微生物技术应用

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,环境生物学技术,(3),目 录,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,微生物技术在环境领域中的新应用,Application of microbial technology in environments,1,主要内容,固定化微生物技术,微生物制剂,微生物细胞外多聚物,2,一,、固定化酶与固定化微生物,Immobilization enzyme and microbes,3,酶的化学本质,酶,(Enzyme),是由活细胞产生的，以蛋白质为主要成分，具有高效率、高特异性的生物催化剂,(catalysts),，,具有许多与蛋白质相同的物理化学性质。,1.,两性离子的性质：,氨基酸,2.,酶具有胶体性质：,大分子,3.,热稳定性较差：,次级键,4.,可溶解性：,亲疏水性,5.,酶的变性：,次级键,4,酶催化反应的特性,1,、高效性,highly activity,2,、专一性,specficity,3,、条件温和,mild conditions,4,、不稳定性,unsteadiness,5,、可调控性,regulation,6,、辅因子作用,cofactor,5,酶催化反应的缺陷,作为活性蛋白，其稳定性易受温度、,pH,、无机离子的影响；,一般在水溶液中反应，不利于酶回收；,酶与反应物及产物混合，不利于产物进一步提纯。,6,改进措施,固定化酶,固定化酶和固定化细胞是利用物理及化学的处理方法，将水溶性酶或细胞与固体的水不溶性支持物（或称载体）相结合，使其既不溶于水，又能保持酶和微生物的活性。,它们在固相状态下增加了机械强度，稳定性提高，可回收反复使用，并在贮存较长时间后依然保持酶和微生物的活性不变。,7,1953,年，,Grubhofev,和,Schleith,首先开始了,酶固定化研究，并第一次实现了酶的固定化。,1960,年,，日本的千畑一郎开始了,氨基酰化酶固,定化研究,，开始了将固定酶应用在工业上的第,一步。,1969,年,，千畑一郎成功地将氨基酰化酶反应用,于,DL-AA,的光学分析,，实现了酶连续反应的工业,化。这是世界上,固定化酶用于工业的开端,。,1973,年,，千畑一郎再次在工业上成功地固定化,大肠杆菌细胞,，成功实现了,L-,天冬氨酸连续生,产。,8,酶的固定化,通过某些物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失（即运动受到限制）而又能发挥高效催化作用的酶制剂，这一过程称为酶的固定化。,固定化所采用的酶，可以是纯化的酶，也可以是结合在菌体（死细胞）或细胞碎片上的酶或酶系。,9,酶的分离纯化,10,酶的来源,尽管可以从几乎所有生物体提取到活性酶，但目前产业化的固定化酶主要来源于微生物，其中真菌约,50%,，细菌约,1/3,，动物约,8%,，植物约,4%,。,一方面是因为微生物酶更廉价，更容易扩增并定量；同时也因为动植物组织可能含有潜在的有害成分。,11,Enzyme EC,Sources,Application,a,-Amylase,3.2.1.1,Aspergillus,E,Baking,Catalase,1.11.1.6,Aspergillus,I,Food,Cellulase,3.2.1.4,Trichoderma,E,Waste,Dextranase,3.2.1.11,Penicillium,E,Food,Glucose oxidase,1.1.3.4,Aspergillus,I,Food,Lactase,3.2.1.23,Aspergillus,E,Dairy,Lipase,3.1.1.3,Rhizopus,E,Food,Rennet,3.4.23.6,Mucor miehei,E,Cheese,Pectinase,3.2.1.15,Aspergillus,E,Drinks,Protease,3.4.23.6,Aspergillus,E,Baking,E: extracellular enzyme; I: intracellular enzyme,Fungal Enzymes,12,Enzyme,Sources,Application,a,-Amylase,3.2.1.1,Bacillus,E,Starch,b,-Amylase,3.2.1.2,Bacillus,E,Starch,Asparaginase,3.5.1.1,Escherichia