免疫球蛋白与抗体

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2020/11/3,河南科技大学动物科技学院程相朝,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2020/11/3,河南科技大学动物科技学院程相朝,*,第二章 免疫球蛋白与抗体,第一节 免疫球蛋白与抗体的概念,(,重点,),第二节 免疫球蛋白的分子结构,(,重点,),第三节 免疫球蛋白的种类与抗原决定簇,(,重点,),第四节 免疫球蛋白的生物学功能,(,重点,),第五节 各类免疫球蛋白的主要特性与功能,第六节 抗体的人工制备,2020/11/3,1,一、抗体的发现和研究历史：,1889,年：,绿脓杆菌,感染,动物血清,凝集反应,（凝集素）,1890,年,(Behring):,白喉类毒素,免疫,动物血清,绿脓杆菌,白喉毒素,中和毒素,(,抗毒素,),第一节 免疫球蛋白与抗体的概念,2020/11/3,2,并发现在血清蛋白中主要是,-,球蛋白（丙种球蛋白）具有抗体活性。,抗体,(antibody,，,Ab),凝集素,抗毒素,溶菌素,沉淀素,1930,年发现：,2020/11/3,3,血清蛋白电泳图谱显示：,白蛋白,球蛋白,a,b,g,a,b,g,a,b,g,未免疫动物血清,免疫动物血清,免疫动物血清,+,抗原处理吸收,后,2020/11/3,4,二、抗体的概念,(,重点,),抗体（,antibody,Ab),：,动物机体受到抗原物质刺激后，由,B,淋巴细胞转化为浆细胞而产生的，能与相应抗原发生特异性反应的免疫球蛋白。,将抗体介导的免疫称为,体液免疫,将含有抗体的血清称为,抗血清,或,免疫血清,。,2020/11/3,5,三、免疫球蛋白的概念,(,重点,),1964,年世界卫生组织召开会议，将,具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白,统称为,免疫球蛋白,（,immunoglobulin,，,简称,Ig,）。,免疫球蛋白除分布于体液中之外，还可存在于,B,细胞膜上。,2020/11/3,6,免疫球蛋白可分为,两种,类型：,分泌性,Ig,：存在于血清、体液以及分泌液中，具有抗体的各种功能。,膜型,Ig,：位于,B,淋巴细胞的表面，即膜表面免疫球蛋白（,mIg,），是,B,淋巴细胞的抗原识别受体（,BCR,）。,2020/11/3,7,抗体的化学本质是,免疫球蛋白,，但并非所有免疫球蛋白都具有,抗体的活性,。,Ig,Ab,Ab=Ig,Ig,Ab,Ig,与,Ab,的关系,抗体,=,生物学功能上的概念,Ig,=,化学结构上的概念,2020/11/3,8,四、抗体的分类,（一）根据所对应的抗原分：,2020/11/3,9,（二）根据,有无抗原刺激分,：,2020/11/3,10,（三）根据与抗原反应的性质分：,2020/11/3,11,（四）根据根据抗原性分：,主要根据重链的不同,2020/11/3,12,第二节 免疫球蛋白的分子结构,一、免疫球蛋白的单体分子结构,由,两条相同,的较大的,重链,和,两条相同,的较小的,轻链,4,条肽链通过轻链与重链之间的,二硫键,连接起来构成的,“,Y,”,字形的分子结构。,2020/11/3,13,2020/11/3,14,（一）重链和轻链,1,重链（,heavy chain,，,H,链）,由,450-550,个氨基酸残基组成，分子量,55-75KD,，有,4-5,个链内二硫键组成的环肽，两重链之间由一对或两对以上的二硫键互相连接。,根据,Ig,重链抗原性的差异，,Ig,可分为,5,类：,IgG,、,IgM,、,IgA,、,IgE,和,IgD,，,相应,H,链为,、,、,、,、,链，,不同免疫球蛋白的差别就由重链所决定。,2020/11/3,15,2,轻链（,light chain,，,L,链）,由,214,个氨基酸残基组成，分子量为,24KD,，有两个由链内二硫键组成的环肽，在羧基端靠二硫键分别与两条重链连接。