呈色反应及等电点测定

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,生物化学实验,蛋白质及氨基酸的呈色反应,蛋白质等电点的测定,1,蛋白质及氨基酸的呈色反应,1.学习蛋白质的鉴定方法并了解其原理;,2.学习氨基酸的鉴定方法并了解其原理.,目的要求,2,实验内容,双缩脲反应（尿素和蛋白液）,黄色反应（头发，指甲，蛋白液）,茚三酮反应（氨基酸，蛋白质）,3,原理,双缩脲反应,双缩脲,双缩脲络合物,双缩脲,4个肽键的氨基与铜离子形成络合物,4,多肽链,双缩脲似络合物,原理,5,实验内容,1.加热尿素生成双缩脲,观察双缩脲反应的颜色变化;,2.观察透析蛋白液的双缩脲反应的颜色变化.,双缩脲反应,6,尿素(晶体),10%氢氧化钠溶液,1%硫酸铜溶液,蛋白液（取鸡蛋清，加6-10倍水混匀，过滤）,双缩脲反应,实验试剂,7,试管及试管架,试管夹,酒精灯,实验器材,双缩脲反应,8,实验操作,见教材,9,注意事项,选用干燥的试管,尿素加热时间不能过长(1分钟以内);,避免加入过量,CuSO,4,否则生成兰色的Cu(OH),2,能掩盖紫红色.,双缩脲反应,10,黄色反应,酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸,硝酸对苯环发生硝化作用，生成黄色的芳香硝基化合物，使蛋白质发生变性,反应原理,硝基酚,（黄色）,邻硝醌酸钠,（橙黄色）,11,实验试剂与器材,见教材,12,实验操作,见教材,13,原理,茚三酮反应,14,实验内容,1.蛋白质(蛋白液)的茚三酮反应;,2.氨基酸的茚三酮反应.,茚三酮反应,15,0.5%茚三酮乙醇溶液,透析蛋白液,0.5%甘氨酸溶液,茚三酮反应,实验试剂,16,试管,试管架,酒精灯,电吹风,茚三酮反应,实验器材,17,注意事项,在滤纸上观察茚三酮反应时,滤纸应该跟火焰保持一定距离.,茚三酮反应,18,思考题,1.如果蛋白质水解作用一直进行到双缩脲反应呈阴性结果,可对水解作用作出什么结论?,2.能否利用茚三酮反应可靠的鉴定蛋白质的存在?,茚三酮反应,19,蛋白质含量测定 （设计性实验）,2010.4,20,蛋白质的浓度测定方法,根据它们的物理性质，如折射率、比重、吸光值来测定，如蛋白质的紫外吸收法；,利用蛋白质的化学性质，用化学反应的方法测定，如凯氏定氮法、双缩脲法、Folin酚试剂法测定；,还可用染色法，如用氨基黑、考马斯亮蓝-G250测定；,另外还可用萤光激发、放射性同位素计数等灵敏度较高的方法测定。,上述方法中，紫外吸收法、双缩脲法、 Folin酚试剂法、凯氏定氮法、考马斯亮蓝染色法最为常用，它们操作相对简单，不需要昂贵的设备。以下主要介绍这几种方法。,21,双缩脲法测定蛋白质含量,原理：在碱性溶液中蛋白质与铜离予形成 紫红色络合物，可在540nm比色测定，其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质的相对分子质量及氨基酸组成无关，该法测定的蛋白质浓度范围为1-10g/l。,22,器材试剂,双缩脲试剂,标准蛋白液（牛血清白蛋白）,分光光度计,离心机,23,实验操作,尽量详细，涉及计算的最好提前计算好；,提前掌握相关仪器设备的使用,24,紫外吸收法测定蛋白质含量,由干蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，所以蛋白质溶液在280nm处有一个紫外吸收高峰。在一定浓度范围内，蛋白质溶液在280nm的光吸收值与其浓度成正比，因此可作定量测定，该法测定蛋白质的浓度范围为0l1g/L。,25,器材试剂,分光光度计,离心机,26,实验操作,标准曲线制备,27,考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量,原理： 考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色当它与蛋白质结合后，变为蓝色，可在590nm 处比色测定，该法反应快、操作简便，消耗样品最少。,缺点：不同蛋白质之间差异大,（why?），,且标准曲线线性较差。