表观遗传学课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,表观遗传学及其几种,病原生物学系 张祖萍,2010,年,12,月,1,内容纲要,表观遗传学概述,表观遗传学主要内容,几种常用表观遗传学研究方法,Epigenetics,2,一、表观遗传学概述,（一）常见表观遗传学现象,同卵双生的双胞胎虽然具有相同的,DNA,序列，却存在表型和疾病易感性的差异。,3,一、表观遗传学概述,（一）常见表观遗传学现象,克隆动物未老先衰,多莉：生于,1996,年,7,月,5,日，死于,2003,年,2,月,14,日,4,一、表观遗传学概述,（一）常见表观遗传学现象,组织特异性基因,的表达,5,一、表观遗传学概述,（二）表观遗传学起源,6,一、表观遗传学概述,（三）表观遗传学确切定义,表观遗传学：基因的,DNA,序列不发生改变的情况下，基因的表达水平与功能发生的可遗传的改变。,7,（四）表观遗传学的特点,可遗传的，即这类改变通过有丝分裂或减数分裂，能在细胞或个体世代间遗传；,可逆性的基因表达调节，也有较少的学者描述为基因活性或功能的改变；,没有,DNA,序列的改变或不能用,DNA,序列变化来解释。,一、表观遗传学概述,8,一、表观遗传学概述,（五）表观遗传学与经典遗传学,表观遗传学是对经典遗传学的补充和完善，,丰富了传统的遗传学内容。,9,一、表观遗传学概述,（五）表观遗传学与经典遗传学,基因组含有两类信息,遗传信息：它提供了产生生命所必需的所有蛋白质的全,部核昔酸序列；,表观遗传信息：它提供了何时、何地和如何应用遗传学信,息的指令，以确保基因表达在时间和空间上,的有序性的。,10,二、表观遗传学主要内容,DNA,甲基化修饰,组蛋白修饰,染色质重塑,非编码,RNA,的调控,11,二、表观遗传学主要内容,（一）,DNA,甲基化修饰,DNA,甲基化,(DNA methylation),是研究得最清楚、也是最重要的表观遗传修饰形式，主要是基因组,DNA,上的胞嘧啶在,DNA,甲基转移酶（,DNMTs,）催化下，甲基从,S-,腺苷甲硫氨酸（,SAM,）转移至胞嘧啶,5,位碳原子上，形成,5-,甲基胞嘧啶（,m5C,）。在发生甲基化的胞嘧啶后通常紧跟着一个鸟嘌呤（,G,）碱基。因此，通常称,CpG,的甲基化 。,DNMT1,SAM,胞嘧啶,5-甲基胞嘧啶,12,二、表观遗传学主要内容,（一）,DNA,甲基化修饰,在结构基因的,5,端调控区域,CpG,二连核苷常常以成簇串联形,式排列，这种富含,CpG,二连核苷的区域称为,CpG,岛,(,CpG,islands,),，其大小为,500-1000bp,，约,56%,的编码基因含该结构。,基因调控元件,(,如启动子,),所含,CpG,岛中的,5mC,会阻碍转录因子复,合体与,DNA,的结合。,13,二、表观遗传学主要内容,（一）,DNA,甲基化修饰,14,二、表观遗传学主要内容,（一）,DNA,甲基化修饰,DNA全新甲基化,DNA,主动去甲基化,DNA,甲基化状态的保持,15,二、表观遗传学主要内容,（一）,DNA,甲基化修饰,肿瘤细胞的甲基化特点,总体甲基化水平低,局部甲基化水平高，即抑癌基因的甲基化水平高,16,二、表观遗传学主要内容,（一）,DNA,甲基化修饰生物学意义,胚胎发育,X,染色体失活,寄生,DNA,序列抑制,基因印记,基因组稳定,17,二、表观遗传学主要内容,（二）组蛋白修饰,每个核小体由核心组蛋白（,H2A,H2B,H3,H4,）构成异源八聚体和缠绕在八聚体之外的约,200bp,的,DNA,组成。,核小体结构示意图,18,二、表观遗传学主要内容,（二）组蛋白修饰,基因正常表达除了需要相应转录因子的诱导和启动子区处于,低甲基化状态外，还需要具备另外一个表观遗传学条件，即,组蛋白修饰处于激活状态。,组蛋白对特定氨基酸的修饰可以间接提供某些蛋白的识别信,息，然后通过蛋白质和染色质的相互作用改变染色质的结,构，从而调控基因的表达。,组蛋白中被修饰氨基酸的种类、位置和修饰类型被称为组蛋,白密码（,histone code,）。