高效液相色谱讲座

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,高效液相色谱讲座,河南省食品药品检验所,2009-05-31,1,液相色谱理论发展简况,色谱法最早是由俄国植物学家,茨维特,（Tswett）在1906年研究植物叶子的组成时所用的一种方法。他用碳酸钙作吸附剂，分离植物干燥叶子的石油醚萃取物。,他把干燥的碳酸钙粉末装到一根长的玻璃管中，然后把植物叶子的石油醚萃取液倒到管中的碳酸钙上，萃取液的色素就吸附在管内上部的碳酸钙里，再用纯净的石油醚洗脱被吸附的色素，于是在管内的碳酸钙上就形成了三种颜色的6个色带。,2,液相色谱理论发展简况,当时，茨维特把这种色带叫做,色谱(Chromatography),，色谱法因之得名。,在这一方法中，把玻璃管叫做“色谱柱”，碳酸钙叫做“固定相”，纯净的石油醚叫做“流动相”。这就是最早的液固色谱法。,后来在此基础上又发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。,3,石油醚,碳酸钙颗粒,色素,玻璃柱,俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906 年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。,4,色谱法的分离原理是：,溶于流动相(mobile phase)中的,各组分,，经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用,（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）,的大小、强弱不同,，那么在固定相中滞留的时间就不同，故从固定相中,流出的先后也就不同,。,这种方法被称为色层法、层析法。,5,色谱分离过程,Temporal,course,流动相,6,液相色谱理论发展简况,液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。,高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了,气相色谱,理论而迅速发展起来的。,7,液相色谱理论发展简况,它与经典液相色谱法的区别是,填料颗粒小而均匀,，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。,又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也称现代液相色谱。,8,HPLC系统,一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。,其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。,有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、预柱或保护柱、柱温控制器等，现代HPLC仪还有微机控制系统，进行自动化仪器控制和数据处理。制备型HPLC仪还备有自动馏分收集装置。,9,10,高效液相色谱仪( HPLC),目前常见的HPLC仪生产厂家,国外有,Waters公司、Agilent公司（原HP公司）、岛津公司等，,国内有,大连依利特公司、上海分析仪器厂、北京分析仪器厂等。,11,美国Agilent,美国Waters,12,美国戴安,日本岛津,美国VARIAN,日本岛津,13,Waters高效液相色谱仪,14,日本岛津高效液相色谱仪,15,开机前的准备工作,1、将试验要求的,流动相,配制好。,2、流动相要,过滤脱气,。,3、,装好,试验要求的,色谱柱,。,16,17,流动相:,溶剂的沸点和粘度,低沸点的溶剂通常其粘度低，但它在泵中易形成气泡而影响泵的精度，还因易蒸发而改变混合流动相的组成。,高沸点的溶剂通常会因其粘度而降低柱效。对于有缔合倾向的溶剂（特别是水和乙腈，水和甲醇），它们的粘度随组成的变化是不规律的。例如：水：乙腈（35：65），水：甲醇（50：50）时，其粘度最大。,18,开机前的准备工作,流动相要,过滤:,以除去其中的微粒物质。,滤 膜：(0.45m),脂溶性滤膜（有机滤膜），,水溶性滤膜，,通用型滤膜(聚四氟乙烯能适用于所有溶剂)。,HPLC级溶剂（色谱纯）使用时不必再过滤了，因生产工艺中已用,0.2m的,过滤装置过滤过了。,19,开机前的准备工作,脱 气：,为了防止在泵中、流路中、及检测器中产生气泡，而影响泵不稳定性（使流速不稳）和增加检测器的噪声，,流动相必须脱气,。,混合流动相比纯溶剂更能溶解空气，极易饱和形成气泡，有水的流动相特别明显。,脱气方法：,氦气脱气，真空脱气（用真空过滤流动相脱气，在线脱气机脱气）， 超声脱气， 加热脱气。,以不使流动相中混合物浓度发生变化为原则。,20,贮液瓶,贮液瓶是用来装流动相的容器，里面还含有一个,不锈钢烧结过滤器,。,泵进液管路,一般用聚四氟乙烯管。,不锈钢烧结过滤器套在,进液管路上，有两个功能：一是防止微粒物质进入泵，二是作为进液管路的重物，所以常被称为,“沉子”。,贮液瓶如被污染了可能会阻塞过滤片，影响泵的性能(使流速不稳)，出杂峰或产生噪声。,21,反相色谱法,一般用,非极性固定相,（如C18、C8）；流动相为,极性强的水,或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。