体内药物分析

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,体内药物分析,Biopharmaceutical analysis,1,第一章 体内药物分析概述,一、体内药物分析的定义,狭义：利用现代分析仪器和分离手段对人和动物血液、尿和组织等样品进行定性定量的分析,广义：通过体内药物浓度的分析，了解药物在体内的数量和质量的变化，获得药代动力学参数，为药品的生产、临床应用作出评价,2,二、体内药物分析的意义,（一）在新药评价 和开发中的意义,1全面质量控制,2新药报批,3为设计新药提供信息,从代谢产物中开发新药,保泰松羟基保泰松（作用强、副作用小）,非那西丁扑热息痛,前药设计,新剂型的研究，缓控释、经皮制剂等,以上内容必须通过测定体内药物浓度得以解决,3,（二）临床合理用药中的意义,1血药浓度与药理作用,4,2. 影响血药浓度的因素,（1）机体因素,a生理因素 年龄、性别、生理状况,b病理因素,c遗传因素,（2）药物因素,a剂型因素（生物利用度问题）,b药物合并使用（酶抑、酶促）,c时间因素,5,（三）药物中毒解救的意义,（四）兴奋剂检测的意义,6,三、体内药物分析的对象,3从样品的来源分,1从分析物分,母体药物,代谢物,内源性物质,2从生物样品种类分,均匀样品,非均匀样品,人体,实验动物,7,四、体内药物分析的任务,（一）方法学的研究,（二）治疗药物监测,TDM，therapeutical Drug Monitoring,1定义,2哪些药物需进行体内血药浓度监测,8,有效血药浓度范围窄，稍高毒性大，稍低无疗效,剂量小，毒性大的药物,个体差异大，剂量难以控制,药物毒性反应与疾病症状相似,多种药物合并应用，有中毒危险,胃肠道、肝脏、肾脏疾病,呈非线性动力学的药物,判断患者用药的依从性,9,（三）药代动力学的研究,（四）代谢分型的应用,（五）内源性物质测定,10,五、体内药物分析的特点,1干扰杂质多,2样品浓度低,3取样量少,4工作量大,5时间短,6有一定设备,11,六、体内药物分析的发展,1国外发展概况,60年代初发现药效与血药浓度关系,70年代体内药物分析方法建立,80年代至今发展迅猛，新仪器不断涌现,书籍出版,Drug Level Monitoring1980,Therapeutical Drug Monitoring1981,Textbook of Biopharmaceutic Analysis1981,12,2国内情况,80年代初，药物分析工作者倡导，1980年版药物分析教材中纳入部分内容，第二、三版增加体内药物分析一章。第四版、第五版取消，各学校开设体内药物分析课程。,80年代开始在医院进行临床药学工作，主要测定药物浓度。,13,有关书籍,吴如金体内药物分析人卫版1984,陆明廉血药浓度测定与临床应用上海科技1986,陈刚治疗药物监测理论与实践人民军医1988,吴莱文治疗药物监测人卫版 1989,曾经泽生物药物分析 北京大学出版社 1998,姚彤炜体内药物分析浙大2001,张君仁体内药物分析 化学工业出版社2002,14,3学科前沿,游离药物浓度测定,直接进样方法研究,代谢物测定,对映体分析,15,第二章 体内药物存在的状态与 体内药物分析的关系,一、药物的体内变化,吸收分布代谢排泄 ADME过程,发生两种变化,物理变化 可逆变化,化学变化 结构和数量发生变化,16,二、药物与血浆蛋白的结合,1游离型药物与结合型药物（非特异性的结合）,在血浆、组织中均存在游离型和结合型的药物,尿液中含微量P，血浆中含大量P，唾液中P为血浆1/10,与药物 