,19,（二）组蛋白修饰,二、表观遗传学主要内容,20,二、表观遗传学主要内容,（二）组蛋白,乙酰化,修饰（,Acetylation),乙酰化修饰大多发生在,H3,、,H4,的,Lys,残基上，在组蛋白乙酰,基转移酶（,HAT,）的作用下将乙酰基转移到其残基上，消除了,氨基酸上的正电荷，这时,DNA,分子本身所带的负电荷有利于,DNA,构象的展开，核小体的结构变得松弛，使得转录调控的各,种蛋白因子能够与,DNA,结合，进而发挥转录调控作用。,组蛋白中不同氨基酸残基的乙酰化一般与活化的染色质构型常,染色质,(euchromatin),和有表达活性的基因相关联。,组蛋白乙酰化是可逆的过程，可在组蛋白去乙酰化酶（,HDAC,）,的作用下去乙酰化。,21,二、表观遗传学主要内容,（二）组蛋甲基化修饰（,Methylation),组蛋白甲基化可以与基因抑制有关，也可以与基因的激活相关，这往往取决于被修饰的赖氨酸处于什么位置。,组蛋白,H3,的,5,个,Lys(K4,、,K9,、,K27,、,K36,、,K79,）和,H4,的一个,Lys,（,K20,）可被甲基化：,H3-K9,、,H3-K27,、,H4-K20,甲基 化可以抑制基因表达；,H3-K4,、,H3-K36,、,H3-K79,甲基化具有激活效应。,22,二、表观遗传学主要内容,（二）组蛋白磷酸化修饰（,Phosphorylation),组蛋白 修饰位点 酶 主要功能,H2A S1 MSK1,抑制基因转录，参与细胞周期,与减数分裂,H2B S14 Mst1,细胞凋亡和,DNA,损伤修复,H3 S33 TAF1,细胞周期的演进与发育,H4 T3 Haspin,细胞分裂中染色体排列等,S10 RSK2,MSK1/2,细胞分裂，细胞凋亡,T11 DIK/ZIP,细胞分裂,S28 Aurora Kinase,PKA,细胞分裂，细胞凋亡,S1 CKII DNA,损伤修复,参与细胞周期,与减数分裂,23,二、表观遗传学主要内容,（二）组蛋白泛素化修饰（,Ubiquitin),泛素化修饰是一个由多种酶 共同参与调控的级联酶促反应过程，,ATP,依赖导致,26S,蛋白酶复合体对修饰蛋白的水解,H2A,和,H2B,是泛素化修饰最集中的地方，参与基因调控的机制：改变染色质高级结构，暴露,DNA,，起始转录。,E1:,泛素活化酶；,E2,：泛素结合酶；,E3,：泛素连接酶,24,二、表观遗传学主要内容,（三）染色质重,塑,（,chromatin remodeling,）,染色质重塑,是指染色质位置和结构的变化,(,核小体的置换或重新排列,),改变了核小体在基因启动序列区域的排列，增加了基因转录装置和启动序列的可接近性。,25,二、表观遗传学主要内容,（三）染色质重,塑,（,chromatin remodeling,）,染色质重塑方式主要包括两种：,一种是含有组蛋白化学修饰（乙酰化、甲基化及磷酸化等）；,另一种是依赖,ATP,水解释放能量解开组蛋白与,DNA,的结合，使转录得以进行,26,二、表观遗传学主要内容,（三）染色质重,塑,（,chromatin remodeling,）,（,A,）结合,（,B,）松链,（,C,）重塑,八聚体转移,八聚体滑动,+ ATP,重塑,复合物,ATP,依赖的染色质重构机制,27,二、表观遗传学主要内容,（四）,非编码,RNA,的调控,无论是,DNA,修饰还是组蛋白修饰，都是基因活性调节的中间参与者，而真正诱导基因活性改变者是功能性非编码,RNA,。,非编码,RNA,在调节基因表达、基因转录、调整染色质结构、表观遗传记忆、,RNA,选择性剪接以及蛋白质翻译中都发挥重要作用。,不仅如此，,RNA,在保护机体免受外来核酸的侵扰中也扮演着重要的角色，被认为是最古老的免疫体系。,28,二、表观遗传学主要内容,（四）,非编码,RNA,的调控,非编码,RNA,可依据大小分为,:,长链非编码,RNA:,在基因簇以至整个染色体水平发,挥顺式调节作用,甚至可以介导单条染色体的失活。,短链非编码,RNA,（,small interfering RNA,和,microRNA):,主要是在转录后水平对基因的表达进,行调控。