,适用于分离非极性和极性较弱的化合物。,RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。,22,反相色谱柱,以硅胶为基质的液相色谱填料多为反相柱，正相柱不太多。,常用硅胶健合C18、C8等填料柱。,对硅胶做碱性脱活的反相柱（在高温下硅烷化封闭硅羟基），（这类填料对碱性物质如对胺有很小的吸附性）。,高稳定性反相柱（这种柱可以经过酸和碱的作用）。,23,硅胶为基质的一些缺点：,在碱性介质中（pH8）不稳定。,在孔隙中大分子扩散困难，降低柱效。,硅胶表面上的剩余硅羟基有离子交换作用。,24,反相色谱法中应注意：,尽量不使用乙酸盐缓冲溶液，因为它和带阳离子的溶质会形成非极性络合物。,不使用卤化物，以免腐蚀液相色谱仪。,对水的质量要求很高。一般应用新鲜的高纯水。乐百氏也可以用。,每次试验用水都应更换新鲜的水，因水易变质，不能长时间不更换。,25,正相色谱法,采用,极性固定相,(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相)；流动相为相对,非极性的疏水性溶剂,(烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。,常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。 常用的有硅胶柱。,26,反相HPLC,极性:固定相 流动相,固定相 - 极性强,流动相,(己烷, 庚烷),- 极性弱,极性小物质先出峰,正相色谱 20%,反相色谱,80%,正相色谱 20%,反相色谱,80%,主流,固定相与流动相,27,物理性质,硅胶纯度,色谱柱尺寸,颗粒形状,粒径,表面积,孔径,键合类型,碳覆盖率,封端,化学性质,固定相-填充材料,28,物理性质,硅胶纯度,色谱柱尺寸,颗粒形状,粒径,表面积,孔径,填料硅胶的纯度,与残留金属离子浓度,固定相-填充材料,29,键合类型,碳覆盖率,封端,化学性质,固定相-填充材料,30,31,固定相-填充材料,32,色谱柱常用的pH值:,随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常为2.57.5（28），太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱可在pH 1.510范围操作。,33,色谱柱,34,色谱柱,35,开机顺序：,1、打开主机，检测器，色谱工作站等电源开关。,2、将配制好的流动相放入流动相通道内，旋开排液（或灌液）旋钮，将流动相管路中存放的老溶剂替换掉。,3、关上排液（或灌液）旋钮，逐渐将流速升高。平衡至少30分钟后准备进样。,36,替换掉管路中存放的老溶剂,37,替换掉管路中存放的老溶剂,38,进样前准备样品过滤,一次性注射器,针式（头）过滤器,样品瓶,39,六通阀/定量环进样器,40,仪器：手动进样器-六通阀/定量环,41,手动进样器工作原理,装填状态,样品注入,42,手动进样器,43,44,液相色谱中，用,定量环进样时,，注射器的,抽取量,不得少于,环容积的5倍,。,45,仪器：检测器,46,UV/Vis双灯，全波长检测,检测器,流路,仪器：检测器-紫外,47,反射镜1,反射镜2,氘灯,光源透镜,滤光片（钬玻璃/遮光）,入射狭缝,光栅,分光器,参比光电二极管,数模转换板,样品光电二极管,数模转换板,流通池,紫外检测器工作原理,Agilent 1100 可变波长紫外检测器(G1314A),48,49,荧光检测器,50,蒸发光检测器,51,质谱检测器,52,53,54,基本概念和术语,色谱图(chromatogram)样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线(elution profile)。,基线(base line)经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。,噪音(noise)基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。,漂移(drift)基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移,55,基本概念和术语,色谱峰(peak)组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯Gauss曲线）。不对称色谱峰有两种：前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。前者少见。,峰底基线上峰的起点至终点的距离。,峰高(peak height，h)峰的最高点至峰底的距离。,56,基本概念和术语,峰宽（peak width，W)峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。W4,半峰宽（peak width at half-height，Wh/2)峰高一半处的峰宽。Wh/22.355,峰面积(peak area，A)峰与峰底所包围的面积。,保留时间(retention time，tR)从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。