结合的蛋白主要有白蛋白，a,1,-酸性糖蛋白、脂,蛋白,弱酸性药物主要与白蛋白结合,弱碱性药物与白蛋白、a,1,-酸性糖蛋白结合,药物与蛋白质的结合通过共价键（氢键，离子间静电力等）,17,2血浆蛋白结合率,D,f,+P D,b,K= 解离常数,血浆蛋白结合率：,= =,PD,f,D,b,D,b,D,b,+D,f,1,1+K/np+D,f,/np,18,结合力强的药物可以置换结合力弱的药物，通过竞争蛋白是药物相互作用类型之一。,由此可见，K、np是影响的重要因素,np ,K ,药物在足够高浓度时使结合部位饱和，浓度再增高，多余的药物均呈游离状态，结合部分比率降低，药物血浆蛋白结合率是药代动力学的重要参数之一。,19,3血浆蛋白结合的测定,平衡透析法、超滤法、凝胶过滤法、光谱法等。,（1）平衡透析法,原理,计算,= 100%,=C,t,-C,f,/C,t,100%,袋内-袋外,袋内药物,20,注意事项,a. 蛋白质溶液 新鲜血浆 pH7.4，至少三个浓度测定,b. 缓冲液 0.13mol/L磷酸盐缓冲液，因为Na3PO4 抑制酸性药物与蛋白质结合,c. 温度与平衡时间,37 1648h 注意防腐剂加入，药物的分解,d. 透析袋,渗漏检测 3%三氯醋酸,e. 搅拌 保持动态平衡,21,影响因素,a. 药物膜上吸附,b. Donnan效应,由于电荷的影响，可造成平衡时半透膜两侧游离药浓不同，donnan效应，加入中性盐可消除。,c. 空白值增加,d. 缓冲液体积变化，水分进入血浆 游离药浓,此法用于测定药物时，耗费时间太长，一般少采用,22,（2）超滤法,原理,计算,注意事项,a,装置,50l5ml,，,选择不同型号超滤膜，保湿。,b,速度与时间,300010000r/min 515min,c,温度,37,，,25,，,4,影响因素,a,膜吸附,b,超滤液的体积 超滤液,/,总体积,0.30.6,c,超滤膜温度,23,三、药物与血浆蛋白结合对体内药物分析的影响,1血浆不同对体内药物分析的影响,2平衡状态不同对体内药物分析的影响,3平衡状态受破坏对体内药物分析的影响,4游离与结合同时出现时对体内药物分析的影响,24,四、药物代谢,1研究药物代谢的意义,了解药物在体内的命运及相互作用，保证临床用药安全,有效,研究药物代谢途径、药物结构与药理作用关系，寻找新,药,研究药物相互作用机制,有利于建立体内药物分析新方法，避免代谢物干扰,25,2药物代谢的途径,第一相反应：在酶作用下发生的氧化、还原、水解，使极性增加，水溶性增强,第二相反应：药物或经一相反应后的代谢物与葡萄糖醛酸、硫酸盐结合等，使分子极性进一步加大，有利于从尿中排出，结合过程通常使药物灭活。,26,氧化反应,还原反应,水解反应,结合反应,a,葡萄糖醛酸结合,b,硫酸酯化,c,谷胱甘肽缀合,d,乙酰化结合,e,氨基酸结合,27,五、药物代谢与体内药物分析的关系,1样品的保存,样品可能会分解，如血浆酯酶可使酯类药物水解，酶类可使药物继续代谢，加入酶抑制剂和冷藏保存。,2分析方法选择 光谱法 色谱法 免疫法,3样品的提取、分离法,代谢物极性大、水溶性强，pH缓冲系统分开,尿液中药物多以结合型存在，要进行水解（酸水解、酶水解，溶剂解）,28,第三章 生物样品的预处理,一、生物样品的采集与贮藏,体内药物分析常用的分析品种有血液、尿液、唾液，也可用乳汁、泪液、脑脊液、胆汁等。,29,（一）样品的采集,1血样,血样浓度与作用点的浓度密切相关，可以反映靶器官的浓度。