coli,I,Health,Glucose isomerase,5.3.1.5,Bacillus,I,Fructose syrup,Penicillin amidase,3.5.1.11,Bacillus,I,Pharmaceutical,Protease,3.4.21.14,Bacillus,E,Detergent,Bacterial Enzymes,E: extracellular enzyme; I: intracellular enzyme,13,酶的固定化方法,吸附法,：,通过,氢键、疏水作用和,电子亲和力,等物理作用，将酶固定于水不溶多孔载体上,包埋法,：将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合助进剂,(,包括交联剂,),的作用进行,聚合,，酶被,包埋,在聚合物；,结合法,：选择适宜的载体，使之通过,共价键或离子键与酶蛋白侧链基团结合,而制成固定化酶；,交联法,：借助双功能试剂使,酶分子之间或酶与载体间,发生交联作用而制成固定化酶；,热处理法,：将含酶细胞在一定的温度下加热一段时间，使,酶固定在菌体,内。,14,固定化方法,酶和细胞固定化方法,载体结合法 交联法 包埋法,网格型 微囊型,物理吸附法 离子结合法 共价结合法 热处理（细胞）,15,吸附法（,adsorption,）,常用有机载体,纤维素、骨胶原、火棉胶及面筋、蔗渣等,常用无机载体,氧化铝、硅藻土、沸石、高岭土、多孔玻璃、硅胶等,16,影响吸附法固定酶稳定性的因素,介质中离子强度 盐析,pH,电荷,温度 热运动,蛋白质浓度 交换,载体的性质 表面特性,17,吸附法的特点,吸附法的优点：,操作简单，可供选择的载体类型多，吸附过程可同时达到纯化和固化的目的，所得到的固定化酶使用失活后可以重新活化和再生。,吸附法的缺点：,酶和载体的结合力不强，易脱落，会导致催化活力的丧失和沾污反应产物。,世界第一例获得工业应用的固定化酶是,DEAE-Sephadex A-25,吸附的,氨基酰化酶,反应用于,DL-AA,的光学分析。,18,包埋法,(entrapment),凝胶包埋法,将酶分子包埋在凝胶格子中,聚合包埋 聚丙烯酰胺,络合包埋 胶原、海藻酸钠,凝结包埋 明胶、卡拉胶、淀粉、,微囊法,包埋于半透性聚合物膜的微囊内,界面沉淀 高聚物在水和有机相界面上溶解度较低,界面聚合,液体干燥法,脂质体包埋,19,包埋法的特点,包埋法操作简单，由于酶分子只被包埋，未受到化学反应，可以制得较高活力的固定化酶对大多数酶、粗酶制剂甚至完整的微生物细胞都是适用的。,但是，只有小分子底物和产物可以通过凝胶网络，而对大分子底物不适宜。同时，凝胶网络对物质扩散的阻力导致固定化酶动力学行为的变化、活力降低。,20,共价结合法,(Covalent),理论上酶蛋白上可供载体结合的功能基团有：,酶蛋白,N-,端的,M-,氨基或赖氨酸残基的,-,氨基；,酶蛋白,C-,端的羧基以及,Asp,残基的,-,羧基和,Glu,残基,-,羧基；,Cys,残基的巯基；,Ser,、,Tyr,、,Thr,残基的羟基；,Phe,和,Tyr,残基的苯环；,His,残基的咪唑基；,Trp,残基的吲哚基。,最普遍的基团是：,氨基,、,羧基,以及,苯环,，且被偶联的基团应是酶活性的,非必需基团,21,共价结合的影响因素,载体,的物化性质要求,载体,亲水,，并且有一定的,机械强度,和,稳定性,，同时具备在温和条件下与酶结合的,功能基团,；,偶联反应的,反应条件,必须在,温和,pH,、,中等离子强度,和,低温,的缓冲溶液中；,所选择的偶联反应要尽量考虑到对酶的其它功能基团,副反应尽可能少,；,要考虑到酶固定化后的,构型,，尽量减少载体的,空间位阻,对酶活力的影响。,22,共价载体的选择,一般而言，亲水载体在蛋白质结合量和固定化酶活力及其稳定性上都优于疏水载体；,载体结构疏松，表面积大，有一定的机械强度；,载体必须有在温和条件与酶共价结合的功能基团；,载体没有或很少有非专一性吸附；,载体来源广泛，廉价并能反复使用。,23,共价偶联法的优缺点,共价偶联法的优点,：得到的固定化酶结合牢固、稳定性好、利于连续使用,共价偶联法的缺点,：载体活化的操作复杂，反应条件激烈，需要严格控制条件才可以获得较高活力的固定化酶。