薄板层析法鉴定四环素纯度

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,上课前，每组洗干净,3,块玻璃板、,1,个研钵、,1,根研磨棒，去离子水润洗，,放入实验室后面的烘箱内烘干，,研钵倒扣放置！,按组号签到。,1,生物分离工程,基础实验,指导教师：龚小雁 张秀萍,2,生物分离工程实验,I,基础实验：,第,11/12,周,薄板层析法鉴定四环素成品纯度,第,14,周,PEG400/(NH,4,),2,SO,4,两水相系统相图的制作,第,15,周,两水相系统中蛋白质分配系数的测定,第,16,周,离子交换树脂总交换容量的测定,3,实验内容及时间,薄板层析法鉴定四环素纯度,实验一班：第,11,周 周一，周四,实验二班：第,12,周 周一，周四,两水相萃取相图制作,实验一班：第,14,周 周一,实验二班：第,14,周 周四,两水相萃取蛋白质分配系数测定,实验一班：第,15,周 周一,实验二班：第,15,周 周四,离子交换树脂总交换容量的测定,实验一班：第,16,周 周一,实验二班：第,16,周 周四,4,实验时间安排表,周次,日期,星期,时间,发酵实验,5-212,分离实验,5-112,11,5,月,6,日,星期一,13:30,实验一班,5,月,9,日,星期四,13:30,实验一班,12,5,月,13,日,星期一,13:30,实验二班,5,月,16,日,星期四,13:30,实验二班,13,5,月,20,日,星期一,13:30,实验二班,5,月,23,日,星期四,13:30,实验一班,14,5,月,27,日,星期一,13:30,实验二班,实验一班,5,月,30,日,星期四,13:30,实验一班,实验二班,15,6,月,3,日,星期一,13:30,实验二班,实验一班,6,月,6,日,星期四,13:30,实验一班,实验二班,16,6,月,8,日,星期六,13:30,实验二班,实验一班,6,月,13,日,星期四,13:30,实验一班,实验二班,17,6,月,17,日,星期一,13:30,实验二班,6,月,20,日,星期四,13:30,实验一班,5,考核方式,考勤,提问和操作,实验报告：,预习报告,实验结果、讨论、思考题,6,薄板层析法,鉴定四环素纯度,7,加深对薄板层析法基本原理的理解。,熟悉薄板层析法的操作过程。,采用薄板层析法来考察四环素制品纯度。,一、目的和要求,8,（一）层析：,色谱,chromatography,一种分离技术。,任何层析都具有两个相，,固定相,固定不动，,流动相,对固定相作相对运动。,不同物质在两相间分配差异，随流动相以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离的效果。,固定相：,固体,或,液体,(,固定在载体上,),流动相：,流过固定相的,液体、气体或超临界流体,。,二、实验原理,9,（二）层析方法：,根据机理可以分为：,分配层析,吸附层析,凝胶层析,离子交换层析,亲和层析,二、实验原理,根据层析的方式：,纸层析,薄层层析,柱层析,10,（三）薄板层析（,TLC,）,利用不同溶质组分在固定相和流动相的,两种液体,中分配系数不同，展层时形成以不同速度移动的区带，达到分离。,溶质易分配在固定相中,溶质易分配在流动相中,二、实验原理,移动速度慢。,移动速度快。,11,利用,阻滞因子,R,f,值来表征各组分的差别移动：,0,R,f,1,适宜范围,0.20.8,二、实验原理,溶质移动距离,同一时间流动相移动距离,R,f,=,12,二、实验原理,固定相：,一般为水及各种水溶液、甲酰胺、低级醇等。,流动相,（展层剂）：与水不溶（或微溶）的有机溶剂。,薄板层析法：,支持物,:,中性、多孔粉末、无吸附活性、流动相自由通过,硅藻土,/,纤维素,/,硅胶,/,氧化铝等，亲水物质能储留水。,本实验为硅藻土。,本实,验为吸附在硅藻土上的,EDTA,缓冲液。,本实验为丙酮,:,乙酸乙酯,:,氯仿,=3:1:1,13,（四）四环素,广谱抗生素,四环素发酵或保管不当时，生成抗菌作用弱，毒性强的差向四环素。,四环素易溶于流动相液体，差向四环素易溶于固定相液体。,氢化骈四苯环 （含共轭双键，可紫外吸收，荧光,）,二、实验原理,14,本实验所需仪器,玻璃板,研钵,天平,移液管,硅藻土,EDTA,缓冲液,饱和氯化铵缸,+,架子,展层剂,展层缸,点样毛细管,小刀和直尺,紫外灯,氨水,三、主要实验器材与试剂,15,（一）溶液配制,（已配置）,硅藻土处理：,取薄板层析用硅藻土,50g,，加,25ml,浓盐酸和,250ml,水，搅拌煮沸,10min,，冷却，过滤，用蒸馏水洗，直至洗液对刚果红指示剂不显颜色，然后用流动相液体洗涤，过滤，,105,烘箱干燥。,EDTA,缓冲液（固定相）,：在,40ml,甘油中，加入,10ml,聚乙二醇,400,，摇匀即得,20%,（,V,/,V,）聚乙二醇,400,的甘油溶液（保湿），再加入,950ml pH7 0.1M EDTA,（鳌合）溶液，混匀即得,EDTA,缓冲液。,展层剂（流动相）：,取,pH7 EDTA,溶液,5ml,，缓慢加在,200ml,（丙酮,:,氯仿,:,乙酸乙酯,=3:1:1,）溶液中，然后倒入展层缸中。,样品配制：,称取,100mg,成品四环素，溶于,5ml,甲醇中得,2%,（,W,/,V,）溶液。,四、实验方法,16,硅藻土,1g,研钵,EDTA,缓冲液,2ml,蒸馏水,0.75ml,研匀（颗粒适中、无气泡）,置饱和,NH,4,Cl,缸,室温放置,无明显水渍,厚度涂均匀，,特别下边缘涂满平整,（二）层析操作,四、实验方法,17,18,0.5cm,15cm,1.5cm,均匀,无气泡,无裂纹,毛细管点样,点样点甲醇挥发干后，将板放入展层缸内，密封,晾干，氨气熏，,紫外灯下观察,分别求两种组分的,R,f,值,量距离,展层剂,0.5cm,样点高于液面,溶质移动距离,同一时间流动相移动距离,R,f,=,19,20,操作注意点,制板：,在研钵中研磨时应缓慢，注意不能产生气泡。,薄板移入饱和氯化铵的缸中时，不宜太干或太湿，以无明显水渍为宜。太干展层太快，引起拖尾；太湿展层太慢。,点样：,点样时，尽量使点样斑点直径小。,点样后，待溶剂挥发后再移入展层缸内，,不要用电吹风,。,展层：,注意展层剂浸没薄层的一端约,0.5cm,，,不能浸没样品斑点,。,层析缸盖子应盖密，减少溶剂挥发。,21,实验结果和讨论,（一）预习,四环素的硅藻土薄板层析属于哪一种层析机制。固定相和流动相分别是什么？,为了使层析效果好（不拖尾，分离好），操作中注意事项。,（二）实验结果和讨论,在纸上描绘出薄板上斑点的图形，量出各斑点组分的距离，计算,R,f,值。,分析实验结果。,总结本实验成功或失败的经验教训。,五、思考题,22,时间安排,星期一：,制板 室温晾干 饱和氯化铵缸,星期四：,点样 展层 显示斑点,星期四各组自带,小刀,和,直尺,23,值日生,第一组,第二组,第三组,擦干净实验桌面,整理好试剂药品,扫地、拖地,24,