,血细胞,血浆（plasma）,血小板,血清（serum）,血细胞,测定血样中平均分布于细胞内和细胞外的药浓,抗凝,自然,全血,血液,30,2尿样,目的：药物剂量回收，药物清除，药物代谢和生物利用度,特点：浓度高，易于收集，体内代谢研究，应水解分 离,3唾液,唾液中药浓与血浓相关性,收集方法 离心 收集,31,（二）样品的贮藏,1血样（血浆、血清）及时分离冷藏， -70加入稳定 剂NaF,2尿样,尿中水、无机盐、尿素等细菌的生长， 4保存,加入防腐剂 a1%甲苯 b饱和氯仿 cpH改变,3唾液：同血样,32,二、生物样品的预处理,（一）预处理的目的,存在形式的多样性 游离 结合 代谢物,浓度低，杂质多（分离浓缩）,出现浑浊和沉淀,与试剂起反应,影响色谱柱寿命,33,（二）处理方法选择的一般原则,1药物理化性质,pKa 亲脂性 挥发性 溶解度 光谱特征 稳定性,2浓度范围 灵敏的方法,3测定的目的 定性 定量 母体 代谢,4生物样品的种类,5样品处理与分析方法的选择, 专一性 灵敏性,34,（三）生物样品去蛋白处理,1加入与水能混溶的有机溶剂及中性盐,甲醇 乙腈 甲醇1:2 乙腈1:1.5,（NH4）,2,SO4 NaCl,2加入酸性沉淀剂,三氯醋酸 高氯酸 苦味酸等 使蛋白质分子的阳离子形成不溶性盐而，pH低于等电点,35,3组织酶消化法,加入酶使蛋白质水解,优点：平衡条件下进行，可避免反应和降解,可改善对蛋白结合率强的药物的回收率,不产生乳化,4其他 加热 超滤,36,（四）生物样品缀合物水解,1酸水解,2酶水解,-葡萄糖醛酸苷酶 芳基硫酸酯酶 混合酶,pH4.5-7.0 37,3溶剂解,某些药物的硫酸酯，往往加入率取溶剂时发生分解，同时提取有机溶剂中,37,（五）生物样品的萃取,1液-液萃取,（1）优点：与杂质分离 简便,浓集 提取率高,（2）提取率：在有机相与水相中的溶解度的比值分配系数，一般少量多次，对生物样品一般一次萃取， 70%重现性,38,（3）影响提取率的因素,pH 碱性药物在碱性pH 酸性 酸性pH,提取溶剂 相似相溶原理 沸点低，不影响检测,性质稳定，不起化学反应,离子强度 加入中性盐 增加离子强度，与水结合强，便于有机溶剂提取,39,（4）离子对提取,对于离子性特强，水溶性极大的药物，可采用离子对提取,原理,应用,阴离子：COOH,+,SO,3,H,-,反离子 四丁基铵,阳离子：NH,2+,反离子烷基或芳基磺酸盐,（5）提取技术,一般在试管中进行 有机相与水相比1:1或2:1,40,（6）乳化问题,措施,轻缓振摇,含有分散度大或不溶物应过滤掉,避免在高pH条件下，从水中提取药物,避免使用易发生乳化的溶剂,萃取剂水中加入少量NaCl,41,破孔方法,机械法,加入少量高级脂肪醇 改变表面张力,改善混合溶剂比例，增加分散相分数,42,（7）药物的吸附,玻璃容器吸附 1%三甲一氯硅烷 10%二甲二氯硅烷,血浆,43,2液固萃取,固相萃取solid phase extraction SPE,针管式 抽空减压 加压 过滤,44,（1）固相萃取步骤,固相选择 样品1ml 1ml规格固相 125ml 3ml规格固相,固相处理,反相C,18,固定相的610倍体积甲醇洗柱，使溶剂化,610倍水缓冲服液冲洗达分离状态,上样,分离 用适当的弱溶剂洗涤 洗去杂质，通N,2,干燥固相,洗脱待测物 改变pH或极性,45,（2）影响固相萃取的因素,（1）流速 流速快，按触不充分，样品流失 回收率低,柱处理 510mlmin,-1,洗脱 0.21mlmin,-1,（300mg,25mlmin,-1,（300mg）,（2）装样 过载 突破性试验,已知浓度样品液, 