,各类免疫球蛋白的轻链都相同，均可分为：,Kappa,（,）与,lambda,（,）,2,个型。,2020/11/3,16,（二）可变区和恒定区,1,、,H,链：,N,端开始的最初,110,个氨基酸为,可变区,（,VH,），之后一直到,C,端的氨基酸称为,恒定区,（,CH,）。在,VH,中有,3,个区域的氨基酸变异最大，称为,高（超）变区,（,HVR,），其余的氨基酸变化较小，称为,骨架区,。,2,、,L,链：,N,端开始的,109,个氨基酸为,可变区,(VL,），其余的为,恒定区（,CL,）,，,在,VL,中也有,3,个高变区,。,2020/11/3,17,2020/11/3,18,（三）功能区,1,、基本含义,免疫球蛋白的多肽链分子可折叠形成几个由链内二硫键连接成的环状球形结构，此即其,Ig,的,功能区（或结构域,），每一功能区约有,110,个氨基酸组成，其顺序具有高度的同源性。,2,、,L,链功能区,有两个，即,VL,和,CL,，分别位于可变区和恒定区。,3,、,H,链功能区,IgG,、,IgA,、,IgD,有,4,个,（,V,区,1,个，,VH,，,C,区,3,个，,CH1,、,CH2,和,CH3,）；,IgM,、,IgE,有,5,个,（增加一个,CH4,）。,2020/11/3,19,2020/11/3,20,4,、功能区作用,（,1,）,VH,和,VL:,特异性识别和结合抗原，,由,VH,和,VL,内的高变区构成抗体分子的抗原结合点。,（,2,）,CH1,和,CL :,同种异型的遗传标记,。,（,3,）,IgG,的,CH2,和,IgM,的,CH3,是抗体分子的补体结合点，,与补体的活化有关。,（,4,）,CH3/ CH4:,细胞结合位点，,是同免疫活性细胞（如巨噬细细胞、,B,细胞、,NK,细胞）的,FC,受体的结合部位。,2020/11/3,21,二、免疫球蛋白的特殊分子结构,（一）绞链区,1,、含义,在两条重链之间二硫键连接处附近的重链恒定区，即,CH1,尾部和,CH2,头部的小段肽链；与抗体分子的构型变化有关,称为,绞链区,。,2,、功能,含有丰富的,脯氨酸,，,因此易伸展弯曲，当抗体与抗原结合时，该区可转动，一方面使可变区的两个抗原结合点尽量与抗原结合，另一方面可使抗体分子变构，使补体结合位点暴露出来,。,且易被,木瓜蛋白酶、胃蛋白酶,等水解。,2020/11/3,22,2020/11/3,23,（二）,J,链和分泌成分,1,、,J,链 即连接链,是一条多肽链，富含半胱氨酸,;,由浆细胞合成,;,以二硫键的形式共价结合到,Ig,的重链上,;,在,IgM,和分泌型,IgA,单体之间起连接作用。,2020/11/3,24,2,、分泌成份（,SC),（,1,）是二聚体,IgA,上的一个辅助成分；,（,2,）由上皮细胞合成，化学本质为糖蛋白,（,3,）以共价形式结合到,IgA,分子，并一起被分泌到粘膜表面，又称分泌片（,secretory piece, SP,）；,（,4,）可抵抗外分泌液中的蛋白水解酶对二聚体,IgA,的降解。,2020/11/3,25,2020/11/3,26,（三）单体、双体和五聚体,1,、单体,由一对,L,链和,H,链组成的基本结构。,2,、双体,分泌型的,IgA,由,J,链连接的两个单体。,3,、五聚体,IgM,是由,J,链和二硫键连接的五个单体。,2020/11/3,27,（一）木瓜蛋白酶酶切结果,木瓜蛋白酶,可将,H,链铰链区二硫键的近,N,端切断，得到大小相近的,3,个片段；其中有两个相同的片段，称,抗原结合片段（,Fab,）,，,另一个为,FC,片段,，可形成蛋白结晶。,三、免疫球蛋白的水解片段与生物学活性,2020/11/3,28,（二）胃蛋白酶酶切结果,胃蛋白酶,可将,H,链从铰链区二硫键的近,C,端切断，得到一个具有双价活性的,F(ab),2,片,段和若干个小分子多肽碎片,（,pFc,）。