,29,二、表观遗传学主要内容,（四）长链,非编码,RNA,的调控,X,染色体失活就是长链非编码,RNA,所介导的一个重要表观遗传学现象，可以说是表观遗传学中由,RNA,引导的,DNA,甲基化和组蛋白修饰共同参与的一个复杂的过程。,失活的,X,染色体是由自身的一个失活中心调控的,30,Xic,长约,1Mb,，包括,4,个已知基因：,Xist,、,Xce,、,Tsix,和,DXPas34,Xist,：,X,染色体失活特异性转录因子，是,X,染色体上启动转录最早的基因。,Xce,：在基因组中的组成与,X-,染色体随机失活中的选择有关，当,Xce,处于纯合状态时，体细胞中的,X-,失活是完全随机的，而杂合态时，失活不是完全随机的。,Tsix,：位于,Xist,下游的瞬时调控元件， 与,CTCF,可能协同起着,Xist,的外源开关功能。,DXPas34,：富含,CpG,，包括一个,15Kb,的微卫星重复序列，对,X-,失活有一定调控作用。,二、表观遗传学主要内容,（四）长链,非编码,RNA,的调控,31,二、表观遗传学主要内容,（四）长链,非编码,RNA,的调控,X,染色体失活过程：,Xic,失活基因编码出对应的,RNA,，这些,RNA,包裹在合成它的,X,染色体上，当达到某一水平后，在,DNA,甲基化和组蛋白修饰的参与下共同导致并维持,X,染色体的失活。,32,二、表观遗传学主要内容,（四）短链,非编码,RNA,的调控,主要是在转录后水平对基因的表达进行调控,又称为转录后基因沉默（,post-transcriptional gene silencing, PTGS,）。,siRNA,介导的,RNAi,；,miRNA,对靶,gene,的调控,33,二、表观遗传学主要内容,（四）短链,非编码,RNA,的调控,siRNA,介导的,RNAi,特点：,往往是外源性的，如病毒感染和,人工插入,dsRNA,之后诱导而产生；,siRNA,是双链,RNA,，,3,端有,2,个非配,对碱基；,与靶,mRNA,一般要求完全互补,siRNA,可作用于,mRNA,的任何部位,降解目标,mRNA,。,34,二、表观遗传学主要内容,（四）短链,非编码,RNA,的调控,microRNA,途径特点：,内源性基因编码，单链小分子,RNA,，长约,18-25nt,，,是生物体自身的一套正常的调控机制,，控制发育进程、细胞分化、凋亡、分裂以及器官的发育；,miRNA,主要作用于靶标基因,3-UTR,区，,当,miRNA,和靶基因,mRNA,的,3,-UTR,几乎完全配对时，导致靶基因,mRNA,降解；,miRNA,与靶基因不完全互补，导致靶基因,mRNA,翻译抑制。,35,二、表观遗传学主要内容,（四）短链,非编码,RNA,的调控,第一个,miRNA,是,Lee,等,在,1993,年在,秀丽新小杆线虫发现的,2010.11: 3172,2009: 2545,2008: 1759,2007: 1073,2006: 704,2005: 418,2004: 221,2003: 110,2002: 37,2001: 5,Pubmed,收录关于,miRNA,论文篇数,36,二、表观遗传学主要内容,（四）短链,非编码,RNA,的调控,miRBase,数据库显示，目前人类成熟,microRNA,约,904,条， 约,50%,左右的脊椎动物基因表达受,miRNA,的调控。,一个,miRNA,分子能调控多个靶基因，而一个靶基因又同时受到多个,miRNA,分子的协同调控；它们之间组成了错综复杂的调控网络，实现了对人体生命活动以及疾病发生发展和转归过程的精细调控。,。,37,表观遗传学渗入生命科学的各个领域,38,三、几种常用表观遗传学研究方法,甲基化特异性,PCR,（,Methylation Specific PCR,MSP,）,亚硫酸氢钠依赖的基因测序（,Bisulfite Genomic DNA Sequencing),凝胶迁移实验（,Electrophoretic Mobility Shift Assay,，,EMSA),染色质免疫沉淀分析（,Chromatin Immunoprecipitation, ChIP),39,三、几种常用表观遗传学研究方法,（一）甲基化特异性,PCR,（,MSP),该方法是由,Herman,等于,1996,年提出的一种检测甲基化的方,法。