,57,基本概念和术语,理论塔板数(theoretical plate number，N)用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。,分离度(resolution，R)相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度。R1.5称为完全分离。,中国药典规定R应大于1.5。,58,理论塔板数(N),59,分离度(R),60,基本概念和术语,拖尾因子(tailing factor，T)用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称因子(symmetry factor)或不对称因子(asymmetry factor)。,中国药典规定T应为0.951.05。,T0.95为前延峰，T1.05为拖尾峰。,61,62,定性或定量,通过与对照品保留时间的一致性来进行,定性,。,定量常用:,a:外标法,b:内标法,63,液相色谱分离定量常用的基本公式,a:外标法,含量（ C X ）= C R,AX /,AR,CX,为供试品浓度,AX,为供试品峰面积,CR,为对照品浓度 AR,为对照品峰面积,64,液相色谱分离定量常用的基本公式,b:内标法,校正因子（f）=,AS CR /CS,AR,含量（ C X ）= f ,AX CS /AS,AX,为供试品峰面积,CX,为供试品浓度,AR,为对照品峰面积,CR为对照品浓度,AS,为内标峰面积,CS,为内标浓度,65,对仪器的一般要求,:,除另有规定外，柱温为,室温,，检测器为,紫外吸收,检测器。,正文中各品种项下规定的条件除,固定相种类、流动相组分、检测器类型,不得任意改变外,，其余如色谱柱,内径、长度、固定相牌号、载体粒度,、流动相,流速,、混合流动相,各组分的比例,、柱温、进样量、检测器的,灵敏度,等，均可,适当改变,，以适应具体品种并达到系统适用性试验的要求。,66,报告书书写内容：,检品名称：*片 批 号：200702016,检验项目：中国药典2005年版二部附录 D,标准规定：含*应为标示量的90.0%110.0%,仪器编号：YQ .H . 测定日期： 室温： ,色谱柱编号：色谱柱规格：4.6mm250 mm,色 谱 柱：固定相C18 柱 温：25 ,检 测 器：紫外检测器 检测波长： 260nm,流 动 相：水乙腈（6040）,流速：1 ml/min 进 样 量：20 l,67,报告书书写内容：,理论板数规定值：按*峰计算不低于1000 测定值：,分离度规定值：大于1.5 测定值：,对照品名称：* 对照品批号：123-200701,对照品来源：中国药品生物制品检定所,68,报告书书写内容：,试验方法,试验计算,试验结果,试验结论,69,HPLC,日常维护,总结,70,一、定期,检查溶剂过滤器,查看过滤器是否变色临时取下过滤器，检查柱前压力是否正常,清洁溶剂过滤器,将堵塞的溶剂过滤器从瓶头组件中拿下。先用水冲洗残留之溶剂，然后将过滤器放在装有浓硝酸 （35）的烧杯里浸一小时，不要使用超声波清洗。,用二次蒸馏水彻底冲洗过滤器。建议不使用超声波清洗机清洗。,将过滤器重新装好。,71,一、定期,检查溶剂过滤器,建议定期清洗溶剂过滤器及溶剂瓶，每三个月至少清洗一次,。,注意：不要使用没有安装溶剂过滤器的系统可能会严重堵塞系统.,72,日常维护,流动相应经过0.45um或更小孔径的滤器过滤，如果使用滤膜，注意有机膜与水膜的区别(聚四氟乙烯能适用于所有溶剂),注意不同检测器流通池耐压问题，尽量避免使用pH9.5的流动相，以防腐蚀流通池石英窗，避免使用可能析晶的流动相，防止流通池堵塞,73,使用PEEK（polyetheretherketone）管路和接头需要注意什么问题？,如果,经常需要改变流路,或更,换不同品牌的色谱柱,，使用PEEK材料制成的管路和接头会非常方便。PEEK管路容易连接；PEEK接头不仅无需工具，手拧即可固定，而且容易调节锥箍之外的管路长度，方便与不同品牌或规格的色谱柱相连接。 使用此类材料的管路需要注意的是：PEEK对卤代烷烃和四氢呋喃的兼容性不好。虽然未观察到上述溶剂溶解PEEK材料的明显迹象，但PEEK遇到上述溶剂会变脆。,74,使用PEEK管路和接头需要注意什么问题？,另一个需要考虑的因素是压力限。不锈钢管可耐受6000psi的压力，但PEEK管只能耐受近4000psi（但多数,HPLC应用系统压力不会超过3000psi,）。,使用PEEK接头时则无需担心接头耐溶剂性能，因为接头几乎或很少与溶剂直接接触。但手拧固定的PEEK接头压力限低于不锈钢管，因而压力高时，可能会使接头在管路上滑动而产生死体积或漏液。,75,如何预防液相泵的故障:,要保持泵的良好操作性能,必须维护系统的清洁,保证溶剂和试剂的质量,对流动相进行过滤和脱气.下面列出预防泵故障的几项措施: 1) 用高质量试剂和HPLC级溶剂； 2）过滤流动相和溶剂； 3）脱气； 4）每天开始使用时放空排气，工作结束后从泵中洗去缓冲液； 5）不让水或腐蚀性溶剂滞留泵中；,76,高效液相色谱中常遇见的问题及处理方法,77,基线噪音大可能由那些原因引起,可能原因是：,泵压不稳,，流动池有,气泡,，流动池被污染，对紫外检测器可将流动池移走即可确认。,色谱柱,污染,，系统管路,污染,。,灯能量,不足,，光学系统老化或污染，参数设计不合理。