第六节 单链内切核酸酶

,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,第六节 单链内切核酸酶,小组成员：耿沙沙 赵彦朵朱新娅 王高伟,基因工程,2024/9/21,1,本节重点：,1.,S1核酸酶的活性和应用,。,2.,Bal31核酸酶的活性和应用,。,3.脱氧核糖核酸酶,（DNase,)的活性和应用。,2024/9/21,2,一、S1核酸酶,S1核酸酶来源于,米曲霉菌,，是一种含锌的蛋白质，相对分子质量为32000，相对耐热，由nucO编码，该基因已被克隆。S1核酸酶是,一种高度单链特异性的内切核酸酶,，催化反应需要Zn,2+,和酸性条件，最佳pH4.04.5。,2024/9/21,3,S1核酸酶的特性：,（1）在高离子强度、pH4.2和1mmol/LZn,2+,存在的条件下，S1核酸酶可以高特异性地降解,单链DNA和RNA，包括双链分子中的单链区域（如发卡结构）,，反应产物为5单核苷酸。,2024/9/21,4,（2）调节S1核酸酶的用量，可以,切割双链DNA的单链缺刻,，但不能识别单个碱基 对的错配。,（3）当S1核酸酶用量过大时，伴有双链核酸的降解，但该酶,降解单链DNA的速度是降解双链DNA的75000倍,。,2024/9/21,5,2024/9/21,6,S1核酸酶的应用：,（1）可用于切掉DNA片段的单链突出末端以产生平末端；,（2）打开双链cDNA合成中的发夹环结构；,（3）S1核酸酶作图法在测定杂交核酸分子的杂交程度、RNA分子定位、确定内含子的位置、内含子和外显子剪切位点的定位、转录起始位点与终止位点的测定中，S1核酸酶都是十分有效的工具。,2024/9/21,7,S1核酸酶的活性可被PO,4,3-,、5,核苷、核苷三磷酸、枸橼酸盐和EDTA抑制。然而，其在低溶度的变性剂（如SDS、尿素甲酰胺）存在的条件下稳定。,2024/9/21,8,二、 Bal 31核酸酶,Bal 31核酸酶的特性：,对单链DNA具有特异的内切酶活性,，可从3-OH末端迅速降解DNA。,对于,线性双链DNA分子,，它表现为3,5端的外切酶活性和53的外切酶活性，可有控制地从3末端和5末端逐个水解除去单核苷酸，产生缩短了的DNA分子。（注意：,Bal 31的3外切酶活性约为它的单链特异性内切酶活性的20倍）,2024/9/21,9,当底物是,双链环形的DNA分子,时，Bal 31的单链特异性内切核酸酶活性，通过对单链缺口或瞬时单链区的降解作用，将超螺旋的DNA切割成开环结构，进而成为,线性双链DNA分子,。,除此以外，Bal 31核酸酶还可起到核糖核酸酶的作用，,催化核糖体和tRNA的降解,，但,它不具有双链特异的核酸外切酶活性,。,2024/9/21,10,2024/9/21,11,Bal 31核酸酶的应用：,Bal 31核酸酶降解DNA需要,Ca,2+,的存在，在反应的不同阶段加入,螯合剂EGTA（乙二醇双,氨基乙醚四乙酸,）可使反应终止,。,（1）用于确定DNA片段的限制酶图谱,使用Bal 31核酸酶降解待测DNA，在不同反应时间取出反应物，用EGTA溶液中止反应。然后，各样品用相应限制性内切核酸酶消化后，可看到酶切片段按一定的顺序消失。,2024/9/21,12,限制酶图谱就是一系列限制酶的特异识别序列在,DNA,链上的出现频率和它们之间的相对位置。它实际上就是限制酶的特异切点在,DNA,上的定位，表现出一些部位的线性序列，它是,DNA,分子结构特异性的反映，所以限制酶图谱又称,DNA,的物理图谱。,2024/9/21,13,（2）可用于在克隆前通过可控方式去除双链DNA末端不需要的序列。处理后的DNA末端，可用T4噬菌体DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶,Klenow片段补平，再加入合成接头，插入适当载体。用此方法，还可以在DNA上生成一系列终点确定的缺失突变体。,（3）用于确定DNA分子的二级结构,2024/9/21,14,2024/9/21,15,三、脱氧核糖核酸酶,脱氧核糖核酸酶简称DNA酶（DNase ），是来源于牛胰脏的糖蛋白。它是一种需要二价阳离子的内切核酸酶，能从嘧啶核苷酸5端磷酸基处随机降解单链或双链DNA，生成具有5磷酸末端的寡核苷酸。当有Mg,2+,存在时，能在双链DNA上随机独立地产生切口；而在Mn,2+,存在时，则在双链DNA的大致同一位置上切割，产生平末端DNA片段。,2024/9/21,16,脱氧核糖核酸酶,的应用：,在分子克隆中，DNA酶,主要用于：,与大肠杆菌DNA聚合酶,联合参与切口平移法标记DNA分子；,在Mn,2+,存在下，随机裂解双链DNA分子，构建大片段插入的基因文库；用于DNase,足迹法分析DNA结合蛋白在DNA上的精确结合位点；,使用无RNase的DNase,去除转录产物中的模板DNA。,2024/9/21,17,谢谢,2024/9/21,18,