抗磷脂综合征及实验室诊断

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,抗磷脂综合征及实验室诊断,抗磷脂综合征,抗磷脂综合征,(,antiphospholipid,syndrome,APS),是一组以反复发生动脉、静脉血栓或和习惯性流产为临床表现,伴持续性抗磷脂抗体,(,antiphospholipid,antibody APL),或抗,2,糖蛋白,I(,2,GPI),抗体阳性,且多系统受累的非炎症性自身免疫性疾病,又称抗磷脂,-,血栓综合征,(,antiphospholipid,-thrombosis,syn-drome, APL-T),。,抗磷脂综合征,(,APS,),的相关抗体包括:,抗,磷脂抗体（,APL,）,、抗,2,GPI,抗体、抗凝血酶原抗体(a-PT)、,强联蛋白（,Annexin,）抗体、,抗磷脂酸抗体及抗磷脂酰丝氨酸抗体等,。,抗,磷脂抗体,APL主要包括,:,狼疮抗凝物(,l,upus,anticoagulant, LA,),抗心磷脂抗体(,anticardiolipin,antibody, ACA,),抗磷脂综合征的主要辅助因子及抗体,磷脂自身的抗原性较弱，只有与某些蛋白质形成磷脂蛋白复合物才能有较强的抗原性。故这些蛋白质为重要的辅因子。目前认为以凝血酶原、,2,GPI,、,强联蛋白,V,等，为抗磷脂抗体最重要的辅因子。,抗磷脂综合征的主要抗体,狼疮抗凝物,LA,狼疮抗凝物,LA,是,1952,年,Conley,和,Hartmann,最早在,SLE,患者血清中发现的一种在体外试验中具有延长依赖磷脂的凝血试验的免疫球蛋白,后发现,LA,也存在于其他免疫性疾病患者,甚至健康人体内。,在体外, LA,可不依赖靶蛋白而通过结合磷脂以及抑制磷脂表面发生的凝血反应,从而干扰依赖磷脂的凝血过程起抗凝作用。,抗磷脂综合征的主要抗体,狼疮抗凝物,在体内, LA,通过作用于靶蛋白,:,凝血酶原、,PC,、,2,GPI,等,促进血栓的形成。如,LA,与凝血酶原结合,可促进凝血酶原与内皮细胞表面的磷脂结合及凝血酶原的活化,;LA,与,2,GPI,结合,可诱导血管内皮细胞、单核细胞表达,TF,。,有学者在回顾,1988,年到,2000,年,LA,、,ACA (,抗心磷脂抗体,),与血栓形成关系的相关文献时指出,: LA,是,APS,血栓形成的重要危险因素,;,在总的血栓事件中,LA,阳性患者血栓形成的相对危险度大于,ACA,阳性患者。,抗磷脂综合征的主要抗体,抗心磷脂抗体,ACA,最早用于梅毒血清检测, 1983,年,Harris,和,Coworkers,发现某些无梅毒感染患者血清中,ACA,也阳性。此后实验发现,ACA,不仅存在于狼疮患者体内,同时也存在于非狼疮患者中如自身免疫性、感染性、淋巴增生性疾病。,ACA,与,LA,存在交叉反应, ACA,与多数带负电荷的磷脂也有交叉反应。,抗磷脂综合征的主要抗体,抗心磷脂抗体,APS,患者体内的,aCL,与心磷脂结合时需要,2-GPI,的参与,2-GPI,的存在使,aCL,与心磷脂的结合增强,称为,2-GPI,依赖的,aCL,。而在一些感染性疾病如梅毒时,aCL,可直接与心磷脂结合,2-GPI,的存在使其结合受到抑制,称为非,2-GPI,依赖的,aCL,。,ACA,是动脉血栓形成的危险因素,与静脉血栓形成的相关性较小,抗磷脂综合征的主要辅助因子及抗体,2,GPI,及抗,2,GPI,抗体,2,GPI,及抗,2,GPI,抗体,2,GPI,由肝细胞分泌的血浆糖蛋白,参与乳糜微粒、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白等的组成,在脂肪的代谢和转运中起着一定作用,故称为载脂蛋白,H (,apoH,),。,2GPI,被认为是一种天然的抗凝剂,在体外有明显的抑制凝血的作用,:,抑制,F,的活性及激活,PC,的抗凝作用,;,也可直接与,F,结合,抑制凝血酶及,F,对,F,的激活。