同时共价结合会影响到酶的空间构象，从而对酶的催化活性产生影响。,24,形成共价结合的偶联类型,重氮法,是将带芳香族氨基的载体，先用,NaNO,2,和稀盐酸酸处理成重氮盐衍生物，再在中性偏碱,(pH8-9),条件下与酶蛋白发生偶联反应，得到固定化酶。,卤代烃烷基化反应,具有卤素取代的芳香环或含有卤素取代的杂环的高聚物以及含有卤乙酰基的高聚物，可以通过烷基化、芳香基化，在碱性条件下，与酶分子上的氨基、酚基、巯基等反应。,25,重氮法,-1,多糖类的芳香族氨基衍生物 在碱性条件下用对,-,-,硫酸脂乙砜基胺多糖，制得的醚键连接的乙砜基苯胺衍生物，经重氮化后偶联酶；,26,重氮法,-2,氨基酸共聚体 共聚物与亚硝酸作用转变为重氮盐，可供酶固定用。蛋白酶、脲酶、核糖核酸酶等,27,重氮法,-3,聚丙烯酰胺衍生物,EnzacryIAA,是含有芳香氨基的聚丙烯酰胺衍生物，经重氮化可固定酶；氨基酰化酶，淀粉酶等。,28,重氮法,-4,苯乙酰树脂 聚氨基苯乙烯,(a),和一种异丁烯一间一氨基苯乙烯,(b),的共聚物，通过重氮化后可固定酶；胃蛋白酶、核糖核酸酶等。,29,重氮法,-5,带有羧基或羟基、羧甲基等的载体，首先在酸性条件下用甲醇处理使之酯化，再用水合肼处理形成酰肼，最后在,HNO3,作用下转变成叠氮衍生物。,30,重氮法,-6,多孔玻璃的氨基硅烷衍生物 多孔玻璃在丙酮中与,Y,氨基丙基三氧乙烷硅回流加热，生成烷基胺玻璃；用对硝基苯酚氯处理后，再还原，转变为芳香基衍生物；此芳香基衍生物经重氮化后与酶结合，产生固定化酶。,31,卤代烃烷基化,-1,将纤维素在二恶烷,(Diaxanc)-,溴乙酸中与嗅乙酰溴反应，形成溴乙酰纤维素，可供胰蛋白酶、糜蛋白酶和核糖核酸酶之固定化；,常用载休有卤乙酰、卤异丁烯衍生物，如氯乙酰纤维素、溴乙酰纤维索、碘乙酰纤维素等。,32,卤代烃烷基化,-2,纤维素等载体在碱性条件下和均三氯三嗪等反应，引入活泼的卤素基后，能与酶的氨基、酚羟基、巯基反应，产生固定化酶,与纤维素共价结合的另一类芳香烃化功能基是,3-F-4,6-,二硝基苯。控制,pH,7,，使它与酶分子的氨基反应，产生固定化酶。,33,卤代烃烷基化,-3,四元缩合反应 利用四元化合物,(,羧酸、胺、醛和异氰酸,),发生缩合反应，形成,N,取代的酰胺；羧酸,(R1),和胺化合物,(R2),形成酰胺键，醛,(R3),和异氰酸,(R4),结合形成酰胺氮的侧链。,当选择适当条件，适当的载体及控制反应液中的添加物，可以使连接键或通过酶的氨基或通过羧基，将酶固定并免除有害反应。,34,卤代烃烷基化,-4,巯基,-,二硫基交换反应 带有,-SH,或二硫基的载体，通过巯基,-,二硫基的交换反应，和酶分子上非必需巯基偶联。若载体的功能基团为,-SH,时，可先用,2,2,-,二吡啶二硫化物处理，生成的二硫基中间产物在酸性条件下能与酶分子的巯基发生交换反应，从而产生固定化酶。,35,卤代烃烷基化,-5,金属偶联法 利用某些过渡金属盐溶液将载体,(,纤维素、尼龙、硼硅玻璃、滤纸及酵母细胞等,),浸泡,24h,，洗除末反应的金属盐后，制得的活化载体放入酶溶液中，即可将酶固定化。,36,芳香烃化,-6,溴化氰,-,亚胺碳酸基反应 含有羟基的载体,(,如纤维素、葡聚糖、琼脂等,),在碱性条件下，载体的羟基与,CNBr,反应，生成活泼的亚胺碳酸基，在弱碱条件下，可与酶分子的氨基偶联固定。,37,芳香烃化,-7,酰氯化反应 含羧基载体如羧基树脂,(Amberlite IRC-50,等,),，可用氯化亚砜处理，生成酰氯衍生物，与酶分子的氨基偶联，产生固定化酶。,38,缩合法,缩合反应 一些带羧基或氨基的载体用羰二亚胺活化后，与酶分子的氨基或羧基直接偶联，形成肽键，产生固定化酶。,39,芳香氨异硫氰反应,含有芳香氨基的载体，在碱性,PH,条件下，与光气或硫芥子气反应生成异硫氰酸或异琉氰酸衍生物，可在温和条件下与酶分子的氨基连接，产生固定化酶。,40,酸酐反应,乙烯或苯乙烯、甲代乙烯基与顺丁烯二酸酐的共聚物，在己二胺作用下，酸酐与酶蛋白的氨基起偶联反应，产生固定化酶。,41,活化酯法,含羧基的共聚物载体在二环己基碳二亚胺,(DDC),存在下用,N,羟基琥珀酰亚胺活化，产生活化酯，再在温和条件下连接酶。,42,含醛基高聚物,多糖类如淀粉、葡聚糖、纤维素等用高碘酸或二甲基砜氧化裂解葡萄糖环，形成含醛基,(,每一葡萄糖产生两个醛基,),高聚物，可与酶蛋白氨基反应，产生固定化酶。