循环肿瘤DNA(ctDNA)检测策略及临床意义

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,循环肿瘤DNA(ctDNA)检测策略及临床意义,肿瘤诊疗的困境：早期诊断困难，错过最佳治疗时机；易复发转移，预后差；放化疗易产生耐受；缺乏有效的治疗靶点等。,早诊早治，实时监控、靶向用药及个体化诊疗是提高肿瘤远期生存率、降低死亡率的关键。,肿瘤诊断方法,血清标志物：蛋白类（癌胚抗原，糖类抗原，甲胎蛋白等），核酸类（,microRNA, LncRNA,）,影像学诊断,(,超声，,CT,，,MRI,，,PET,，,PET-CT),循环肿瘤细胞（,circulating tumor cell , CTC,）,循环肿瘤,DNA,（,circulating tumor DNA,，,ctDNA,）,循环肿瘤,DNA(ctDNA),人体血液循环系统中不断流动的携带一定特征,（包括突变，缺少，插入，重排，拷贝数异常，甲基化等）,来自肿瘤基因组的,DNA,片段；,来源：,1,、来自于坏死的肿瘤细胞；,2,、来自于凋亡的肿瘤细胞；,3,、循环肿瘤细胞；,4,、来自于肿瘤细胞分泌的外排体；,含量低，约占整个循环,DNA,的,1%,，甚至只有,0.01%,。,ctDNA,发展简史,1948,年首次发现人体血液中存在着循环,DNA,，癌症患者的循环肿瘤,DNA,则发现于,1977,年。,1994,年发现这些,DNA,含有癌症的标志性突变，证明其来自于肿瘤。,鉴于肿瘤,DNA,会流入血液，香港中文大学的卢煜明（,Dennis Lo,）教授推测胎儿,DNA,应该也能进入血液。,1997,年证明孕妇血液中携带着男性胎儿的,Y,染色体。该发现允许医生们在怀孕初期通过无创方式检测胎儿的性别，甚至筛查唐氏综合症等发育疾病。这是产前诊断领域的一次革命,。,Nature Reviews Cancer,11,426-437(June 2011)|doi:10.1038/nrc3066,Cell-free nucleic acids as biomarkers in cancer patients,ctDNA,发展简史,研究热点,近,10,年,ctDNA,相关发表文章数（,pubmed,数据库）,NEJM,：,4,篇,PNAS,：,7,篇,JAMA,：,1,篇,Sci Transl Med,：,6,篇,Cancer research:12,篇,Clin Cancer Res:28,篇,ctDNA,优势,无创、无损、实时、多次；,当不能获得肿瘤组织信息时，可以开展“液体活检”；,假阳性率低，灵敏度高，准确度高，可用于肿瘤的早期诊断；,能够对肿瘤的演化和适应性改变进行监控；,能够对肿瘤病人的治疗效果进行实时监控（尤其在追踪肿瘤转归、转移和复发等方面），并进行个性化的治疗方案指导（如个性化靶向药物用药，个性化化疗等）。,一类具备广泛应用前景的肿瘤标志物，可无创的用于肿瘤早期诊断、发展过程监测、预后判断、以及个性化用药指导。,ctDNA,检测技术,敏感度,已知突变位点检测,（突变率, 2%,）,全基因组测序,全外显子测序,RNA,末端平行分析法,全基因组甲基化测序,数字,PCR,将一个标准,PCR,反应分配到大量微小的反应器中，在每个反应器中包含或不包含一个或多个拷贝的目标分子,( DNA,模板,),，实现“单分子模板,PCR,扩增”，扩增结束后，通过阳性反应器的数目“数出”目标序列的拷贝数。,阴性微滴比例推算,起始靶分子的绝对量,泊松分布,一个,待分析的,PCR,反应体系,成千上万个,独立的,PCR,反应体系,:,靶标分子,:,有限稀释,:,阳性微滴（,1,）,:,阴性微滴（,0,）,泊松分布,PCR,扩增,优点：可绝对定量，灵敏度可达单个核酸分子，检测限低至,0.001%,；,缺点：只能检测已知的突变位点，通量低；,利用数字,PCR,监测肺癌病人中第一次服用,埃罗替尼抗肿瘤药物后的血浆,EGFR,突变情况。,经过治疗后，所有病人的,EGFR,突变都出现下降，其中有,8,个病人突变完全消失。,有,6,个病人的,EGFR,突变,在,后续出现上升，提前揭示疾病进展。,另外,3,个,病人的,EGFR,突变没有变化,，,病情无明显进展。,数字,PCR,可以用于评估和监测血浆中,ctDNA,的特异突变,结合数字,PCR,与流式技术，利用特异性,PCR,引物扩增目标突变区后，与磁珠（磁珠上固定有特异的,PCR,引物）混合进行油包水单分子扩增反应。反乳化作用后，利用不同颜色的荧光探针结合磁珠上的,PCR,产物，发出红色或绿色荧光。