双缩脲法测定蛋白质

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,生物化学与分子生物学实验,1,实验记录,实验记录是在进行科学研究过程中积累资料、经验的一项重要工作，每一次实验过程中都应当养成良好的习惯，及时做好记录和总结。,要求：, 真实性 原始性 完整性 条理性,实验报告的书写,实验结束后，应及时整理和总结实验结果，写出实验报告。完整的实验报告应包括：实验题目、实验目的 、实验日期、操作步骤与条件、实验结果、讨论和结论等项目。,2,实验室规则,上实验课时不迟到，不早退，自觉遵守课堂纪律，上课时应保持实验室安静，不得大声说笑。进入实验室必须穿实验工作服。,实验课前认真预习有关课程，明确实验目的、要求和注意事项，熟悉实验内容和方法步骤。,实验时应遵守实验操作规程，按教师要求，认真操作。要细心观察实验现象，认真记录实验数据，作出结论，最后写出实验报告。,要爱护公物，小心使用仪器和实验设备，注意节约用水、电、药品和器材。,所有固体废弃物如：废纸、固体废弃物、沉淀物等必须弃于垃圾桶中。强酸、强碱必须倒入玻璃器皿中，用水稀释后倒入水槽。,3,实验室和实验台应保持整洁。公用试剂用毕，立即盖严并还原。实验完毕，仪器洗净放好。,在实验过程中必须遵守操作规程，不得随意乱动乱用。如不会使用，应请教指导教师。凡因乱动乱用违反操作规程而损坏仪器设备，造成事故者，按有关规定进行赔偿和处理。,严禁在实验室内吃饭、吸烟、扔废物和随地吐痰，实验室内学生轮流安排值日，实验结束离开实验室之前，关好窗户，切断电源，水源，确保安全。,4,试剂使用规则,使用试剂前应该仔细辨认标签，看清名称及浓度，是否为本实验所需。,取出试剂后，立即将瓶塞盖好，放回原位；未用完的试剂决不可倒回原瓶。,取标准溶液时，应该将标准溶液倒入干试管中，再用干净吸管吸取标准液，以免污染瓶中的标准液体。,使用滴管时，滴管尖端朝下，避免试剂流入橡皮帽内。,使用有毒试剂及强酸强碱时，尽可能用量筒取，若用吸管只能用吸耳球取，切勿用嘴吸取，以免造成意外。,5,吸量管的使用,正确拿法：中指和拇指拿住吸管上端，食指顶住吸量管顶端。,取液：用吸耳球吸取液体至刻度上，眼睛看着液面上升；吸完后用食指顶住吸量管上端。,调刻度：吸量管与地面保持垂直，下口与试剂瓶接触，并成一角度；用食指控制液体下降至最上一刻度处；液体凹面、刻度和视线应在一水平面上。,放液：吸量管移入准备接受溶液的容器中，使其出口尖端接触器壁，并成一角度，吸量管仍保持垂直。放开食指，使液体自动流出。吸量管应最后靠壁,15,秒。,6,吸量管上端标有“吹”字。将所量液体全部放出后，还需要吹出残留于管尖的溶液。此类吸量管为“吹出式”，未标“吹”字的吸量管，则不必吹出管尖的残留液体。,(0.5ml,以下的都要吹）,吸量管尖应接触受器内壁，但不应插入受器内的原有液体之中，以免污染吸量管及试剂。,吸取血液、尿、组织样品、粘稠试剂或有颜色的吸量管，用后应及时用自来水冲洗干净。如果吸取一般试剂的吸量管可不必马上冲洗，待实验完毕后，用自来水冲洗干净，晾干备用。,吸量管的使用注意事项,7,玻璃器皿的一般清洗方法,一般玻璃仪器：如试管、烧杯、锥形瓶等，先用自来水洗刷后，用洗衣粉刷洗，再用自来水反复冲洗，最后用蒸馏水淋洗,2,3,次。干燥备用。,容量分析仪器：吸量管、滴定管、容量瓶等，先用自来水冲洗，待晾干后，再用铬酸洗液浸泡数小时，然后用自来水充分冲洗，最后用蒸馏水淋洗,2,3,次，干燥备用。,比色杯：用毕立即用自来水反复冲洗。洗不净时，用盐酸或适当溶剂冲洗，再用自来水冲洗。避免用碱液或强氧化剂清洗，切忌用试管刷或粗糙布,(,纸,),擦拭。,上述所有玻璃器材洗净,(,以倒置后器壁不挂水珠为干净的标准,),后，根据需要晾干或烘干。,8,分光光度法,光是一种电磁波，通常用频率和波长来描述光。,人的视觉所能感觉到的光称为可见光，波长范围在,400,760nm,，人的眼睛感觉不到的还有红外光（波长大于,760-5000000nm,）、紫外光（波长,200-400nm,）、,X,射线等。,在可见光区，不同波长的光呈不同的颜色，但各种有色光之间并没有严格的界线，而是由一种颜色逐渐过渡到另一种颜色。,溶液的颜色与吸收光颜色的关系,一般性实验,-1,9,Beer-Lambert,定律吸收光谱法基本定律,描述物质对单色光吸收强弱与厚度和待测物浓度的关系。,含义：一束单色光通过溶液时，光能被吸收的程度与溶液的浓度和液层厚度成正比。,AKCL,或,lgI,0,/I =KCL,A,为溶液对光的吸光度,，反映了物质对光的吸收程度；,C,为溶液浓度,；,L,为溶液厚度,；,I,0,为照射待测物质的单色光强度，,I,为透过待测物质光线的光强度,，透光度,T= I/I,0,即溶液透过光的强度与入射光的强度之比；,K,为吸光系数，是物质在单位浓度和单位厚度的条件下对入射光的吸光度,。,实验中溶液厚度不变，则,AKC,10,光吸收示意图,I,0,I,b,C,11,吸收光谱和物质的定性分析,物质的吸收光谱与物质分子结构有关。,吸收光谱曲线是物质的特征曲线。