,43,交联法,基本原理是,酶分子和多功能试剂之间,形成共价键得到三维的交联网状结构；,交联法是利用,双功能或多功能试剂,在,酶分子间、酶分子与惰性蛋白间或酶分子与载体,间进行交联反应，把酶蛋白分子彼此交叉连接起来，形成网络结构的固定化酶。,常用的交联试剂是,戊二醛,和,双耦联苯胺,-2,2,-,二磺酸，,常与,吸附法,或,包埋法,配合使用,44,交联法的类型,交联酶法,在一定条件下，加入一定量的戊二醛溶液于酶溶液中，生成不溶性固定化酶；,酶与辅助蛋白交联法,用双功能或多功能试剂使惰性蛋白与酶共交联；,吸附交联法,将酶吸附载体上，再用戊二醛等双功能试剂交联；,载体交联法,用多或双功能试剂的一部分功能基团与载体交联，另一部分功能基团与酶蛋白交联而制备固定化酶的方法；,45,交联法的优缺点,用交联法制备的固定化酶结合牢固，可长时使用。,但由于交联反应较激烈，酶分子的多个基团被交联，酶活力损失较大；且交联剂的成本较高，实际使用时，往往与其他固定化方法联用，如将酶先经凝胶包埋后，再经交联等。,46,固定化酶制备方法的特点,物理吸附,包埋法,共价结合法,共价交联法,制备,易,易,难,难,结合力,弱,强,强,强,酶活力,高,高,中,中,底物专一性,无变化,无变化,有变化,有变化,再生,可能,不可能,不可能,不可能,固定化费用,低,中,高,中,47,固定化方法与载体的选择,1.,必须注意维持酶的催化活性和专一性,2.,酶与载体结合牢固,3.,载体的机械强度,4.,固定化酶要有最小的空间位阻,5.,载体稳定，不可与底物、产物发生反应,6.,固定化酶要廉价,48,固定化酶的特点,具有生物催化剂的功能，又有固相催化剂的功能。,可重复使用,酶底物产物易分开,反应条件易控制,酶的利用效率高,比水溶性酶更适合于多酶反应,49,固定化酶的酶活力,多数固定化酶活性均有所下降，原因主要有,：,酶分子在固定化过程中，酶的空间构像发生了变化，甚至活性中心的氨基酸也会参加反应；,固定化后的空间障碍效应的影响；,内扩散阻力的影响使底物分子与活性中心的接近受阻；,包埋法时被高分子物质半透膜包围。,50,酶固定化效果的测定,固定化酶活力测定基本上与溶液酶相似，即每毫克干重固定化酶每分钟转化,1umol,底物量或形成,1umol,产物的酶量为一个单位,(umol/mgmin),，对于酶管、酶膜、酶板等，则以单位面积（,cm,2,）的初速度来表示。,51,由于在固定化中酶往往会有些失活，因此，测定残留活力还不能正确反映与载体结合的酶活力，所以，仍以测定蛋白量较为难确。在酶固定化操作中，当酶与载体结合后，用适量适当的缓冲液淋洗固定化酶，以洗除未固定的酶，收集洗脱液，并测定其中蛋白量,(,或酶活力,),，即为残留的蛋白量,(,或酶活力,),。,固定化效率,52,固定化酶的稳定性,多数酶的稳定性在固定化后都有所提高，延长了有效寿命，这是由于：,第一，固定化增加了酶构象的牢固程度；,第二、挡住了不利因素对酶的侵袭；,第三，限制了酶分子间的相互作用；但是，如果固定化触及到酶活性敏感区域，也可能导致酶稳定性下降。,53,固定化酶（细胞）热稳定性变化,54,固定化酶（细胞）对有机试剂（乙醇）稳定性变化,55,固定化酶（细胞）对酶抑制剂（尿素）的稳定性变化,56,固定化酶（细胞）对,pH,稳定性变化,57,pH-,酶活力关系,反应的最适,pH,和酶活力,pH,曲线的变动依据酶蛋白和载体的电荷而定。带,负电荷,的载体，往往导致固定化酶的,最适,pH,向碱性,方向移动；带正电荷的载体则相反。,尽管大多数固定化酶的活力,pH,关系曲线仍为钟形曲线，但与溶液酶比较，其,钟形更陡,，或更坦，向酸性或碱性方向偏移。,58,对蛋白酶的抵抗力提高氨基酰化酶在胰蛋白酶作用下活力仅存,20,，而将其固定于,DEAE,纤维素上在同样条件下仍有,80,的活力。这可能是因为蛋白酶分子量大，受到空间位阻，不能进入固定化酶中；,对变性剂、抑制剂的抵抗能力提高氨基酰化酶与固定于,DEAE,Sephadex,的氨基酰化酶比较，前者在,6mol,、,2mol,胍、,1,SDS,和,4mmol,丙酮溶液中活力分别为,9,、,49,、,1,和,55,，而后者在相应溶液中活力则分别为,146,、,117,、,35,和,138,。,59,固定化酶在操作中可以长期使用，半衰期,(t,1/2,),，即酶活性达到原有酶活性一半时所需的时间,),较长。半衰期可按下式计算：,式中,ED,为反应,t,时的酶浓度，,E,为原有酶浓度。