,2,GPI,及抗,2,GPI,抗体,2,GPI,具有与磷脂结合的性质，通过与磷肥结合，对内源系统凝血因子的功能起抑制作用，但若体内存在,ALA,与磷脂,2,GPI,复合物起反应时，,2,GPI,的抗凝作用受抑，其抑制凝血因子与抑制血小板聚集的功能消失，从而有助于形成高凝状态，促进血栓的形成。,2,GPI,及抗,2,GPI,抗体,抗,2GPI,抗体包括,IgG,、,IgM,及,IgA,IgG,与血栓密切相关。抗,2GPI,抗体与,2GPI,结合,可促进,2GPI,与细胞膜表面磷脂稳定结合,从而干扰依赖磷脂的抗凝途径,;,主要是,PC,抗凝途径,增加了血栓形成的危险性。抗,2GPI,抗体还能促使,2GPI,与血管内皮细胞、单核细胞及血小板相关受体,(,血管内皮细胞上的,Toll-like receptor,单核细胞上的,annexin,A2,、血小板上的,apo,ER2 ),结合,诱导血管内皮细胞、单核细胞表达组织因子,(TF),而发挥其促凝作用。抗,2GPI,抗体同时也可激活血小板,诱导血栓素产生增加,促进血栓形成。,2,GPI,及抗,2,GPI,抗体,也有学者报道抗,2GPI,抗体能抑制,2GPI,与,vWF,结合,而解除,2GPI,对,vWF,诱导血小板聚集的抑制。,近年来许多研究表明抗,2-GPI,抗体不仅是血管血栓和妊娠丢失的独立危险因素,并且对,APS,的诊断较,aCL,特异性更高。有学者认为,联合检测抗,2-GPI,抗体和,IgG,型,aCL,是诊断,APS,的最佳方案。,a-PT,a-PT,是,1983,年,Bajal,等在,LA,阳性的低凝血酶原血症患者血清中首先发现的,后来又有学者发现,a-PT,也具有,LA,活性。,a-PT,在凝血酶原分子上的识别结合位点目前尚不十分清楚,Bajaj,等报道,1,例,LA,阳性的低凝血酶原血症病人的,a-PT,可以识别凝血酶原和前凝血酶,1,但不与凝血酶原的裂解片段,(,片段,1,、,F1,和片段,2,、,F2),结合。也有学者报道,a-PT,能识别凝血酶和,F1,。,因前凝血酶,1,和,F1,都位于凝血酶原氨基端,所以认为,a-PT,主要识别凝血酶原氨基端的抗原表位。凝,血酶原的氨基端与其它维生素,K,依赖性抗凝血因子,(PC,和,PS),具有同源性,因此,a-PT,也可识别并结合,PC,和,PS,抑制,PC,抗凝途径。,a-PT,与凝血酶原结合后,促进后者与磷脂结合,引起磷脂表面的凝血酶原增加,;,与,a-PT,结合的凝血酶原仍可被活化成为凝血酶,促进血栓形成。,Annexin,蛋白家族即强联蛋白,又称胎盘抗凝蛋白,-I,。现已发现的,Annexin,蛋白有,20,多种,Annexin,蛋白具有介导各种蛋白的生物活性,参与细胞信号的转导、影响酶的活性、影响细胞的结构组成、调控炎症反应、细胞分化等作用。,Annexin-2,和,Annexin-5,在抗凝及纤溶中起主要作用,与,APS,血栓形成密切相关。内皮细胞、胎盘合胞体滋养层细胞的表面均有,Annexin-2,表达,其可与纤溶酶原,(,plasminogen,PLG),及,tPA,结合,作为辅因子促进,tPA,对,PLG,激活。抗,Annexin-2,抗体可抑制,Annexin-2,的上述作用。,Annexin-2,作为,2,GPI,高亲和力受体,在,2GPI,存在时,抗,2GPI,可通过,2GP,与,Annexin-2,结合黏附于内皮细胞表面,激活内皮细胞表达黏附分子,7,。,Annexin-5,具有很强抗凝活性,对磷脂有高的亲和力,可与凝血因子竞争磷脂结合位点,从而阻止细胞膜磷脂表面的凝血反应。,APL,通过与,Annexin-5,竞争磷脂结合位点,干扰,Annexin-5,与带负电荷的磷脂的结合,使其不能发挥抗凝作用。