,F(ab)2,片段与抗原结合可发生凝集和沉淀反应，,pFc,片段失去生物学活性。,2020/11/3,29,2020/11/3,30,一、免疫球蛋白的种类,免疫球蛋白可区分为类、亚类、型、亚型等。,（一）类,免疫球蛋白,类,的区分是依据其,重链,C,区的理化特性及抗原性,的差异，在同种系所有个体内的免疫球蛋白可分为,IgG,、,IgM,、,IgA,、,IgE,、,IgD,五大类,(class),重链分别称为,链,。,（二）亚类,同一种类免疫球蛋白，又可根据其,重链恒定区的微细结构、二硫键的位置与数目及抗原特性,的不同，进一步分为,亚类,（,subclass,）。如人的,IgG,有,IgG1,、,IgG2,、,IgG3,和,IgG4,四个亚类。,第三节 免疫球蛋白的种类与抗原决定簇,2020/11/3,31,（三）型,根据轻链恒定区的抗原性不同，各类免疫球蛋白的轻链分,为,和,两个型,（,type,），任何种类的免疫球蛋白均有两型轻链分子。,（四）亚型,根据,型轻链,N,端恒定区上氨基酸排列顺序的差异，免疫球蛋白又,可分为若干亚型,（,subtype,），,型轻链无亚型。,（五）亚群,根据免疫球蛋白,V,区的一级结构特点，可将免疫球蛋白,分为,3,5,个亚群,（,subgroup,）。,2020/11/3,32,二、免疫球蛋白的抗原决定簇（血清型）,（一）同种型决定簇,指在同一种属动物所有个体的,Ig,分子共同具有的抗原特异性标志，为,种属型标志,。即是说在同一种动物不同个体之间同时存在不同类型的免疫球蛋白，不表现出抗原性，只是在异种动物之间才表现出抗原性。同种型抗原决定基存在于,Ig C,区，表现在全部,Ig,的类、亚类、型、亚型分子上。,2020/11/3,33,（,二）同种异型决定簇,指免疫球蛋白在同一种动物不同个体之间呈现出的抗原性，为,个体型标志,。,同种异型抗原决定基广泛存在于,Ig CH,和,CL,区。,2020/11/3,34,（三）独特型决定簇,由抗体分子的可变区呈现出的抗原性就称为免疫球蛋白（抗体）的,独特型,(,重点,),，,或称个体基因型,，可变区内的抗原决定簇称为,独特型决定簇,，是,每个免疫球蛋白分子所特有的抗原特异性标志。,其中单个的抗原决定簇，又称为,独特位,。,独特型在异种、同种异体乃至同一个体内均可刺激产生相应的抗体，这种抗体称为,抗独特型抗体,。,2020/11/3,35,2020/11/3,36,第四节,免疫球蛋白的生物学功能,一、免疫球蛋白,V,区的功能：,主要是识别和结合特异性抗原,2020/11/3,37,（一） 激活补体,IgG1-3,和,IgM,与相应抗原结合后，可因构型改变而使其,CH2/CH3,功能区内的补体结合点暴露，从而激活补体,经典途径,。,IgG4,、,IgA,和,IgE,的凝聚物可激活补体,旁路途径,。,二、免疫球蛋白,C,区的功能,2020/11/3,38,1.,调理作用,(,重点,),IgG,与细菌等颗粒性抗原结合后，可通过其,Fc,段与巨噬细胞和中性粒细胞表面相应,IgG Fc,受体结合，促进吞噬细胞对细菌等颗粒抗原的吞噬，此即抗体的调理吞噬作用。,（二）结合,Fc,受体,2020/11/3,39,2.,抗体依赖细胞介导的细胞毒作用（,ADCC,）,(,重点,).,IgG,与肿瘤或病毒感染的靶细胞结合后，可通过其,Fc,段与,NK,细胞、巨噬细胞和中性粒细胞表面相应,IgG Fc,受体结合，增强,NK,细胞和触发吞噬细胞对靶细胞的杀伤作用，此即,ADCC,效应。,2020/11/3,40,3.,介导,I,型超敏反应,IgE,引起,I,型超敏反应,2020/11/3,41,（三）穿过胎盘和粘膜,IgG,、,sIgA,2020/11/3,42,一、,IgG,人和动物中,含量最高,的免疫球蛋白，,占血清总,Ig,的,75%,80%,，半衰期约,20,23,天；,主要由脾脏和淋巴结中的浆细胞产,生，大部分存在于血液中（,45%,50%,），,其余存在于组织液和淋巴液中；,IgG,是,惟一可通过人和兔胎盘的抗体,，在新生动物抗感染中起重要作用。