,操作稳定性,60,部分固定化酶的半衰期,61,固定化酶的反应器类型,62,Batch Stirred tank reactor,BSTR,结构简单，不需要特殊设备，适于小规模实验。一般应用溶液酶或粗酶制剂催化，酶不回收，待反应转化至一定程度后，通过加热或其他方法直接使之失效除去。但在反复过滤或离心回收过程中，易造成酶的失效损失。工业上很少用,.,63,Continuous Stirred tank reactor,CSTR,催化剂采用颗粒状的固定化酶，少数应用片状固定化酶。运转过程中要不断分出部分反应液，同时补充等量的新鲜底物溶液，为不致使酶随反应液流失，所以在它的出口处通常有滤膜。用于有底物抑制场合。,64,Plug Flow reactor,PFR,填充床内用颗粒状或片状固定化酶填充，运转时，底物按一定方向以恒定速度通过反应床，,沿流动方向底物及产物的浓度逐渐变化，但同一横切面上浓度一致,。使用最普遍。,固定化酶堆积密度大，但,床内压降大，固定化酶清洗更换麻烦。,65,Fluidized bed reactor,FBR,底物溶液以足够大的流速向上通过固定化酶床层，使固体颗粒处于流化状态。混合程度高，故传热、传质情况良好。可用于处理粘性强和含有固体颗粒的底物，或用于需要供应气体或排放气体的反应。,传质效果好，不容易堵塞；但需要保持较高的流速，动力消耗大，且固定化酶浓度低，颗粒处于流态化，易损耗。,66,CSTR/Ultrfitration reactor,CSTR/UFR,由连续流搅拌桶式反应器和超滤装置组合而成，为小分子量产物与高分子底物的分离、底物较彻底的转化以及溶液酶或固定化酶的反复使用提供了可能。但酶易因循环超滤而失效损失。,67,Recycle reactor,RCR,把部分流出物与加料流混合，然后再令其进入反应器。特点是可以提高液体的流速和减少底物向固定化酶表面传递的阻力。,68,固定化酶反应器的选择,根据固定化酶的形状来选择,根据底物的物理性质来选择,根据反应的动力学特性来选择,根据外界环境对酶稳定性的影响选择,根据操作要求及反应器费用来选择,69,固定化酶的形状,一般言之，颗粒状或片状固定化酶对,连续流搅拌桶式反应器,和,填充式反应器,类型的反应器均可适用。但膜状和纤维状的固定化酶则不适于,连续流搅拌桶式反应器,，而适用于,填充式反应器,。,若固定化酶易变形、易粘结或颗粒细小时，那么在填充于,填充式反应器,后，往往会引起高的压力降和堵塞床层，并且在大规模生产中无法实现高的流率。此时宜采用流动床反应器。,70,底物的物理性质,底物分三种情况：溶解性物质、颗粒物质与胶状物质。溶解性底物显然对任何类型反应器均不会造成困难。,颗粒状和胶状底物则往往会导致床层堵塞，对此可用循环反应器或流动床反应器。,连续流搅拌桶式反应器,只要搅拌速度足够高，能维持底物和固定化酶良好的悬浮状态，也可用于颗粒状底物。但高的搅拌速度会导致固定化酶从载体上被剪切下来，所以转速不能太高。,71,酶反应动力学特性,一般而言，填充床反应器在固定化酶反应器中占有主导地位，它适合于产物抑制的场合；但在底物抑制的系统中，则,连续流搅拌桶式反应器,的性能又优于填充床。流动床反应器因其流动特性接近,连续流搅拌桶式反应器,，故也适宜于底物抑制的反应。,72,酶的稳定性,在反应器操作过程中，由于搅拌浆或液流的剪切作用，常会使固定的酶从载体上脱落下来，或由于磨损，引起粒度的减小而影响固定化酶的操作稳定性，其中尤以连续流搅拌桶式反应器最为严重。,为解决这一问题而改进反应器设计，是把酶直接粘接在搅拌轴上，或把固定酶设置在与轴相连的金属网篮内。,73,操作要求及反应器费用,连续流搅拌桶式反应器是最便宜的，它结构简单，且具有良好的操作性，适应性强；而其他类型的反应器，则都需为特定的生产过程专门设计和制造。在讨论反应器价格的同时，还应该考虑固定化酶本身的费用，及在各种反应器中的稳定性。,74,固定化对酶反应系统的影响,固定化对酶活性和酶反应体系的影响是十分复杂的，常因酶的种类、反应系统的组成，特别是,固定的方法及载体,而显著不同。为了简化，通常作两个假设：,酶在载体表面或多孔介质内的分布是完全均匀的。,整个系统各方同性。,75,构象改变和屏蔽效应,酶在固定化的过程中，出于酶与载休相互作用使酶的活性中心或变构中心的构象发生变化从而导致酶活性下降。这种效应难以定量描写，也难以预测。通常出现在吸附法和共价键结合法。,立体屏蔽效应是由于载体对酶的活性中心或变构中心造成空间障碍，因而底物或效应物与酶无法接触，从而影响酶的活性。