,将,DNA,先用重亚硫酸盐处理，使未甲基化的胞嘧啶转变为,尿嘧啶,而甲基化的不变,随后进行引物特异性的,PCR,。,40,MSP,方法的关键点是引物的设计，一般设计二对引物,:,甲基化特异引物,(M Primer):,是根据待测序列的,CpG,位点甲基化时，经亚硫酸盐修饰后的核苷酸序列设计的，该引物能扩增引物位点发生甲基化的序列；,非甲基化特异引物,(U Primer):,是根据待测序列的,CpG,位点无甲基化时，经亚硫酸盐修饰后的核苷酸序列设计的，,该引物能扩增引物位点未发生甲基化的序列。,三、几种常用表观遗传学研究方法,（一）甲基化特异性,PCR,（,MSP),41,三、几种常用表观遗传学研究方法,（一）甲基化特异性,PCR,（,MSP),MSP,引物设计常用两种软件：,Methyl Primer Express Software,（,ABI,公司）,MethPrimer (,在线软件）,:,引物通常是带有,CpG,序列越多，特异性就越好。,42,该方法只能作定性研究，不能作定量检测。引物的选择和设计、,重亚硫酸盐处理是否完全非常关键，,否则容易导致假阳性。,三、几种常用表观遗传学研究方法,（一）甲基化特异性,PCR,（,MSP),43,三、几种常用表观遗传学研究方法,（二）亚硫酸氢钠依赖的基因测序,该方法原理是,DNA,进行硫化处理后，亚硫酸盐能将,DNA,中,的,C,转变为,U,，而已经甲基化的,C,则不会发生这种变化，,用针对修饰后的序列设计引物进行扩增。,PCR,使用的引物（,BSP,）必须避开,CpG,二核昔酸序列，这样,才能保证该序列是否甲基化序列都能得到同等程度的扩,增。引物设计软件同,MSP,。,44,对,PCR,产物进行克隆测序（至少,8-10,个）分析，能,明确每个甲基化位点情况。,此方法是一种可靠性及精确度均很高的定量检测 方法，能明确目的片段中每一个,CpG,位点的甲基化状态，但需要大量的克隆测序,操作过程繁琐且费用昂贵。,三、几种常用表观遗传学研究方法,（二）亚硫酸氢钠依赖的基因测序,45,三、几种常用表观遗传学研究方法,（三）凝胶迁移实验（,EMSA,）,一种研究,DNA,结合蛋白和其相关的,DNA,结合序列相互作用的,技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究,DNA,结合蛋白，目前已用于研究,RNA,结合蛋白和特定的,RNA,序列的相互作用。,这项技术是基于,DNA/,蛋白质或,RNA/,蛋白质复合体在聚丙烯,酰胺凝胶电泳（,PAGE,）中有不同迁移率的原理。当核转,录因子与一条人工合成的特异的,DNA,或,RNA,结合后，其在,PAGE,中的迁移率将小于未结合核蛋白转录因子的,DNA,，从,而检测到活化的与,DNA,或,RNA,结合的蛋白转录或调节因子。,46,三、几种常用表观遗传学研究方法,（三）凝胶迁移实验（,EMSA,）,凝胶迁移实验基本原理图,标记了的,DNA,由于与同一种蛋白结合，于是在凝胶电泳中移动速度变慢，放射显影中呈滞后的条带。如果加入该蛋白的抗体后，其移动速度更慢，形成更滞后的条带。,47,三、几种常用表观遗传学研究方法,（三）凝胶迁移实验（,EMSA,）,EMSA,基本五个反应体系,48,三、几种常用表观遗传学研究方法,（三）凝胶迁移实验（,EMSA,）,成功,EMSA,试验,:,把握整体,注意细节,!,EMSA,试验关键因素：,1.,试验设计：,主要是你用药品刺激细胞时,设计的药品浓度和时间梯度的问题。,2.,核蛋白样品的制备：,注意使制备的核蛋白保持蛋白原有的天然活性和构像；掌握好核,蛋白的浓度和纯度,否则影响结合反应拿不到结果。,3.,探针的制备,:,生物素标记,3,端和,5,端两端都标记,这样才能更好的提高灵敏度。