使用流式细胞仪分析磁珠颜色来确定突变情况。,BEAMing,技术,利用肿瘤组织进行,sanger,测序定义肿瘤组织的基因突变；,再利用,Beaming,技术检测,18,例癌症病人中,192,份血浆样本中,ctDNA,的突变情况，检测灵敏度可达到,0.005%,。,术前,:13.4%,术后,:0.015%,术后,(48,天,):0.11%,术后,(244,天,):0.66%,ctDNA: P = 0.006,CEA: P = 0.03,Comparison of ctDNA, CEA and imaging dynamics in individual study subjects,病人都经过多次手术和化疗,第一次手术进行局部切除时，,ctDNA,含量并没有降低；第二次手术完全切除,时，,ctDNA,含量大幅下降。,ctDNA,能实时显示病人体内肿瘤负荷的动态信息，以及治疗的效果（手术及化疗）。,标记扩增深度测序（,TAM-Seq,）,二步扩增：,预扩增：利用特异性引物进行,15,偱环的目标区域扩增,标签扩增：利用通用不同特性的接头标签进行二次扩增,双向重复测序：提高测序精度,突变频率检出率可达,2%,敏感性和特异性高于,97%,成本较低，利于临床应用,设计了,48,对引物去扩增,TP53,，,EGFR,，,BARF,，,KRAS,等癌症相关基因的,5995bp,突变区域,同时可对,10,个特异的癌症突变位点进行监控,用于确定多发癌症患者的复发病灶,用于监控癌症患者的肿瘤动态发展,癌症个体化深度测序,(CAPP-Seq),该方法利用定制化的突变位点库作为”筛选器”， 对样本进行靶向捕获后再进行超深度测序（可达到,10000X,），其对肿瘤的,ctDNA,检测灵敏度更高，特异性更强，与全外显子测序等相比经济可行。,Stage I,检出率,50%,Stage II-IV,检出率,100%,特异性可达到,96%,突变检出率,0.02%,Selector,区域：,139,个基因的,521,个外显子和,13,个内含子，约,125K,，占人基因组的,0.004%,测序覆盖深度,10000X,肿瘤的早期诊断,动态监测肿瘤的发生发展及疗效,评估肿瘤的异质性,评估肿瘤复发转移风险,靶向检测耐药突变，跟踪获得性耐药的发展，进行个性化用药指导,ctDNA,的临床应用,ctDNA,ctDNA,的分析指标,4,cfDNA,含量,1,2,3,5,ctDNA,突变频率,微卫星杂合性,cfDNA,完整性,ctDNA,甲基化频率,ctDNA,的分析指标,4,cfDNA,含量,1,2,3,5,ctDNA,突变频率,微卫星杂合性,cfDNA,完整性,ctDNA,甲基化频率,乳腺癌病人（尤其在转移性乳腺癌）的血浆,cfDNA,的完整性显著下调，而血浆,cfDNA,的浓度显著上调，可作为早期诊断的标志物，具有较好的敏感度和特异性。,肝癌病人的血浆中存在两种不同长度的,DNA,分子：短链,DNA,分子（,180bp,）；,短链,DNA,分子与,ctDNA,突变率及拷贝数异常相关，且与,ctDNA,浓度正相关；,长链,DNA,分子不携带肿瘤相关,ctDNA,特征，且与,ctDNA,浓度负相关。,肝癌病人血浆中线粒体,DNA,的含量显著高于健康人、乙肝及肝硬化患者，对肝癌的诊断具有较高的灵敏性和特异性，分别达,80%,和,94%,，可作为肝癌诊断的有效分子标记。,Proc Natl Acad Sci U S A.2015 Mar 17;112(11):E1317-25. doi: 10.1073/pnas.1500076112. Epub 2015 Feb 2.,LengtheningandshorteningofplasmaDNAinhepatocellularcarcinomapatients.,线粒体,DNA,可用于肝癌的诊断,J Clin Pathol,2013;,66,:775-778,American Journal of Clinical Pathology2015; 143(1):18-24.,PLoS One. 2015; 10(4): e0108247.,ctDNA,的分析指标,4,cfDNA,含量,1,2,3,5,ctDNA,突变频率,微卫星杂合性,cfDNA,完整性,ctDNA,甲基化频率,利用数字,PCR,检测,640,例不同癌症病人的血浆,ctDNA,，在超过,75%,的病人血液中检测到,ctDNA,，原发癌检出率约为,50%,。