若在酶和载体间加入臂，可以得到改善,76,微环境的影响,微环境是紧邻固定化酶的环境区域。微环境的影响是由于载体的亲水与疏水性质和介质的介电常数等直接影响酶的催化效本，或者是酶对效应物作出反应的能力的一种效应，通常可以通过改变载体和介质的性质作出判断和调节。,77,分配效应,由于载体的亲水和疏水性质使底物、产物或其他效应物在微观环境和宏观体系间发生不等分配，改变了酶反应系统的组成平衡，从而影响了反应速度。,78,分配效应的影响,载体与底物带有相同电荷，则酶的,Km,值将因固定化而增大；如果带有相反电荷则相反。,当载体带正电荷时，固定化之后，酶活性一,PH,曲线向酸性方向偏移；相反，阴离子载体将导致该曲线向碱性方向偏移。,以上效应可通过提高介质离子强度而削弱或消除。,采用疏水载体时，如底物为极性物质，或电荷物质，则酶的,Km,值将因固定化而降低，其他效应物亦然。,79,扩散效应,扩散限制效应是指：底物或其他效应物的迁移和运转受到限制的一 种效应。它分内扩散效应和外扩散效应两种。,外扩散限制，是指上述物质从宏观体系穿过包围在固定化酶周围近乎停滞的液膜,(Nernst),层到固定化酶表面所受到的限制，可以充分搅拌或混合而减小或消除。,内扩散限制，是指上述物质从固定化酶表面来到颗粒内部酶活性位点受到的一种限制。,80,固定化酶的优点,极易将固定化酶与底物、产物分开，简化了提纯工艺；,稳定性提高，可长时间反复使用，有利于工艺的连续化、工业化；,酶反应过程可以严格控制，有利于工艺自动化和微电脑化；,较能适应于多酶反应；,酶的使用效率提高，产物得率提高，产品质量有保障，成本低。,81,固定化酶的缺点,由于底物须经扩散才能和载体上的酶接触，反应产物也要经扩散进入液相，固定化酶速度一般低于可溶性酶；,不适用于不溶性底物及大分子底物，也,不适于多酶反应，特别是需要辅因子的反应；,应用过程中酶可能从载体上流失，且由于化学反应、空气或固态污染物堵塞酶的活力中心和载体的结构而导致酶活力下降。,82,固定化酶与固定化细胞的应用,工业发酵,生物传感器,生物化学及分子生物学基础研究,药物控释载体,废水,/,气生物处理,83,固定化酶应用实例,固定化酶,应用,生产时间,氨基酰基转移酶,DL-,氨基酸的旋光度解析,1969,葡萄糖异构酶,将葡萄糖异构变为果糖,1973,青霉素酰胺酶,生产,6-APA,1973,天冬氨酸酶,生产,L-,天冬氨酸,1973,延胡索酸酶,生产,L-,苹果酸,1974,-,半乳糖苷酶,水解乳糖,1977,L-,天冬氨酸,-,脱羧酶,生产,L-,丙氨酸,1982,84,固定化葡萄糖异构酶实例,作为蔗糖的替代品，果糖不会像蔗糖那样诱发肥胖、糖尿病、龋齿和心血管病，对人的健康有利。,反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本，提高果糖的产量和质量。,85,固定化细胞法生产,6-,氨基青霉烷酸,技术路线,E.,Coli,斜面 细胞 固定化细胞,青霉素,G,转化液 滤液,6-APA,粗品,培养,固定,转化,过滤,抽提,86,二,、微生物制剂,Microbial preparation,87,定义,微生物制剂是依据微生物之间生态位的共生性原理通过筛选、驯化、诱变等技术手段组合形成的具有特定功能的微生物菌群。又称为微生态调节剂,(Microecological modulator),、,EM(Efficient microbe agent),菌制剂。,要求,微生物种类多，共生性关系紧密，环境适应性强，种群结构相对稳定。,定 义,88,微生物制剂的配置原则,1,微生物生理学原理,微生物生理学的本质就是研究微生物生命活动及其作用有机质的化学组成、结构和功能之间的关系，以及微生物生命活动过程中的化学变化规律。,微生物的新陈代谢是在酶催化作用下的物质与能量摄入与利用，由于各种微生物酶系的局限性，一般需要多种微生物协同作用才能完成整个物质能量循环过程。,89,微生物制剂的配置原则,2,微生物生态学原理,微生物生态就是研究微生物与其存赋环境中物理化学、生物等因子间的相互关系。,微生物的新陈代谢作用是受外界环境因子控制的。由于微生物生命活动过程不仅要与其存赋环境发生能量、物质交换，且其酶催化反应受各种环境因子的影响。