荧光PCR检测原理2

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,荧光PCR检测原理,荧光,PCR,？,荧光标记扩增产物,动态监测荧光信号变化,荧 光 染 料,光能,热能,转移给临近的分子,荧光标记信号的产生,荧光标记基团在某波长的激发光刺激下，,产生一个更长波长的发射光,荧光,信号,荧光染料直接结合扩增产物,SYBR green I,特异性结合双链，释放荧光信号,荧光标记引物,特异性荧光探针,Taqman,双荧光标记探针,molecular Beacon,荧光标记探针,荧光标记杂交双探针,SYBR GREEN I,FRET？,当某个荧光基团的发射谱与另一荧光基团的吸收光谱发生重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，这个过程称为荧光共振能量转移(,FRET),实际相当于将短波长荧光基团释放的荧光屏蔽。,Taqman？,特异性荧光双标记探针,Taq,酶,53,外切酶活性,Molecular beacon？,荧光标记杂交双探针,变性,退火,延伸,C,T,值,样本扩增曲线与阈值线交叉点的循环数,对数期分析与终点分析的比较,荧光,PCR,重现性,标准曲线定量,荧光,PCR,特点,灵敏度高,特异性强,全封闭,PCR,过程，无需后处理,采用,dUTP,UNG,酶的防污染系统，有效降低污染机会,即时反映扩增过程，摒弃终点数据，更适用于定量,定量范围宽，可达到10个数量级，无须稀释样品,可实现一管多检,仪器自动分析，更快获得结果,PCR,荧光,双检多检试剂,荧光双检多检检测试剂,原理,针对同种样本，不同的引物分别扩增不同的靶,DNA，,并分别被不同的特异性探针所识别，通过探针的不同荧光标记实现区分。,特点,一次性处理样品,一次性反应,一次性给出2种或2种以上病原体检测结果,两套或两套以上扩增体系相互无信号干扰,竞争性荧光内标(,IC),定量,PCR,技术,竞争性荧光内标(,IC),什么是,IC?,Internal control,简称,IC，,通常是指与靶序列十分相似的一段,DNA,序列，两者在相同的条件下可被同一对引物扩增，具有相同的扩增效率；区别在于两者的探针结合区，可分别被不同序列的探针识别，通过探针的不同荧光标记实现区分。,IC,的作用,监控,PCR,反应，避免样本抑制物、,DNA（RNA）,提取过程的丢失、误操作等造成的假阴性结果；并对以上原因造成的定量误差进行修正。,内标工作原理图,荧光定量,PCR,的临床应用,早期诊断,病情评估和预后判断,抗病毒药物疗效的观察、指导,新药验证,输血源的筛选,母婴传播的控制与观察,遗传疾病的诊断,肿瘤的诊断,疾病的早期诊断,免疫学诊断主要是抗原抗体反应，应用于临床通常在体内产生抗体以后，而许多病原体的免疫学检测存在较长的“窗口期”，比如,HCV,的“窗口期”平均长达70天，不利于对疾病的早期诊断；,PCR,方法直接检测病原体的,DNA/RNA，,能大大缩短“窗口期”，其,高灵敏度的检测,显然也有利于疾病的早期诊断,。,病毒感染窗口期的,NAT,检测,病情评估和预后判断,通过定量检测病毒滴度可以间接评估受侵器官或组织的炎症发生程度以及是否发生病变；长时间机体病毒高水平的患者尤其是慢性病患者往往预后不好。因此对病原体的定量,PCR,检测对病情和预后评估均有参考意义。,对病毒感染的药物治疗中，免疫学指标的变化通常比较滞后出现，且受个体差异影响较大，从而对临床判断难以及时提供直接证据；而荧光定量,PCR,检测可直接反映病原体滴度是否受药物治疗发生变化，从而为药物疗效观察提供直接依据，以供治疗方案参考。同时对不同治疗时间的用药剂量和用药时间提供依据。,抗病毒药物疗效的观察、指导,ALT,Anti-,HBs,Months after Start of Therapy,0,Normal Alt,Before,therapy,1,2,3,4,5,6,12,24,DNA,HBe Ag,HBs Ag,Sustained Response to IFN Therapy*Hoofnagel paper,CHRONIC HEPATITIS B,CHRONIC HEPATITIS B,ALT,Months after Start of Therapy,0,Normal Alt,治疗前,1,2,3,4,5,6,12,24,HBV