抗抑郁药(r)托莫西汀中间体(s)3氯1苯丙醇的生物合成

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,抗抑郁药,(,R,),-,托莫西汀中间体,(,S,)-3-,氯,-1-,苯丙醇的生物合成,1,研究背景,论文创新点,实验结果,主要结论与建议,1,2,3,4,2,研究背景,生物法制备手性药物中间体具有反应条件温和、选择性好的优点。而且使用微生物全细胞作为催化剂还可省去酶纯化与辅酶添加费用。,因此，利用生物法进行,(,S,),-,3-,氯,-1-,苯丙醇的制备，具有重要的现实意义。,3,研究背景,目前对于,(,S,),-,3-,氯,-1-,苯丙醇的制备多采用化学法不对称还原或生物化学方法拆分外消旋醇；对于生物法不对称还原前手性酮制备手性醇研究较少。,当前生物法制备手性醇最佳成果为：植物细胞作为催化剂还原,3-,氯,-1-,苯丙酮，,20 mmol/L,底物浓度下，反应,48 h,，产率达到,78%,，,e.e.,达到,98%,。,4,论文创新点,1,、筛选出一株催化性能优异的酵母，与其它相关研究进行比较，本研究可以在实现同等对映体过量率的情况下，得到更高的时空产率；,2,、在水,/,有机溶剂体系和含离子液体的水,/,有机溶剂体系中不对称还原得到,(,S,)-3-,氯,-1-,苯丙醇，未见报道；,3,、研究了单一水相体系和两相体系不同条件对还原过程中细胞膜流动性、完整性等的影响，初步探索了细胞生物学特性与不对称还原反应的关系。,5,实验结果与讨论,1,、菌株的筛选与鉴定,2,、单一水相体系中的不对称还原,3,、水,/,有机溶剂两相体系中的不对称还原,6,1,、菌株的筛选与鉴定,菌株的筛选,菌株,产率,(%),e.e.,(,%,),优势产物,汉逊德巴利酵母,14.82,53.31,S,Sigma,面包酵母,49.27,90.09,S,毕赤酵母,NA,NA,-,酵母,FU5,72.43,96.22,S,高活性干酵母,70.85,94.12,S,酿酒高活性干酵母,30.29,85.31,S,表,1,不对称还原酵母菌株的筛选,由表,1,可知，同等条件下，酵母,FU5,菌株对底物,3-,氯,-1-,苯丙酮具有最佳的还原产率和对映体过量率。因此，选择其做为后续实验菌株。,7,1,、菌株的筛选与鉴定,菌株鉴定,采用,ITS,全长序列分析对菌株进行鉴定。,图,1,酵母基因组电泳图,图,2,酵母,ITS,序列电泳图,8,1,、菌株的筛选与鉴定,构建系统进化树,进化树的构建以刚果锥虫（,Trypanosoma congolense,）,ITS,序列作为外类群，以担子,酵母（,Basidiomycete yeast,）,ITS,序列作为参照，使用,NJ,算法，并对进化树进行,1000,次可信度检验。,图,3,基于,ITS,序列和,Neighbor-Joining,算法构建的系统发育树,9,2,、单一水相体系中的不对称还原,表,2,有氧无氧条件对不对称还原的影响,图,4,底物浓度对不对称还原的影响,10,2,、单一水相体系中的不对称还原,图,5,细胞浓度对不对称还原的影响,图,6,不对称还原的时间进程,产率维持恒定的原因：（,1,）反应达到平衡；（,2,）体系中细胞死亡，反应不再进行；（,3,）底物或产物的毒性导致细胞失去催化能力；（,4,）体系中存在产物抑制。,100,11,2,、单一水相体系中的不对称还原,C,产物,OD,260,OD,280,R,Glc,Viability,空白,0.501,0.223,100.0,100.0,3,0.512,0.295,95.4,97.6,6,0.583,0.325,91.6,93.4,9,0.622,0.336,78.9,82.1,12,0.705,0.328,52.0,65.5,15,0.790,0.392,23.3,38.7,在反应体系中加入产物对可能存在的产物毒性进行考察。,图,7,不同浓度的产物对还原的影响,表,3,不同浓度的产物对酵母的影响,说明体系中存在产物毒性。,12,2,、单一水相体系中的不对称还原,在体系中加入环糊精、表面活性剂等添加物降低体系中的产物浓度，并考察加入这些物质对反应的影响。,图,8,不同浓度的环糊精对还原的影响,图,9,不同浓度的表面活性剂对还原的影响,13,2,、单一水相体系中的不对称还原,图,10,不同浓度的表面活性剂对酵母细胞的影响,Circle: CTAB Square: SDS Triangle:Tween 80,Open shape: OD260 Solid shape: OD280,14,3,、水,/,有机溶剂两相体系中的不对称还原,Organic solvent,log,P,Yield (%),e.e.,(%),1-DMF,-1.0,2.15,89.44,2-,乙酸乙酯,0.68,0.25,99.00,3-,甲苯,2.5,0.83,82.20,4-,正己烷,3.5,55.45,96.68,5-,正辛烷,4.5,46.83,95.01,6-DBP,5.4,6.94,84.66,7-,正十二烷,6.6,37.41,92.62,表,4,两相体系有机溶剂的选择,图,11,两相体系有机溶剂的选择,15,3,、水,/,有机溶剂两相体系中的不对称还原,图,12,两相体系底物浓度对还原的影响,图,13,两相体系相体积比对还原的影响,1.5,16,3,、水,/,有机溶剂两相体系中的不对称还原,单一水相体系和两相体系的细胞膜流动性研究（荧光分光光度计测定细胞荧光各向异性）：,Ex 358 nm,，,Em 430 nm,，,DPH,标记时间：,60min,。