,在结肠癌，胃癌，胰腺癌，乳腺癌中，,ctDNA,检出率分别为,73%, 57%, 48%, 50%,。,相对于原发癌，,ctDNA,在转移癌中检出率更高，且分期越高，,ctDNA,检出率也更高；,可用于耐药突变的检测；,ctDNA,是普遍适用的、敏感和特异的标志物,可用于不同类型癌症患者的临床监测。,N Engl J Med 2013; 368:1199-1209,在,30,例转移性乳腺癌患者接受系统性治疗的不同时间点测定血液中的,ctDNA,，,CA 15-3,，,CTC,细胞,的含量，比较三者之间的敏感度。,Comparison of Circulating Tumor DNA, CA 15-3, and Circulating Tumor Cells as Blood-Based Biomarkers,灵敏度：,偱环肿瘤,DNA,：,85%,CA 15-3,：,59%,灵敏度：,偱环肿瘤,DNA,：,90%,偱环肿瘤细胞：,67%,Comparison of Circulating Biomarkers to Monitor Tumor Dynamics and Predict Survival.,结论：相对于蛋白类诊断标志物,CA15-3,及血液中的偱环肿瘤细胞，,ctDNA,在监测肿瘤的动态发展中具有更高的灵敏度。,血浆中,ctDNA,的含量与预后密切相关，含量越高，病人的,5,年生存率越低（,P0.001,）。,ctDNA,含量的增高及,CTC,数目的增加，病人的预后显著变差，而,CA15-3,没有预后判断功能。,监测,ctDNA,的突变率比监测,cfDNA,浓度，对胃癌动态发展的监控灵敏度更高。,利用区域捕获测序技术检测乳腺癌原发瘤及肝脏转移瘤的基因突变情况，并监控血液中,ctDNA,在治疗过程中的动态变化。,ctDNA,在监测肿瘤的动态发展中具有更高的灵敏度和特异性；,ctDNA,能比蛋白类标志物,CA15.3,更早的预测肿瘤动态发展情况。,相对于传统的影像学及蛋白类血清标志物，通过评估,ctDNA,的突变频率,能更早、更准确的预测结肠癌患者肿瘤经治疗后的动态发展情况。,ctDNA,的分析指标,4,cfDNA,含量,1,2,3,5,ctDNA,突变频率,微卫星杂合性,cfDNA,完整性,ctDNA,甲基化频率,利用亚硫酸氢盐平行测序检测不同肿瘤患者（肝癌，乳腺癌，肺癌，鼻咽癌等）血浆,DNA,甲基化发生情况及血浆,DNA,拷贝数异常情况，用于肿瘤的诊断及肿瘤负荷的监测；,血浆中甲基化癌症诊断灵敏度为,74%,，特异性为,94%,，具有较好的癌症诊断应用价值。,Percentage of bins showing hypomethylation in HCC patients and chronic hepatitis B virus (HBV) carriers with cirrhosis,血浆,DNA,的甲基化程度在肝癌患者显著上升，可用于肝癌的诊断；灵敏度为,81%,，特异性为,94%,；,血浆,DNA,拷贝数异常用于肝癌诊断，灵敏度为,81%,，特异性为,88%,。,Clin Cancer ResJuly 1, 2004,10;,4420,Journal of Thoracic Oncology: 2011,6,:1632-1638,World J Gastroenterol. 2011 Nov 28; 17(44): 49174921.,Int. J. Cancer: 131, 11531157 (2012),ONCOLOGY REPORTS 32: 505-512, 2014,ctDNA,的分析指标,4,cfDNA,含量,1,2,3,5,ctDNA,突变频率,微卫星杂合性,cfDNA,完整性,ctDNA,甲基化频率,血浆中短链,DNA,分子发生杂合性丧失的频率显著高于长链,DNA,分子。,血浆中短链,DNA,的,cyclin D2,基因（,D12S1725,）的微卫星杂合性缺失，患者的预后显著变差，可作为乳腺癌患者重要的预后标志物。,在卵巢癌患者中，短链,DNA,微卫星杂合性缺失的频率达到,67%,化疗后下调达到,45%,。,血浆中,M6P/IGF2R (D6S1581),的杂合性缺失与卵巢癌患者的生存率相关，有杂合性缺失的病人预后较差,(p = 0.030),。,ctDNA,在肿瘤诊断与预后领域的应用,ctDNA,临床应用面临的挑战,1,2,3,4,发展适合临床应用的,ctDNA,检测技术,(,快速、精准、低成本,),个体化的,ctDNA,标志物,ctDNA,在肿瘤个性化精准治疗领域的应用,