测定蛋白质的浓度范围为0.01-1.0g/l。,28,器材试剂,考马斯亮蓝G-250染色液配制,29,实验操作,标准曲线制备,待测样品测定,30,重点难点,测定方法的选择；,待测蛋白质的选材（蛋白质的含量；蛋白质种类；干扰因素）；,制备蛋白质溶液（尽可能多的含有目标蛋白，澄清，无沉淀）；,标准曲线制备（待测蛋白液浓度在标准曲线中间）。,31,蛋白质等电点的测定,原理,32,测定白明胶的等电点:配置不同PH值的缓冲液,加入白明胶后,再加入脱水剂,观察溶液的浑浊程度,指出等电点,蛋白质等电点的测定,实验内容,33,0.1mol/l醋酸钠溶液,0.1mol/l醋酸溶液,95%乙醇,1%白明胶溶液,1mol/l醋酸溶液,蛋白质等电点的测定,实验试剂,34,试管4支(大),试管架,吸量量管(5毫升2支,2毫升3支,1毫升1支),蛋白质等电点的测定,实验器材,35,蛋白质等电点的测定,36,白明胶应先在水浴锅加热,搅拌并溶解,待完全溶解才能使用;,滴加乙醇时应边加边振荡.,蛋白质等电点的测定,注意事项,37,什么是蛋白质的等电点?,蛋白质在等电点溶液中必然沉淀,请结合蛋白质的胶体性质说明以上结论对吗?,蛋白质等电点的测定,思考题,38,氨基酸的甲醛滴定,2011.3,39,实验目的,掌握甲醛滴定法测量氨基酸含量的原理和方法,40,实验原理,氨基酸是两性电解质，在水溶液中达水解平衡是弱酸，完全解离时pH为1112或更高 ；,一般指示剂变色域小于10，很难准确指示终点。,41,指示剂名称,低pH值时颜色,过渡、转变颜色的pH范围,高pH值时颜色,石蕊,红,4.5 - 8.3,蓝,酚酞,无色,8.2 - 10.0,粉红,酚红,黄,6.6 - 8.0,红,甲基橙,红,3.1 - 4.4,黄,甲基紫,黄,0.0 - 1.6,紫蓝,甲基黄,红,2.9 - 4.0,黄,甲基红,红,4.2 - 6.3,黄,刚果红,蓝,3.0 - 5.2,红,百里酚蓝,黄,8.0 - 9.6,蓝,孔雀石绿,黄,0.2 - 1.8,蓝绿,溴甲酚绿,黄,3.8 - 5.4,蓝绿,溴甲酚紫,黄,5.2 - 6.8,紫,溴酚蓝,黄,3.0 - 4.6,紫,溴百里酚蓝,黄,6.0 - 7.6,蓝,百里酚酞,无色,9.4 - 10.6,蓝,42,实验原理,43,R-CH-COOH R-CH-COOH,NH,2,甲醛,N(CH,2,0H),2,(氨基酸) (二羟甲基氨基酸）,PK:10-12 PK:7,酚酞,（PH9左右由无色变成粉红色）,PK：氨基酸完全解离时的PH值,实验原理,44,实验试剂和器材,三、器材,1锥形瓶,2吸量管（2 mL 、5 mL）,3碱式滴定管、滴定台、蝴蝶夹,四、试剂,101 m01L标准甘氨酸溶液,201 molL标准氢氧化钠溶液,3. 0.5酚酞指示剂,4. 中性甲醛溶液,45,实验操作,1取3个25 mL的锥形瓶，编号。向第1、2号瓶内各加入2 mL 0.01 molL的标准甘氨酸溶液和1-2滴酚酞指示剂,向3号瓶内加入2mL水1-2滴酚酞指示剂;然后向1号瓶中加入4mL甲醛溶液，混匀，再向1号瓶滴加0.01 molL标准氢氧化钠溶液至溶液显微红色。 向2、3号瓶中各加入4mL甲醛溶液，混匀，再分别向2、3号瓶滴加0.01 molL标准氢氧化钠溶液至1号瓶颜色。,46,重复以上实验2次，记录每次每瓶消耗标准氢氧化钠溶液的mL数。取平均值，计算甘氨酸氨基氮的回收率。,氨基氮的实际测得量：,氨基氮(mg/ml)=（V,2,-V,3,）0.14008/2,甘氨酸氨基氮回收率= 实际测得量 / 理论加入量 100%,实验操作,C,2,H,2,NO,2,47,48,2.取未知浓度的甘氨酸溶液2ml，依上述方法进行测定，平行做2份，取平均值。计算每ml甘氨酸溶液中含有氨基氮的mg数。,氨基氮,(mg/ml),=（V,2,-V,3,）0.14008/2,实验操作,49,50,注意事项,配制中性甲醛溶液时，密切观察溶液颜色变化（酚酞的呈色范围8.2-10.0，粉红-紫红）；,滴加氢氧化钠时，一定要边滴边摇晃；,51,PH,NaOH,2.5,4.3,9.7,A,B,7.0,突跃范围,滴定误差,52,