,Entry,r,A:Control,0.216,B:Control+1.5 mL,正已烷,0.140,C: Control+20 mmol/L,底物,+1.5 mL,正已烷,0.194,D :Control+20 mmol/L,底物,+1.5 mL,正已烷,0.236,表,5,不同条件处理酵母细胞的荧光各向异性,Control:10mL Tris-HCl,缓冲液,(50 mmol/L,，,pH 8.0),100 g/L,酵母湿菌体,30 g/L,葡萄糖。,四种体系均在,32 ,，,150 r/min,下处理,20 h,。,17,3,、水,/,有机溶剂两相体系中的不对称还原,PI,对酵母细胞染色，流式细胞仪检测显强荧光和弱荧光的酵母个数，衡量酵母细胞膜完整性。,如膜流动性研究中四种方式处理酵母处于强荧光区的酵母细胞占细胞数量比值都极低，其原因在于此种酵母细胞膜完整性难以被破坏，四种处理方式可能对酵母细胞膜完整性影响较小。,图,14,酵母细胞流式图,18,3,、水,/,有机溶剂两相体系中的不对称还原,图,15,两相体系中底物的分配,图,16,不同体系水相中的产物浓度,19,3,、水,/,有机溶剂两相体系中的不对称还原,辅助底物,Yield (%),e.e.,(%),甲醇,24.03,98.34,乙醇,21.93,98.41,丙三醇,33.96,97.21,异丙醇,17.68,97.98,正丁醇,1.14,100.00,葡萄糖,62.03,98.00,图,17,不同细胞浓度对还原的影响,表,6,两相体系辅助底物的选择,图,18,不同葡萄糖浓度对还原的影响,20,3,、水,/,有机溶剂两相体系中的不对称还原,图,20,不同,pH,对还原的影响,图,19,不同反应温度对还原的影响,21,3,、水,/,有机溶剂两相体系中的不对称还原,图,21,不同缓冲液浓度对还原的影响,Buffer,Yield(%),e.e.,(%),Control,49.02,97.52,Tris-,盐酸,82.01,98.12,Tris-,乙酸,78.94,98.27,Tris-,硼酸,77.30,98.01,Tris-,磷酸,81.82,98.10,Tris-,甘氨酸,80.90,98.29,表,7,缓冲体系的选择,22,3,、水,/,有机溶剂两相体系中的不对称还原,图,22,不同振摇速度对还原的影响,23,3,、水,/,有机溶剂两相体系中的不对称还原,图,23,两相体系不对称还原的时间进程,在水,/,正己烷两相体系中，酵母细胞的催化活性保持时间较长；但相比与单一水相体系，即使在较高的底物浓度下，两相体系中的催化速率仍较低。,底物浓度,15 mmol/L,底物浓度,20 mmol/L,24,3,、水,/,有机溶剂两相体系中的不对称还原,水,/,正己烷两相体系中加入离子液体对反应的影响,加入不同种类的离子液体对酶的立体选择性影响较小。但离子液体会对还原产率产生不利影响。,25,主要结论,1,、筛选到一株对,3-,氯,-1-,苯丙酮具有良好的不对称还原能力的酵母,FU-5,，初步鉴定为酿酒酵母。,2,、在单一水相体系中，当底物浓度为,15 mmol/L,，反应,20 h,后，产率达到,65%,，,e.e.,达到,98%,。研究显示，体系中不存在底物抑制与产物抑制，但产物毒性限制了产率的提高。,3,、在水相体系中，适当浓度的添加物（,Tween 80,和,-,环糊精）可提高产率：当反应体系中,Tween 80,浓度为,2.0 mmol/L,，,-,环糊精浓度为,5.0 mmol/L,时，产率从对照组的,64.7%,分别提高到,73.8%,和,70.6%,。说明同时具有包结作用和改善细胞膜渗透性的,Tween-80,提高产物得率的效果优于仅具有包结作用的,-,环糊精。但对于产物,e.e.,值而言，两种包结物对其基本无影响。,26,主要结论,4,、在水,/,正己烷两相体系中，经过条件优化，当底物浓度为,20 mmol/L,时，产率和,e.e.,值可分别达到,84%,和,98%,。相比于单一水相体系，两相体系可使底物浓度和产率得到大幅提高。,5,、不同的反应体系对酵母细胞膜完整性影响较小，但会影响细胞膜的流动性。,6,、所考察的,9,种离子液体对酵母细胞中酶的立体选择性影响较小，但产率均有所下降。,27,