资生堂色谱柱使用及维护

書式設定, 書式設定,第 2 ,第 3 ,第 4 ,第 5 ,*,资生堂,HPLC,色谱柱使用及维护,资生堂色谱知识讲座,先端科学事业推进部 技术中心,北京经济技术开发区景园北街,2,号,BDA,国际企业大道,31,号,(100176),TEL,：,FAX,：,1,资生堂色谱网站,色谱柱使用说明书,2,色谱柱的冲洗、保存、故障和对策,3,色谱柱的安装和连接,安装色谱柱之前，建议先冲洗设备，并观察系统压力，确保系统各处连接正常,通常，使用不含盐的流动相进行冲洗。如果担心系统中残存盐溶液，为避免盐析，请先使用高水相冲洗后，再置换成不含盐的流动相；,请按照色谱柱标签上的箭头方向来安装色谱柱（左图）。确保配管接头连接正确，并且锥箍的顶端已插入接头内侧,(,下图,),；,安装后，使用不含盐的流动相置换色谱柱保存液后，再用流动相平衡系统和色谱柱。如果担心色谱柱保存液含有盐，请先使用高水相冲洗。,4,色谱柱使用注意事项,避免强烈撞击，以防色谱柱劣化 ；,请在压力指示为,0,时进行色谱柱的安装和拆卸 ；,请在色谱柱正常压力范围,15MPa(IF,为,40MPa),内使用；,流动相,pH,不要超过色谱柱,pH,使用范围，不要发生大幅度变化，否则容易劣化；,资生堂,C18,柱,pH2-10,（,ACR,柱,pH1-10,）, SCX,柱,pH2-7, NH2,柱,pH2-8,为防止由异物导致的色谱柱入口处过滤筛板堵塞，建议使用线上过滤器；,柱温越高，越易劣化；,更换流动相时请注意不要盐析。,5,离子交换柱使用注意事项,不要使用,100%,水冲洗色谱柱；,流动相一般为含盐水溶液和有机溶剂，在配制流动相及更换色谱柱时一定注意不要发生盐析；,新,SCX,柱使用纯乙腈封存，若要置换成含无机盐的流动相，请确保不要发生盐析；,要严格控制流动相,pH,在使用范围之内,SCX,柱,pH2-7,，,NH2,柱,pH2-8,；,色谱柱平衡时间长,NH2,柱在水,/,乙腈系下分析糖类物质时，需要平衡,4,5,小时；,SCX,、,NH,2,柱使用含缓冲盐流动相时，最好需要平衡过夜。,6,Melamine,结构式,平衡,60min,后,次日,HPLC Conditions:,Column: SCX UG80 5m, 4.6mm i.d.150mm,M.Phase: 50mM KH,2,PO,4,(pH 3.0 adjusted with H,3,PO,4,) / CH,3,CN=70/30,Flow rate: 1mL/min,Oven Temp.: 30C,Detector: UV 240 nm,Sample: Melamine in M.P.,Inj. Vol.: 20L,使用,SCX,柱三聚氰胺的分析,平衡,2,h,以上，保留时间稳定,7,色谱柱的冲洗,什么情况下需要冲洗色谱柱？,柱压升高,色谱峰形异常,在强碱性和,TFA,等强酸条件下使用之后,注意：一般情况下不建议对色谱柱进行冲洗，不冲洗反而更能延长色谱柱的寿命。,8,反相系色谱柱该如何冲洗？,可以用水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿）依次冲洗，或者用,H,2,O: CH,3,CN = 1 : 1,或,H,2,O : CH,3,OH = 1 : 1,进行长时间冲洗 。,在乙腈甲醇冲洗过程中，可以重复注射,100-200,L,四氢呋喃或异丙醇都可以有助于除去强疏水性杂质。,四氢呋喃与乙腈和甲醇的混合物能除去类脂。,用乙腈、丙酮和三氟醋酸（,0.1%,）梯度洗脱能除去蛋白质污染。,9,正相系色谱柱该如何冲洗？,一般情况下,100%,异丙醇的极性和正相洗脱能力足够把正相柱上的所有残留物清洗掉,，可直接使用其冲洗色谱柱,更换溶剂时注意溶剂间的互溶情况，尤其是水会较大干扰正相检测,10,离子交换色谱柱的冲洗,阳离子色谱柱,：酸性缓冲盐溶液冲洗,阴离子色谱柱,：稀碱缓冲液冲洗,NH,2,色谱柱：,80% CH,3,CN(pH11,、氨水,),冲洗,NH,2,柱,1,2,小时，使在酸性条件下产生的质子化氨基回到初始状态,除去用于离子交换的盐后，可以用水、甲醇、乙腈、二氯甲烷等冲洗,11,常规反相色谱柱保存方法,使用间隔为,1,2,日，请降低流速并连续通液；,短期保存（数周）时，不需要冲洗流动相，拧紧并放好。但使用了强酸强碱流动相时，请使用含有相同有机溶剂组成的中性流动相置换保存；,长期保存（数月）时，请将流动相置换为含,50%,以上有机溶剂的溶液；,更久保存（,1,年左右）时，请使用,100%,乙腈保存；,色谱柱的保存,12,色谱柱的保存,NH,2,一个月以内的保存，请使用与所选用流动相组成相同的有机溶剂和水的混合溶液（不含酸、无机盐）进行置换，请避免只用水进行置换；,一个月以上的长期保存，在进行了上述处理之后，请用出厂时的溶剂（乙腈）置换并保存,；,SCX,短期保存时，请使用含盐的水系流动相来保存。长期保存时，请用出厂流动相纯乙腈来保存。,PC HILIC,分别使用水,/,乙腈,=85/15,及水,/,乙腈,=10/90,在通常流速下各冲洗约,1,小时，在色谱柱内为水,/,乙腈,=10/90,的状态下进行保存；,糖分析色谱柱,SUCREBEAD,将流动相置换为,1mol/L NaOH,后，拧紧堵头密封保存。,13,色谱柱性能评价,一份合格的色谱柱评价报告应给出柱的基本参数，如,柱长,、,内径,、,填料的种类,、,粒度,、,色谱柱的柱效,、,不对称度,和,柱压,等。,装填技术,+,填料本身,+,配套检测系统,=,高效液相色谱柱评价结果的获得,色谱柱性能包括：在一定实验条件（样品、流动相、流速、温度）下的,柱压,、,理论塔板高度,和,塔板数,、,对称因子,、,容量因子,和,分离度,。,14,资生堂 采用了严格的出厂标准,填料证明书,填料性能的保证,15,色谱柱出厂报告,色谱柱充填质量的保证,萘理论塔板数和色谱峰形均符合一定标准,16,常遇问题解答,流动相走空，色谱柱还能继续使用吗？,可以。通过再通液得到解决。,步骤：更换新流动相；,排除泵中空气；,重新通液,断开色谱柱出口和配管的连接,按照初始浓度开始通液，并确认柱出口是否有流动相流出（如果水系流动相为缓冲液，可能会出现盐析，需要用高水相通液，必要时请降低流速）。通液后，先停止送液，连接色谱柱和配管，重新送液。,17,常遇问题解答,柱效降低该怎么办？,首先随着使用时间的增长，柱效会有所降低。只要理论塔板数和,各参数仍然符合相关标准和实验要求，色谱柱仍可继续使用。,如塔板数降到规定值以下，可以尝试冲洗色谱柱。,如果仍然无效，建议客户更换新色谱柱。,18,