三 正文,3 样品制备方法,3.2.2.加入100ml或50ml乙腈( 图7）,（二） 操作程序,图 7. 加入乙腈提取液,三 正文,3 样品制备方法,3.2.3在匀浆机中高速匀浆2分钟（图8）。,（二） 操作程序,图 8. 在OMNI匀浆机中高速匀浆,三 正文,3 样品制备方法,在100ml具塞量筒内放10-15g或5-7.5gNaCl(图9)，放一铺有滤纸的玻璃漏斗，过滤匀浆好的样品(图10)。,（二） 操作程序,图 9. 具塞量筒内加入NaCl,图 10. 过滤样品,三 正文,3 样品制备方法,3.2.5 收集约80ml-100ml或40ml-,50ml滤液。,3.2.6 盖上塞子，剧烈震荡1分钟。,3.2.7 在室温下静置约10分钟，,让乙腈相和水相分层(图11）。,（二） 操作程序,图 11. 静置分层,（二） 操作程序,三 正文,3 样品制备方法,3.3 样品净化,3.3.1 蒸发,a. 准确吸取10ml3乙腈相溶液（上层）,分别放入3个100ml烧杯中。,b. 将烧杯放在水浴锅（80）上用蒸,汽加热，杯内缓缓通入氮气或空气流,吹动（注意：气管距液面有一定距,离），蒸发近干（图12）。分别加入,2ml丙酮、2ml已烷和2ml 1%甲醇/二氯,甲烷溶液（v/v），盖上铝箔以免蒸发，,用于OP、CH和CARB检测。,图 12. 恒温水浴锅上蒸发赶走乙腈溶剂,三 正文,3 样品制备方法,3.3 样品净化,3.3.2用于有机磷检测,a将烧杯中用2ml丙酮溶解的样品溶液，完全转移至15ml离心管中，再用,约3.0ml丙酮分二次洗烧杯，并转移至离心试管，最后准确定容至5.0m。,b在旋涡混合器上混匀试管中的溶液。,c分别倒入二个气相色谱样品瓶中，用GC-FPD分析。,d混匀后，如样品过于混浊，可用0.2m滤膜，放在5ml注射器顶端，将丙,酮溶液过滤,再用GC分析。,（二） 操作程序,三 正文,3 样品制备方法,3.3 样品净化,3.3.3 用于有机氯检测,aFlorisil,固相萃取柱（1g），,用5ml 10%丙酮/已烷（v/v）,条件化，再加5ml已烷。,b当溶剂液面到达柱吸附层表面,时，立即将烧杯中用2ml已烷,溶解的样品溶液加到已条件化的,Florisil柱上，并用15ml离心管,接受洗脱液。靠重力过柱，逐滴,流下 。如果流速过慢适当加点正,压，使溶液成滴连续流下（图13）。,（二） 操作程序,图 13. 有机氯样品用Florisil SPE柱净化,三 正文,3 样品制备方法,3.3 样品净化,3.3.3 用于有机氯检测,c用5ml 10%丙酮/已烷（v/v）洗烧杯，当液面到达柱吸附层表面时，,加到柱上洗脱。,e将15ml离心管收集的洗脱液放在氮吹仪（水浴温度55）上，通氮,气或空气，缓缓蒸发至5.0ml。,f用已烷准确定容至5.0ml。,g在旋涡混合器上混匀试管中的溶液。,h分别倒入二个气相色谱样品瓶中，用GC-ECD分析。,（二） 操作程序,三 正文,3 样品制备方法,3.3 样品净化,3.3.4 用于 N-甲基氨基甲酸酯检测,aaminopropyl固相萃取柱，用,4ml 1%甲醇/二氯甲烷（v/v）,条件化。,b当溶剂液面到达柱吸附层表面,时，立即加入用2ml 1%甲醇/,二氯甲烷（V/V）溶解的样品,溶液，用15ml离心管收集洗,脱液，靠重力过柱，逐滴流,下（图14）。,（二） 操作程序,图 14. 氨基甲酸酯样品用NH,2,SPE柱净化,三 正文,3 样品制备方法,3.3 样品净化,3.3.4 用于 N-甲基氨基甲酸酯检测,c用2ml 1%甲醇/二氯甲烷（V/V）,洗烧杯，过柱。,e将15ml离心管收集的洗脱液放,在氮吹仪（55）上，在缓缓,的氮气或空气流下蒸发至近干,（0.1ml）（图15）。,（二） 操作程序,图 15. 样品在氮吹仪上浓缩,三 正文,3 样品制备方法,3.3 样品净化,3.3.4 用于N-甲基氨基甲酸酯检测,f用甲醇准确定容至2.5ml。,g在混合器上混匀试管中的溶液 （图16）。,h用0.2m滤膜放在5ml注射器顶,端，将甲醇溶液过滤，用HPLC分,析。,（二） 操作程序,图 16. 漩涡混合器上混匀样品,（二） 操作程序,三 正文,4 分析方法,4.1 进样程序,遵循下列程序：溶剂、低浓度混标、高浓度混标、溶剂、样品（13,个），低浓度混标。,4.2 有机磷扫描,4.2.1仪器配置：气谱装有双柱（DB-1、DB-17）、双FPD（P型）、自动,进样器，恒压控制、化学工作站或数据处理机。（Agilent 6890）,4.2.2进样量：1l,4.2.3操作条件：进样口220，检测器250，柱温150，保持2min，以,8/min升温至250，保持12min；载气为氮气或氦气，流速分别为,10ml/min或氦气DB-1，12ml/min；DB-17 12ml/min，保持13min，以,2ml/min速度增加至15ml/min，保持5min，氢气75ml/min，空气,100ml/min。,三 正文,4 分析方法,4.3 有机氯扫描,4.3.1仪器配置：气谱装有双柱（DB-1，DB-17）、双ECD、自动进样器、,恒压控制、化学工作站或数据处理机。（Agilent 6890）,4.3.2 进样量：1l,4.3.3 操作条件：进样口温度200，检测器320，柱温150，保持,2min，以6/min升温至270，保持8min（溴氰菊酯保持23min）,载气为氮气或氦气，流速分别为1ml/min或2.3ml/min,尾吹气为氮,气60ml/min。,4.3.4 对于本底干扰大的样品，如绿菜花、洋葱、蒜，用4.3.1气谱上装,有双ELCD（电解电导检测器）进2l样品，进样口200，检测器,250，柱温160，保持1min，以10/min升温至250，保持,15min，氦气流速20ml/min，尾吹气氮气65ml/min。,注：双柱为：DB-5 10m0.53mm2.65m；,DB-17 30m0.53mm0.25m.,（二） 操作程序,三 正文,4 分析方法,4.4 N,-甲基氨基甲酸酯扫描,4.4.1仪器配置：HPLC装有四元泵溶剂梯度淋洗系统，自动,进样器，化学工作站或数据处理机（Agilent 1100）；,柱后衍生和双试剂系统（Pickering,Post Column,System），荧光检测器。,4.4.2进样量：20l,（二） 操作程序,溶剂梯度,时间（min）,乙腈（%）,水（%）,0,20,80,2,20,80,16