,Rand,等报道抗,Annexin,抗体与,Annexin-5,结合后,使胎盘滋养层细胞表面的,Annexin-5,表达减少,从而降低,Annexin-5,的抗凝作用,及促进凝血酶的产生,导致胎盘血栓形成,8,。目前公认,Annexin,抗体是导致,APS,习惯性流产的独立危险因子。,APS,诱发血栓形成的机制,APS,分原发性和继发性两类,前者无任何诱因,后者多继发于系统性红斑狼疮,(systemic lupus,erythema-tosus, SLE),、类风湿性关节炎、干燥综合征等结缔组织疾病,也可继发于各种感染与肿瘤等。,APS,血栓形成的机制尚未完全清楚,可能涉及多个病理环节。目前已明确,APS,的相关抗体为,APS,的主要致病因素。,APS,的病理基础是体内凝血及纤溶机制的异常造成的全身血管内血栓形成。由于,APS,的靶抗原及抗体的异质性,因而,APS,血栓形成的发病机制也是多途径的,可能与如下因素有关,:,APL,导致血栓形成的主要机制,APL,抑制体内正常抗凝物质的反应,APL,抑制活化的蛋白,C(activated,protein C,APC),及,APC,活化途径中的凝血酶调节蛋白,或通过磷脂,-2-GPI,复合物与,PC,结合,导致,PC,功能障,;APL,通过竞争磷脂酰乙醇胺而干扰,PC,途径,引起活化蛋白,C,抵抗现象,(acquired protein C,resistance,APCR,);,APL,抑制抗凝血酶的活性,;,APL,抑制体内正常抗凝物质的反应,APL,抑制膜联蛋白,V(annexin,V),的抗凝活性,;,APL,抑制,2-GPI,的抗凝活性。,aPL,导致血栓形成的主要机制,aPL,引起一系列细胞介导的反应,aPL,活化单核细胞,使其表达组织因子,(tissue,factor,TF,),从而导致体内凝血反应,引发血栓形成,;,aPL,活化血管内皮细胞,使其表达,TF,和黏附分子,促进凝血活性增强,引发血栓形成,;,aPL,抑制纤溶酶的活性,从而降低纤溶系统对纤维蛋白的降解作用促进血栓形成,;,aPL,引起一系列细胞介导的反应,aPL,与血管内皮细胞的磷脂结合后使内皮细胞功能受损,导致前列腺素的合成及释放减少,而前列腺素有重要的抗血小板凝集和扩血管作用。,aPL,与血小板膜磷脂结合导致血小板活化。,抗磷脂综合征诊断标准,该标准包括临床和实验室两方面内容,:,临床指标有血管血栓形成和,(,或,),妊娠丢失或新生儿异常,;,实验室指标包括狼疮抗凝物,( LA),和,(,或,),IgG,类或,IgM,类抗心磷脂抗体,(,aCL,),阳性。,至少同时符合一项临床指标和一项实验室指标才能诊断为,APS,。,抗磷脂综合征诊断标准,2005,年在悉尼举行的国际血栓止血学会,(ISTH),会议提出了,APS,诊断标准的修改意见,对,APS,的诊断提出了许多更详细的新规定。,修订标准仍然分为临床和实验室两方面内容,须同时符合一项临床指标和一项实验室指标方能诊断为,APS,。,临床指标有两项,:,血管血栓形成,:,影像学或组织病理学确定的任何组织或器官动脉、静脉或更小血管的血栓形成,(,组织病理学诊断为血栓时血管壁必须无明显炎症,),。,妊娠丢失,:(a)1,次以上无法解释的妊娠,10,周以上形态正常的胎儿,(,超声或直接胎儿检查,),死亡,或,(b)1,次以上由于子痫、严重先兆子痫或胎盘功能不全引起的早产,(,妊娠,34,周,胎儿形态正常,),或,(c)3,次以上不明原因的早期自发性流产,(,妊娠,40,单位,),或滴度达到正常人群水平的,99%,以上。检测间隔至少,12,周,采用标准,ELISA,法。,血浆或血清,IgG,类或,IgM,类抗,2,糖蛋白,I(2-GP I),抗体,2,次阳性,滴度达到正常人群水平的,99%,以上。检测间隔至少,12,周,采用标准,ELISA,法,抗心磷脂抗体,(,anticardiolipin,ACA,),的实验室检测,抗心磷脂抗体,(,anticardiolipin,ACA,),是一种以血小板和内皮细胞膜上带负电荷的心磷脂作为靶抗原的自身抗体,.,常规采用,ELISA,检测，其优点在于避免了凝血因子缺乏与抗凝剂的影响。