,49,4.,制胶：,必须是非变性,PAGE,凝胶,一般用,6.5%,的非变性胶,.,制胶,很重要,直接影响电泳的效果,!,一般控制在,5,分钟凝固的,效果。,5.,结合反应条件要合适：,离子浓度，,PH,值等,6.,预电泳和电泳：,0.25X TBE,在冰上,120V,预电泳,1,小时,;,务必换掉预电泳,的缓冲液,用新的,0.25X TBE,低温下,150V,，电泳约,60,分钟。,电转运,:,在,0.5X TBE,中,390mA,电转移,40,分钟,注意转运膜的选择。,三、几种常用表观遗传学研究方法,（三）凝胶迁移实验（,EMSA,）,50,8.,紫外交联,:,正规的应该是交联仪的使用,但是很多单位没有交联仪,那紫外,就用无菌操作台上的紫外灯下,10cm,处交联,10,分钟就可以了,9.,化学发光反应,:,没有太多的细节,只是注意两点,一是期间结合膜的表面一定不能干燥,!,二是,Streptavidin-HRP,不能加在膜上,而是加在液体中混匀后在将膜放在液体中孵浴,.,10.,化学发光图像显示,:,两种方法,:,化学发光数字成像与检测和感光胶片冲印成像操作基本和,Western,试验操作相当,只是这个膜是一次性的,不能重复使用。,三、几种常用表观遗传学研究方法,（三）凝胶迁移实验（,EMSA,）,51,三、几种常用表观遗传学研究方法,（四）染色质免疫沉淀分析（,ChIP,）,是基于体内分析发展起来的方法，也称结合位点分析,法，在过去十年已经成为表观遗传信息研究的主要方法。,通过该方法可获得蛋白质与,DNA,在体内相互作用的信,息，它能真实、完整地反映结合在,DNA,序列上的调控蛋,白，是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特,定基因组区域结合的蛋白质的一种很好的方法。,CHIP,不仅,可以检测体内反式因子与,DNA,的动态作用，还可以用来研,究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。,52,三、几种常用表观遗传学研究方法,（四）染色质免疫沉淀分析（,ChIP,）,ChIP,基本原理图,是在活细胞状态下固定蛋白质,DNA,复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的,DNA,片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与,DNA,相互作用的信息。,53,三、几种常用表观遗传学研究方法,（四）染色质免疫沉淀分析（,ChIP,）,第一步：用甲醛在体内将,DNA,结合蛋白与,DNA,交联。,第二步：分离染色体（质），剪切成,DNA,小片段与结合蛋白结合。,第三步：用特异性抗体与,DAN,结合蛋白结合，用沉淀法分离复合体,反向交联操作释放出,DNA,，并消化蛋白质。,第四步：用,PCR,扩增特异,DNA,序列，以确定是否与抗体共沉淀。,ChIP,基本步骤,54,三、几种常用表观遗传学研究方法,（四）染色质免疫沉淀分析（,ChIP,）,CHIP,与其他方法的结合,CHIP-on-chip,：是,CHIP,与基因芯片相结合建立的方法，将,ChIP,富集得,到的,DNA-,片段与芯片杂交,，已广泛用于特定反式因子靶,基因的高通量筛选。,CHIP-sequencing,：是,CHIP,与目前高通量测序技术的结合的方法，将,ChIP,异性地富集目的,DNA,片段进行纯化与文库构建；,然后进行高通量测序。将获得的数百万条序列标签精,确定位到基因组上，从而获得全基因组范围内与组蛋,白、转录因子等互作的,DNA,区段信息。,55,RNA-CHIP,：用于研究,RNA,在基因表达调控中的作用，具体,方法和,ChIP,差不多，只是实验过程中要注意,防止,RNase,，最后分析的时候需要先将,RNA,逆,转录成为,cDNA,。,三、几种常用表观遗传学研究方法,（四）染色质免疫沉淀分析（,ChIP,）,CHIP,与其他方法的结合,56,