小体积上柱洗脱回收百分率,加大体积洗脱回收百分率,绘图 当回收率下降时为过载,46,（六）生物样品的组分浓集,（七） 衍生化处理,GC衍生化,HPLC衍生化,47,第四章 体内药物分析方法的建立与评价,一、分析方法,根据药物理化性质，结构特征，药物浓度，干扰成分大小，实验目的,48,二、分析方法的设计依据,方法的建立,原始方法改进创新,创立方法,49,1,做好文献总结,2,充分了解药物特征及体内状况,pH,、亲脂性、溶解度、极性、光谱特征、药动学参数、体内代谢情况,3,明确测定目的、要求,目的,4,结合实验室条件,设备条件,预处理方法,药浓监测,药代动力学研究,母体药物和代谢物,50,三、分析方法的建立,1,纯品进行测定,确定线性范围、灵敏度、反应条件（,pH,、,t,、,T,）,2,空白样品测定,确定空白样品是否有干扰,3,以水代替空白样品，加标准液后测定,了解提取率、检测浓度,确定萃取条件、,pH、,挥发浓缩等,4,空白样品加入标准液测定,标准曲线建立,回归方程,回收率,5,实验样品测定,51,四、分析方法的评价,可行性和可靠性,1,准确度,accuracy,测定结果与真实性的差异,用回收率表示,接近,100%,相对恒定,52,绝对回收率,也称萃取回收率、提取回收率,测定血浆样品中药物浓度,/,相同浓度的标准液,=,绝对回收率,考虑,3,个浓度（高、中、低）,分布在标准曲线成上、中、下,一般要求绝对回收率在,70%,一般方法,HPLC,内标,内标法时注意：药物与内标用各自外标法测定回收率应相近，差值,10%,53,相对回收率,方法回收率,药物系列浓度,+,血样标准曲线,取高、中、低三浓度加入到空白血浆中，处理后测定，与加入标准量相比，得方法回收率，测定值,15%,，定量限,20%,54,注意问题：,a,加入药量与实际测定值相近,b,加入物与实际存在状态相近,c,空白试验,与已确定方法进行比较,55,2,精密度,precision,标准差,SD,相对标准性偏差,RSD,不大于,15%,，定量限不大于,20%, 日间精密度日内精密度,56,3,灵敏度（,sensitivity,）,检测的最小量,（,1,）检测限（LOD）,从背景中检测到的最小药物浓度：,S/N,3,的绝对量,LOD=3N/S,（,N,噪间,S,被测物信号,/,单位重量）,N=1mm,取,2g,ml,样品，,20l,进样,峰度,30mm,LOD=4ng,57,（,2,）定量限(LOQ),在一定精密度和准确度前提下求得最低检测量，通常以标准曲线最低点作为一定量限，也可,S/N=10,作为定量限，实际测定时，满足,35,个半衰期浓度，或,C,max,1/101/20,58,（,3,）最低检测浓度,可以进行定量测定的某一药物的最低浓度，它与样品体积大,小,等因素有关,最低检测浓度,=LOQ/,进样体积,体内浓度检测限,=,仪器浓度检测限,稀释度,1ml,0.1ml,体内检测限,=,仪,0.1,1ml,10ml,体内检测限,=,仪,10,59,（,4,）提取灵敏度的方法,提取仪器灵敏度,提取进样量,降低仪器噪音,提取浓度程度,60,4,专属法（,specificity,）选择性,同时受试药物合并应用的药物，体内代谢物等,5,线性范围（,Linear range,）,61,6,稳定性（,stability,）,（,1,）长期贮存稳定性,-20-70,（,2,）短期室温稳定性,室温放置,424h,（,3,）冷冻解冻稳定性,冷冻解冻冷冻解冻,（,4,）贮备液稳定性,贮备液在室温或冷冻条件下,62,五、应用实例,63,