在同种型中,C,以,IgM,最临床意义，,IgG,次之，,IgA,几无临床意义。,ACA,不是,LA,的替代试验，而是另一种特质性抗体，故当病史与,ACA,阳性，即使,LA,阴性，亦可诊断为,APS,。但若,ACA,滴度过低，则无诊断意义。,狼疮抗凝物,的实验室检测,LAC,筛选试验,较常用的有：活化部分凝血活酶时间,(APTT),、白陶土凝集时间,(KCT),、凝血酶原时间,(PT),、蝰蛇毒凝集时间,(,dRVVT,),和凝血酶时间,(TT),其中最常用的是,APTT,、,PT,。,LAC,阳性者,APTT,、,KCT,、,PT,、,RVVT,延长,其中以,APTT,、,KCT,最敏感。,狼疮抗凝物,的实验室检测,APTT,、,PT,异常可见于,:,纤维蛋白原、,F,、,F,、,F,缺乏,(APTT,延长可被,1/10,正常的新鲜血浆所纠正,),。,类肝素样物质增多,(APTT,延长不能被等量正常血浆纠正,),。,LAC,增多,(,患者的血浆与正常血浆等量混合检测,APTT,仍超过正常对照,4,倍,但可被洗涤后冻融的血小板纠正,),。因此,筛选试验异常时需要进行确诊试验。,狼疮抗凝物,的实验室检测,LAC,确诊试验,改良的,Russell,蝰蛇毒稀释确诊试验,:,Lupo,试验,:,当蝰蛇毒凝集时间延长时,加正常乏血小板混合血浆后,蝰蛇毒凝集时间仍然延长,不被纠正,提示被检血浆中存在狼疮抗凝物。,Lucor,试验,:,即为纠正实验。补充外源性磷脂,磷脂能中和狼疮抗凝物质,从而使蝰蛇毒试验被纠正,时间缩短或正常。,此试验简便而具有特异性,是狼疮抗凝物的确诊试验。正常,Lupo,试验为,31-44,s,Lucor,试验为,30-38,s,Lupo,试验,/,Lucor,试验比值为,1.0-1.2,。,Lupo,试验比正常延长,20%,Lupo,试验,/,Lucor,试验比值大于,1.2,提示有狼疮抗凝物质存在。,Lupo,试验,/,Lucor,试验比值大于,2.1,表示有大量狼疮抗凝物质存在,;,Lupo,试验,/,Lucor,试验比值为,1.5-2.0,表示中等量狼疮抗凝物质存在,;,Lupo,试验,/,Lucor,试验比值为,1.3-1.4,表示少量狼疮抗凝物质存在。,Lupo,试验和,(,或,),Lucor,凝固时间延长,Lupo,试验,/,Lucor,试验比值小于,1.2,也可出现于因子,、,、,缺乏的患者,或者应用华法林或肝素等患者。,Lupo,试验,异常延长,但能被正常血浆纠正,提示因子,、,、,缺乏。当蝰蛇毒试验延长时不能被正常血浆纠正,亦不能被外源性磷脂纠正,可见于类肝素样抗凝物质增多。,LAC,检测的筛选试验和确诊试验对诊断,LAC,的特异性强,但有时,APTT,可以正常。因此,必要时可做多个筛选试验。,正常血浆,+,病人血浆,混合,实验,实验,1:,实验,2,:,确诊,实验,确诊,LA,孵育混合血浆,纠正,实验,1:,筛选实验,实验,2:,停止对,LA,的检测,正常,不正常,不能纠正,纠正,不能纠正,因子检测,因子缺乏,纠正,国际组织推荐的狼疮抗凝物检测流程,-,对狼疮抗凝物敏感,-,应用,2,个不同的原理,-,低浓度磷脂,特殊抑制物,磷脂依赖的,正常,按照国际组织推荐流程采用,Diagnostica Stago,试剂,检测狼疮抗凝物,正常血浆,+,病人血浆,混合,实验,实验,1:,实验,2:,确诊,实验,确诊,LA,孵育混合血浆,纠正,不正常,不能纠正,正常,不正常,因子检测,因子缺乏,纠正,特殊抑制物,实验,1:,筛选实验,实验,2:,停止对,LA,的检测,正常,正常,PTT-LA,STA Staclot,DRVV Screen,Staclot LA,STA Staclot,DRVV Confirm,