,IgG,是动物自然感染和人工主动免疫后，机体所产生的主要抗体，,是动物机体抗感染免疫的主力,，大多数抗菌、抗病毒抗体和抗菌素都为,IgG,类，因而也是,血清学诊断和疫苗免疫后监测的主要抗体,；,IgG,还参与抗肿瘤免疫，同时也是引起,型、,型变态反应及自身免疫病的抗体,。,IgG,通过经典途径活化补体，具有调理吞噬、介导,ADCC,、结合,SPA,和结合链球菌,G,蛋白的作用。,第五节 各类免疫球蛋白的主要特性与功能,2020/11/3,43,动物机体初次免疫后,产生最,早,的免疫球蛋白；但含量仅占血清,Ig,的,10%,左右，,主要由脾脏和淋巴结中的浆,细胞产生，一般不能通过血管壁，,主要分布于血液中；,IgM,是,5,个单体组成的五聚体,（,pentamer,）,又称为,巨球蛋白,（,macroglobulin,）。,IgM,在体内产最早，但持续时间短，不是抗感染免疫的主力，但对,早期抗感染免疫和早期血清学诊断,十分重要，并且,IgM,有多个抗原结合部位，其单个的杀菌、溶菌、溶血、促进吞噬及凝集作用，均较,IgG,高；,IgM,同样具有抗肿瘤作用，也是,型,型变态反应及自身免疫病的抗体,。,膜表面,IgM,是,BCR,的主要成分。只表达,mIgM,是未成熟,B,细胞的标志，记忆,B,细胞表面的,mIgM,逐渐消失。,二、,IgM,2020/11/3,44,2020/11/3,45,IgA,以单体和二,聚体两种分子形式存在,单体,存在于血清中，称,为血清型,IgA,占血清,Ig,的,10%,20%,，,二聚体为分泌型,IgA,是由呼吸道、消化道、泌尿生殖道等部位粘膜固有层中的浆细胞所产生。主要存在于呼吸道、消化道、生殖道的外分泌液及初乳、唾液、泪液等分泌物中。,分泌型,IgA,是,参与粘膜局部免疫,的主要抗体，在传染病预防接种中，经滴鼻、点眼、饮水及喷雾途径免疫，均可产生分泌型,IgA,，从而建立相应的粘膜免疫力。,婴幼儿和幼畜禽从母乳中可获得,sIgA,产生,自然被动免疫,，,新生儿和幼畜禽易患呼吸道、胃肠道感染可能与,IgA,合成不足有关。,三、,IgA,2020/11/3,46,IgE,产生部位与分泌型,IgA,相似，是血清中含量最低的,Ig,。,IgE,的重链多一个功能区,CH4,，此区是细胞结合的部位，因而它是一种亲细胞性抗体。, 结合在肥大细胞和嗜碱性细胞上的,IgE,与抗原结合后，能引起这些细胞脱颗粒，释放组织氨等活性介质，从而引起,I,型过敏反应,。,IgE,在抗寄生虫感染,中具有重要作用，研究表明，蠕虫、血吸虫和旋毛虫等寄生虫病以及某些真菌感染后，均可诱导机体产生大量的,IgE,抗体。,五、,IgD, IgD,在个体发育的任何时候产生，在血清中浓度极低，平均约,0.03mg/ml,，且极不稳定，容易降解，半衰期仅,3,天；, 主要作为成熟,B,细胞膜上的抗原特异性受体，是,B,细胞分化发育成熟的标志,，成熟,B,细胞活化后，或者变成记忆,B,细胞时，,mIgD,逐渐消失。, 对防止免疫耐受有一定作用,四、,IgE,2020/11/3,47,各类免疫球蛋白的生物学活性,免疫球蛋白,IgG,IgA,IgM,IgD,IgE,重链名称,重链功能区数目,4,4,5,4,5,主要存在形式,单体,单体、双体,五聚体,单体,单体,分子量,(KD),146-170,160,，,400,970,175,188,碳水化合物（,%,）,4,10,12,18,12,血清浓度,(mg/dl),1150300,21050,150,0.3-4,0.002,血清总,Ig (%),75,10,5-10,1,0.001,外分泌液,-,+,+,-,-,经典途径活化补体,+,-,+,-,-,代替途径活化补体,+,+,?,+,+,半衰期（天）,20-23,5.8,5.1,2.8,2.5,合成部位,脾、淋巴结浆细胞,粘膜相关淋巴样组织,脾、淋巴结浆细胞,扁桃体、脾浆细胞,粘膜固有层浆细胞,通过胎盘,+,-,-,-,-,免疫作用,抗菌、抗病毒、抗毒素、自身抗体,粘膜局部免疫作用，抗菌、抗病毒，免疫排除功能,早期防御作用，溶菌，溶血，,SmIgM,，天然血型抗体，类风湿因子,确切功能目前不清楚,抗寄生虫感染，,I,型超敏反应,2020/11/3,48,一、多克隆抗体（第一代抗体）,（一）概念,(,重点,).,采用传统的免疫方法，将抗原物质经不同途径注入动物体内后，经数次免疫后采取动物血液，分离出血清，由此获得的抗血清即为,多克隆抗体,（,polyclonal antibody, PcAb,），该抗血清是一种多克隆的混合抗体，具有高度的异质性，即针对同一抗原决定簇的抗体仍是由不同,B,细胞克隆产生的不同质的抗体所组成。,（二）基本制备过程,抗原制备,动物免疫,检测血清抗体效价,血清分离与保存。,第六节 抗体的人工制备,2020/11/3,49,2020/11/3,50,二、单克隆抗体（第二代抗体）,(,重点,).,（一）概念,由一个,B,细胞分化增殖的子代细胞（浆细胞）克隆、产生的针对单一抗原决定簇的抗体，或者说是由一个识别一种抗原表位的,B,细胞克隆产生的同源抗体，,称为单克隆抗体,（,McAb,）。,2020/11/3,51,（二）优点,1.,有高度的,单一性、均一性,；,2.,纯度高,，制备时不需纯化抗原就可得到纯抗体；,3.,效价高,；,4.,产量高,，且可连续生产特异性强；,5.,特异性强,，少或无血清交叉反应。,2020/11/3,52,（三）制备单克隆抗体的基本原理,（,1,）,DNA,合成的,2,条途径, 主要途径：可被,氨基喋呤,(A),所阻断, 旁路途径：利用,次黄嘌呤,(H),和,胸腺嘧啶核苷,(T),次黄嘌呤,-,鸟嘌呤磷酸核糖转移酶,(HGPRT),胸腺嘧啶核苷激酶,(TK),。,所需要的酶,2020/11/3,53,（,2,）所用的细胞,2020/11/3,54,2020/11/3,55,（,3,）所用培养基,2020/11/3,56,（三）基本制备过程,制备抗原,免疫动物,免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备,细胞融合,杂交瘤细胞的选择培养,杂交瘤细胞的的筛选,杂交瘤细胞的克隆化,单克隆抗体的检定,杂交瘤细胞系的建立,单克隆抗体的大量制备（动物体内诱生法和体外培养法）,2020/11/3,57,2020/11/3,58,单克隆抗体的大量生产,2020/11/3,59,单克隆和多克隆抗体的比较和用途,1,、用于免疫学检测，辅助临床诊断，用于各种病原体以及肿瘤的诊断,2,、,McAb,用于亲和层析，分离微量可溶性抗原,特异性,敏感性,均一性,McAb,PcAb,低,差,无,高,强,有,3,、标记的,McAb,用于基础研究，了解细胞分化等,4,、制备生物导弹用于肿瘤、移植等的临床治疗。,特异性,敏感性,均一性,McAb,PcAb,低,差,无,高,强,有,3,、标记的,McAb,用于基础研究，了解细胞分化等,4,、制备生物导弹用于肿瘤、移植等的临床治疗。,2020/11/3,60,三、基因工程抗体（第,3,代抗体）,自,1975,年单克隆抗体杂交瘤技术问世以来，单克隆抗体在医学中被广泛地应用于疾病的诊断及治疗。,但目前绝大数单克隆抗体是鼠源的，临床重复给药时体内产生抗鼠抗体，使临床疗效减弱或消失。,因此，医学临床上最理想的单克隆抗体应是人源的,但人,-,人杂交瘤技术目前尚未突破。,2020/11/3,61,随着,DNA,重组技术以及其他分子生物学技术的发展，人们通过基因工程技术对,Ig,分子进行切割，拼接或修饰来制备的新型抗体分子，,称为基因工程抗体,(,重点,).,基因工程抗体是按人类设计所重新组装的新型抗体分子，可保留或增加天然抗体的特异性和主要生物学活性，去除或减少无关结构（如,Fc,片段），从而克服单克隆抗体在临床应用方面的缺陷,研究成功的基因工程抗体有,：,嵌合抗体、重构抗体、单链抗体等。,2020/11/3,62,