,外界因素影响，如电源，温度和湿度，震动，等。,78,峰面积重现性不好,1. 首先观察压力是否稳定，以及观察峰面积变化是否有规律。,若压力不稳定，,请检查造成压力不稳定的因素，如：漏液，排液时间不足够，盐浓度过高导致盐析，主动阀比例阀内漏，等。,2.,若压力稳定但峰面积呈无规律变化，,请检查样品是否足够，确认样品的稳定性，必要时重新配制。检查进样阀是否漏液。等。,3. 若压力稳定且,峰面积呈规律变化，,多数为色谱柱未平衡好。,79,保留时间不稳定,1.,首先观察保留时间是否有规律的变化，并同时观察压力是否稳定，,若压力稳定而保留时间呈有规律变化，,多数是色谱柱未平衡好，特别是含有的流动相，需较长的时间去平衡。,2. 若压力稳定而保留时间无规律变化，,请检查溶剂过滤头及真空腔是否有堵塞。再平衡色谱柱足够时间，如仍然不佳，可更换一色谱柱。,3. 若压力不稳定，,请检查造成压力不稳定的因素，如：漏液，排液时间不足够，盐浓度过高导致盐析，主动阀比例阀内漏，等。,80,一、,保留时间缩短,1.,流速增加,2.,样品超载,3.,键合相流失,4.,流动相组成变化,5.,温度增加,1.,检查泵,重新设定流速,2.,降低样品量,3.,流动相,PH,值保持在,37.5,检查柱的方向,4.,防止流动相蒸发或沉淀,5.,柱恒温,81,二、,保留时间延长,1.,流速下降,2.,硅胶柱上活性点变化,3.,键合相流失,4.,流动相组成变化,5.,温度降低,1.,管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡,2.,用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱,3.,流动相,PH,值保持在,37.5,检查柱的方向,4.,防止流动相蒸发或沉淀,5.,柱恒温,82,三,、,出现肩峰或分叉,1.,样品体积过大,2.,样品溶剂过强,3.,柱塌陷或形成短路通道,4.,柱内烧结不锈钢失效,5.,进样器损坏,1.,用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的,15%,2.,采用较弱的样品溶剂,3.,更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件,4.,更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品,5.,更换进样器转子,83,四、,鬼峰,1.,进样阀残余峰,2.,样品中未知物,3.,柱未平衡,4.,三氟乙酸,(TFA),氧化,(,肽谱,),5.,水污染,(,反相,),1.,每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗,2.,处理样品,3.,重新平衡柱,用流动相作样品溶剂,(,尤其是离子对色谱,),4.,每天新配,用抗氧化剂,5.,通过变化平衡时间检查水质量，用,HPLC,级的水,84,五、 基线噪声,1.,气泡,(,尖锐峰,),2.,污染,(,随机噪声,),3.,检测器灯连续噪声,4.,电干扰,(,偶然噪声,),5.,检测器中有气泡,1.,流动相脱气,加柱后背压,2.,清洗柱,净化样品,用,HPLC,级试剂,3.,更换氘灯,4.,采用稳压电源,检查干扰的来源,(,如水浴等,),5.,流动相脱气,加柱后背压,85,六、,峰拖尾,1.,柱超载,2.,峰干扰,3.,硅羟基作用,4.,柱内烧结不锈钢失效,5.,柱塌陷或形成短路通道,6.,死体积或柱外体积过大,7.,柱效下降,1.,降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相,2.,清洁样品,调整流动相,3.,加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相,PH,值,钝化样品,4.,更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品,5.,更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件,6.,连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管,7.,用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱,86,七、,峰展宽,1.,进样体积过大,2.,在进样阀中造成峰扩展,3.,数据系统采样速率太慢,4.,检测器时间常数过大,1.,用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的,15%,2.,进样前后排出气泡以降低扩散,3.,设定速率应是每峰大于,10,点,4.,设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的,10%,87,七、,峰展宽,5.流动相粘度过高,6.检测池体积过大,7.保留时间过长,8.柱外体积过大,9.样品过载,5.增加柱温,采用低粘度流动相,6.用小体积池,卸下热交换器,7.等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱,8.将连接管径和连接管长度降至最小,9.进小浓度小体积样品,88,谢 谢 ！,89,