DNA,HBe Ag,HBs Ag,Poor Response to IFN Therapy,不同剂量,IFN-,a,单次给药后,HCV-1,型病人 病毒滴度变化的定量监测（,N=32）,Lam et al -,Hepatol,26,: 226, 1997,Baseline,24,hours,48,hours,genomes/ml x1million,0,2,4,6,8,10,12,14,10,MIU,5,MIU,3,MIU,新药,验证,任何一种抗病毒药物，以免疫标志物来评价其疗效均不够敏感和及时，若以病毒复制的被抑制程度，即病毒基因水平的高低和动态变化来评价疗效，则较为直接和理想。,拉米夫定,抑制血清,HBV DHA,0,-20,-40,-60,-80,-100,治疗周数,拉米夫定,安慰剂,血清,HBV DNA;,中位%变化,0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52,n=192,n=404,n=171,n=359,III,期临床研究的综合数据,遗传疾病的早期诊断,荧光,PCR,可实现对点突变、缺失突变、插入突变、多基因突变等的检测。对产前诊断具有其他方法不可比拟的优势，有利于优生优育，提高人口素质。,突变检测原理,锚探针 突变探针,突变探针,Tm,值较锚探针低5,不完全配对,完全配对,突变检测原理,不完全配对,完全配对,温度,低中高,Factor V,点突变检测,Forward,Primer,Reverse,Primer,DNA,CGC,CGC,LC Red 640,LC Red 705,扩增子,Hybprobe Pair 1,Hybprobe Pair 2,双点突变的检测原理,双位点双色检测,Without,ccc,With,ccc,Mut,1 +,Mut,2,WT1 + WT2,Het,1 +,Het,2,H20,F2,F3,母婴传播的监控,荧光,PCR,可对病原体的母婴传播进行有效的监控，为确定宫内感染、围产期感染或哺乳期感染等提供依据，为母婴传播的阻断等提供参考。,肿瘤的诊断,荧光,PCR,的作用：,可对原癌基因的突变和易位等作出检测。,可对原癌基因的,mRNA,进行定量分析。,有利于肿瘤的早期诊断，甚至癌前诊断。,探索癌变发生机理的研究提供参考。,区别肿瘤的良性和恶性以及炎症反应。,荧光,PCR,在血液筛查中的应用,NAT(Nucleic Acid Amplification Testing),NAT,应用于血液筛查的意义,血液筛查现状,筛查方法：免疫学,输血危险性来源：,窗口期献血，病毒变异，非典型免疫应答和实验室检测的失误,NAT,可显著缩短窗口期，提高输血安全性,HBV：,缩短6,-15,天,HCV：,缩短41,-60,天,HIV：,缩短10,-15天,急性感染时期,HIV,的标志物,急性感染时期,HCV,的标志物,急性感染时期,HBV,的标志物,病毒颗粒,DNA,RNA,FQ-PCR,RT-FQ PCR,裂解,荧光信号检测,核酸纯化系统,多通道荧光,PCR,自动检测系统,荧光,PCR,检测流程,自动加样,多样本混合（,Mini pool）,规格：16-96,donations,“Pool”,是为了加快筛查的进度和降低成本，将多袋血浆进行混合后进行检测。,“,Pool”,的规格取决于临界阳性和所用,NAT,试剂的检测限度,。,(,据文献，,PEI,要求欧盟所有原料血浆必须进行,HCV-RNA,的,NAT,检测，单份血源的检测限度应达到5000,IU/ml，,约1.352.410,4,geq,/ml;,目前,FDA,要求单份血源的,RNA（HIV/HCV）,检测限度应达到5000,copies/ml),筛查方法：,递减法,矩阵法,递减法,矩阵法,成本分析,前提：,试剂盒灵敏度（500,copies/ml),24,minipool,（,矩阵法筛选）,阳性检出率=1/10000,以10000,donars,为例：,试剂用量:473,每份筛查成本=473*每份试剂费用/10000=0.0473*每份试剂费用,仪器设备要求,年采血量15吨20吨：,核酸纯化系统1,多通道荧光,PCR,自动检测系统2,高速,低温离心系统,1,Pooling Machine1,年采血量10吨左右：,核酸纯化系统1,多通道荧光,PCR,自动检测系统1,高速,低温离心系统,1,选件,：,Pooling Machine1,