,微生物间的生态关系：,竞争、互生、拮抗、共生,90,微生物制剂的配制方式,筛选出优势菌株后根据其生理生态学需求进行复配,(,微生物法,),；,筛选出优势微生物菌群后，依据生理生态学原理进行检验，并删补相关微生物,(,生态法,),。,91,微生物法及其特点,可迅速提高微生物浓度，并有可能短期内提高微生物的生物降解速率；,微生物可能出现现场适应性较差，代谢活性降低的现象，需要多次投放；,纯种微生物菌株的可培养性较差，难以筛选到特定目标微生物；,不太适用于地下污水层的处理；,受政策限制。,92,微生态法及其特点,采用理化、生物手段强化现场微生物菌群，适应性好，但相对速率较慢；,难以确知治理所需的时间以及估计最终可能达到的污染物浓度；,费用少于微生物法；,不适于处理分散的污染物和浓度过高或过低的污染物。,93,生物制剂的特点,针对性强，处理效率高,产品多样性好，用途广泛,驯化时间短，工作效率高,生态安全性高，操作简便,量小,分散,连续性,94,微生物制剂存在的问题,微生物对环境条件的温度、,pH,、离子强度、氧化还原电位、营养等非常敏感，导致各菌种生长速率不等，因而很难保持种群结构的相对稳定性。,研究中多因素间的相互作用难以诠释，而单因素的作用缺乏有效的指导意义。,在当前复合菌剂的开发中，关键是对微生物的复合机理没有成熟方法和规律可循。,95,典型微生物制剂,-,EM,EM,是有效微生物群,(Effective Microoganism),的英文缩写，由日本琉球大学比嘉照夫教授于,20,世纪,80,年代初发明、其代表产品为,BM-1,号,(,又称,EM,原液,),，是建立和发展无公害绿色农业的重要生物技术。,EM,原液通过采用适当的比例和独特的发酵工艺将好氧性和嫌氧性有益微生物混合培养，形成多种多样的微生物群落，它们在生长中产生的有益物质及其分泌物质成为各自或相互生长的底物，通过这样一种互生增殖关系，组成了复杂而稳定的微生态系统。,96,作用机理,EM,茵群作用的基本原理是基于头领效应的,微生物群体生存理论,和,抗氧化学说,，以光合菌为中心，与固氮菌并存、繁殖，采用适当比例和独特的发酵工艺，把经过仔细筛选好氧和厌氧微生物加以混合后，培养出多功能的微生物群落。,97,微生物构成,它由,5,大类微生物中的,80,多个种类构成,光合菌,乳酸菌,酵母菌,放线菌,发酵型丝状菌,98,EM,应用于污水处理的优点,EM,菌群依靠相互间共生增殖及协同作用，代谢出抗氧化物质，并抑制有害微生物的生长繁殖，激活水中原有微生物，通过这些生物的综合效应达到净化水体的目的。,处理效能提升,污泥产量少,曝气强度低,抗冲击性强,臭气性物质减少,99,EM,应用于富营养化污染控制,100,EM,菌抑藻机理,菌藻互作,EM,的高效抑藻作用可能是通过相互间的竞争性生长、持续的藻菌互作过程产生的；而相互间不同的生长、繁殖方式，不同的生物代谢过程,(,包括吸收、降解、转化、分泌等,),极可能是,EM,与藻类互作过程及抑制作用的内在机制。,我们的研究表明，其很有可能是微生物对营养元素的利用及其生长代谢产物对藻的抑制作用达成的。,101,102,三、微生物表面活性剂,Microbial surfactants,103,定 义,生物表面活性剂,(biosurfactant,，简称,Bs),是指利用酶或微生物通过生物催化和生物合成方法得到的具有表面活性的生物大分子物质，如糖脂类、氨基酸类、蛋白质类等表面活性剂。,一般为阴离子型或非离子型，较少阳离子型。,104,与传统化学表面活性剂的对比,105,微生物表面活性剂的优点,更强的表面和界面活性,;,对热的稳定性,;,对离子强度的稳定性,;,生物可降解性,;,破乳性。,制备原料来源广泛，生产工艺简单，设备要求低。,106,生物表面活性剂分类,糖脂,：鼠李糖脂、海藻糖脂、槐糖脂,脂肽和脂蛋白,：氨基酸脂,脂肪酸和磷脂,：磷脂酰乙醇胺,聚合物,：阴离子杂多糖,全胞表面,：不动杆菌产生的囊泡,107,糖脂,鼠李糖脂,(,假,单胞菌,),海藻糖脂,(,分枝杆菌、棒杆菌,),108,O-CH- CH,2,- CH,2,- CH,2,- CH,2,- CH,2,- CH,2,- CH,3,C-CH,2,-CH - CH,2,- CH,2,- CH,2,- CH,2,- CH,2,- CH,2,- CH,3,O,-,O,O,HO,OH OR,CH,3,O,Rhamnolipid monomer,Micelle formation at CMC concentrations,CMC = 0.1 mM (50mg/L),O=C,CH,2,Ca,2+,5 nm diameter,产生鼠李糖脂的主要微生物：假单胞菌,109,脂肽与脂蛋白,产生脂肽的主要微生物：芽孢杆菌,pH8.5,的,0.1M NaOH,中，,CMC,为,9.4 10,-6,M,酸性条件下带负电荷，具有离子载体和螯合的性质,110,pH,对脂肽溶液表面张力的影响,111,NaCl,对脂肽溶液表面张力的影响,112,脂肪酸和磷脂,甘油的,C,（,1,）和,C,（,2,）羟基被脂肪酸酯化，,C,（,3,）羟基被磷酸酯化，磷酸又与一极性醇,X-OH,连接，这就构成甘油磷脂。