用各种不同波长的光线作为入射光测定物质的吸光度（,Absorbance），,然后以波长（,）,为横轴，相应的吸光度（,A）,为纵轴，按结果作图，可得到该物质的吸收光谱曲线，这种曲线体现了物质对不同波长的光的吸收能力。,在一定的温度、,pH,值等条件下吸收光谱的曲线形状是一定的。在吸收光谱中，往往可找到一个或几个吸收最大值，该处的波长称为最大吸收波长（,max）。,物质不同，它们的最大吸收波长也往往不同。,12,不同浓度,的,VitB12,溶液对相同波长的光的不同吸收,g/ml,A,550nm,13,原理：根据物质对于入射光的特征吸收，可应用于物质溶液的定性检测,比较吸收光谱曲线：在相同的条件下，吸收光谱曲线不同，表明物质的化学结构不同。,比较最大吸收波长：不同物质的最大吸收波长不同；化学结构相似的物质最大吸收波长相同，吸收系数不同。,比较吸光度的比值：多用于检测物质的纯度（,DNA A,260,/A,280,=1.8,纯度鉴定),物质定性分析常用方法,14,物质的定量分析,标准曲线法,配制一系列不同浓度的标准溶液，用选定的显色剂显色。选用合适波长的入射光。测定时先以空白溶液调节透光率100%，然后分别测定标准系列的吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标作图得到一条通过原点的直线，叫做标准曲线（或称,A-C,曲线）。,标准管法,对个别样品进行测定，且,A-C,曲线线性良好直接比较测定结果。,A,标,=,K,标,c,标,b,标,A,测,=,K,测,c,测,b,测,c,测,=,A,测,/A,标,c,标,15,分光光度计的基本构造,仪器中光源经过单色器中的单色原件（如棱镜），所得到的单色光（入射光）进入样品室，透出的光被受光器（光电池或光电色）产生光电流，放大后在测量仪上显示出吸光度（,A）,或透光度（,T）,。,光 源,单色器,样品室,受光器,测量器,16,72,2,分光光度计使用方法,接通电源，打开仪器电源开关，打开样品室盖，预热10,min;,将空白液或对照液及测定液分别装入比色杯3/4体积并用擦镜纸擦净外壁，放入样品室内,空白液一般放于最外格，样品比色杯放入位置与试管位置对应,;,调好波长,;,调节按钮,开盖时，调,T,参数,调为,100,合上盖，调,A,参数 调为,0;,逐步拉出样品室拉杆（听到“咔”一声），读取吸光度值(,A）;,读数完打开样品室盖，再将读数写入记录本。,17,72,2,分光光度计使用注意事项,样品室盖应轻开轻放；,比色皿拿其磨砂面，液体装入约3/4高度，并用擦镜纸擦净外壁，每次用完后自来水冲洗干净，倒置于滤纸上；,倒取试剂时不能在仪器表面上方操作，仪器上请勿放任何物品；,每调换一次波长，都应将空白溶液的吸光度调至“0”。,18,双缩脲法测定蛋白质含量,实验目的,了解和掌握双缩脲测定蛋白质浓度的原理和方法,。,19,蛋白质在强碱性溶液中与稀硫酸铜溶液作用产生颜色反应，生成紫红色化合物，称为双缩脲反应。,具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，蛋白质在碱性溶液中，能与,Cu,2+,形成紫红色络合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，故可以用来测定蛋白质的浓度。,在一定的浓度范围内，颜色的深浅与蛋白质含量呈线性关系。因此可用比色法测定蛋白质浓度。,实验原理,20,紫红色铜双缩脲复合物分子结构,21,在分光光度法中，许多不吸收光的无色物质可以用显色反应变成有色物质，使之能进行比色测定，并能提高测定的灵敏度和选择性。在比色分析或分光光度分析中，将待测组分转变成有色化合物的反应叫做显色反应，与待测组分反应生成有色化合物的试剂叫显色剂。,在实际分析中，同一待测组分可与多种显色剂发生显色反应，生成不同的有色物质。为了保证测定的灵敏度和准确度，在分析时常需对显色反应进行选择，选择原则如下：,1.,选择性好，干扰少或干扰易消除；,2.,灵敏度要高；,3.,生成有色化合物的组成恒定，化学性质稳定；,4.,生成的有色化合物与显色剂之间的颜色须有明显的差别，最大吸收波长之差大于,60nm,。,显色剂与显色反应,22,管号,试剂,0,1,2,3,4,5,6,牛血清标准蛋白溶液（,ml,）,2mg/ml,0.6,1.2,1.8,2.4,3.0,0,待测蛋白液（,ml,）,3.0,蒸馏水（,ml,）,3,2.4,1.8,1.2,0.6,0,0,蛋白质浓度（,mg/ml,）,0,0.4,0.8,1.2,1.6,2.0,未知,实验步骤,1.按下图表所示加入相应的试剂或样品,23,各管混匀后加入双缩脲试剂,3.0ml,，充分混匀；,37,度水浴,30min,；,在,540nm,处以,0,号管调零点测定各管吸光度；,绘制标准曲线：以吸光度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标；,对照标准曲线，求待测蛋白质浓度。,24,读数时要注意读的是,A,的值；,注意正确标记试管（用记号笔清晰标记于试管2/3高处）；,准确记时。,注意事项,25,