,113,阴离子杂多糖,糖的支链上连有糖醛酸,114,生物表面活性剂及其产生微生物,115,发酵法生产表面活性剂的方法,直接细胞培养发酵法,控制细胞代谢发酵法,休止细胞法,加入前体诱导法,生物表面活性剂是微生物适应生存环境而产生的，其主要作用在于：,促进底物分散吸收；,调节细胞亲和底物；,调节环境以利自身；,直接抑制其他微生物,116,酶法合成生物表面活性剂,酶法合成单酰化甘油脂类,1,3-,特异性脂酶,酶法合成糖脂类 猪胰脂肪酶,酶法合成氨基酸类,酶法合成和修饰磷脂类,酶法合成异头碳上构型单一的烷基糖苷类,117,典型表面活性剂及其特性,118,影响生物表面活性剂产生的因素,碳源,棒杆菌,-,烷烃、芽孢杆菌,-,水溶性、假单胞,-,两种,氮源,铵盐或尿素,pH 6.58,温度,40,搅拌强度,剪切作用,氧,氧化还原电位,离子强度,119,生物表面活性剂的提取,萃取：氯仿,-,甲醇、丙酮、甲基叔丁基醚,超滤膜：甲醇裂解胶束,泡沫分离：直接回收,120,生物表面活性剂的结构分析,糖脂的亲水糖苷与亲脂脂肪酸 脂键,/,配糖键,酸、碱性水解后检测水解组分，碱性水解使脂肪酞基与糖轻基之间的酷键断裂,;,酸性水解使两个糖基之间或一个糖基与一个类脂基中的羚基之间的,O-,配糖键断裂。,脂肽的亲水氨基酸与亲脂脂肪酸 脂键,/,酰胺键,先弱碱水解下一单元脂肪酸，再强酸解脱酰化氨基酸类脂，水解后的氨基酸可测。,121,生物表面活性剂的应用,122,四、微生物絮凝剂,Microbial bioflocculant,123,絮 凝 剂,絮凝剂是一类可以使液体中不易沉淀的悬浮颗粒凝聚和沉淀的物质。,絮凝剂按其分子组成，可分为无机絮凝剂和有机絮凝剂；,根据分子量的高低可分为高分子型、低分子型；,根据官能团的性质及官能团所带电荷的性质，又可分为、阳离子型、阴离子型和非离子型。,124,常用无机絮凝剂,125,常用有机絮凝剂,合成高分子絮凝剂,天然改性高分子絮凝剂,微生物絮凝剂,多功能水处理剂,126,生物絮凝剂,生物絮凝剂,(Bioflocculant),是一类由微生物产生的代谢产物，主要成分有糖蛋白、多糖、蛋白质、纤维素和,DNA,等。,它是利用微生物技术通过细菌、真菌等微生物发酵、提取、精制而得到的，具有生物分解性和安全性，是新型、高效、无毒、无二次污染的水处理剂。,127,生物絮凝剂的分类,按化学结构分：,糖类,多肽、蛋白质和,DNA,类物质,脂类物质,按来源分：,微生物细胞,细胞壁提取物,细胞代谢物,128,生物絮凝剂的优势,无毒无害，生物安全性高,无二次污染,净化效果好，应用范围广,生产使用成本低,129,常见生物絮凝剂产生菌,130,生物絮凝剂的分离、提纯,生物絮凝剂在培养物中主要存在于培养液和微生物细胞表面；,提取方法主要有溶剂提取、碱提取与凝胶电泳；,细菌产生的产生的絮凝剂主要是碳水化合物及含有聚多糖的蛋白质；真菌产生的絮凝剂主要成分是联结了脂肪酸和蛋白质的磺酸异多糖，其多糖的基本骨架是氨基酸、甘露糖、鼠李糖、半乳糖等。,131,影响微生物产生絮凝剂的因素,培养基,pH,温度,溶解氧,培养时间,132,絮凝机理,吸附架桥,：絮凝剂借助离子键、氢键,同时结合了多个颗粒分子,因而在颗粒间起了,“,中间桥梁,”,的作用,把这些颗粒联结在一起,从而使之形成网状结构沉淀下来。,电中和,：水中带负电胶粒在带正电荷链状生物大分子絮凝剂或其水解产物作用下中和表面电荷,使胶粒脱稳并进而通过分子间作用力凝聚沉淀。,网捕,：高聚物分子通过其在水溶液中的伸展而吸附裹挟胶体颗粒物，使其聚结而沉降。,133,吸附架桥,134,胶粒,胶核,电位,电位,电位离子,反离子,滑动面,胶团边界,吸附层,扩散层,电 中 和,135,网 捕,136,生物絮凝剂的应用,废水脱色,废水除浊,污泥处理,137,感谢各位同学的陪伴,138,你从本门课程收获了什么？,139,