现代分子诊断技术

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第七章 现代分子诊断技术,酶联免疫吸附测定,DNA,诊断系统,DNA,指纹,遗传性疾病的分子诊断技术,基因诊断,基因,蛋白质,性状,生化诊断,基因诊断,临床诊断,传统的诊断程序,先要对病原物质进行培养，培养后再分析它的生理学特性,确定它到底是哪一类的病原物，是病毒、细菌，还是其他物质,实践证明,:,比较有效,检测到病原微生物相对比较特异,诊断成本高、速度慢、效率低,如砂眼衣原体、朊病毒,方法,优点,缺点,显微镜镜检,简单易行，可直接观察到寄生虫的形态,速度慢，灵敏度低，对经验水平要求高费时费工，无法辨别形态相近的寄生虫,体外培养、接种,能检测到活的寄生虫，并可检测感染性和感染程度,速度慢、花费高，寄生虫可能难以进行体外培养，且必须使用动物材料,抗体检测,简单、快速、能够实现自动化，可用于检测大量的样品,无法区分活的寄生虫与处在潜伏状态的寄生虫。有时会有非特异反应发生,DNA,杂交及,PCR,快速灵敏，能够实现自动化，可以分辨不同种的寄生虫，不需要以前有寄生虫感染病史,花费高，步骤多，无法区分活的和死的寄生虫，有时会有假阳性或假阴性,检测寄生虫感染的诊断方法的比较,现代分子诊断技术主要是指应用免疫学和分子生物学的方法对病原物质进行诊断检测,一种有效的诊断方法应具备：,1,、专一性（,specificity,）强，诊断只对某一种病原菌分子产生阳性反应,2,、灵敏度,(sensitivity),高,3,、操作简单,(simplicity),基因诊断的特点,特异性高,检测目标是基因，为原始的致病因素,灵敏度高,待测标本往往微量，目的基因只需,pg,水平,稳定性高,基因的化学组成为核酸，比蛋白质稳定，且不需处于活性状态,诊断范围广，适应性强,确切的诊断，也能确定与疾病的关联状态,临床应用前景好,基因诊断优点,从基因水平彻底揭示疾病的病因及发病机制,显著提早产前诊断的时间,无需对组织、器官或细胞进行选择,快捷准确、安全,基因诊断常用的技术,核酸分子杂交,PCR,（聚合酶链式反应）,限制性酶切分析,SSCP,（单链构象多态性分析）,DNA,测序,DNA,芯片技术,DNA,Southern blot, FISH,PCR, Sequencing, micoarray, restriction analysis, RFLP,，,SSCP,RNA,Northern blot, RT-PCR, micoarrays,Protein,Western blot, Immuno-histochemistry, microarray,Southern blot,N,N T T N T T,FISH,PCR,技术,DNA,测序,指在固相支持物上,原位合成寡核苷酸,或者直接将,大量探针以显微打印的方式有序地固化,于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交的检测分析，得出样品的遗传信息（基因序列及表达的信息）,由于在制备过程中运用了,计算机芯片,的制备技术如显微光蚀刻、显微打印等，且常用,硅芯片,作为固相支持物，所以称为,DNA,芯片技术,DNA,芯片技术的概念,DNA,芯片技术原理,大规模集成的固相杂交,基本原理是核酸分子杂交，即依据,DNA,双链碱基互补配对、变性和复性的原理,以大量已知序列的寡核苷酸、,cDNA,或基因片段作探针，检测样品中哪些核酸序列与其互补，然后通过定性、定量分析得出待测样品的基因序列及表达的信息,DNA,芯片技术流程,Biological,Sample,Analyze data,Scanner,microarray,“,Hybridize”,arrayer,Microarray fabrication,Sample preparation,Molecular hybridization,Detection and analysis,基因诊断的原理,利用分子生物学和分子遗传学的技术，从,DNA,或,RNA,水平检测、分析基因的存在、变异和表达状态，从而对疾病做出诊断的方法,策略,检测已知的能产生某种特定功能蛋白的基因,检测与某种遗传标志连锁的的致病基因,检测表型克隆基因,基因治疗的机理,基因置换：正常基因取代致病基因,基因修正：纠正致病基因的突变碱基序列,基因修饰：目的基因表达产物补偿致病基因的功能,基因抑制：外源基因干扰、抑制有害基因的表达,基因封闭：封闭特定基因的表达,“自杀基因”的应用,免疫基因的治疗,耐药基因的治疗,美国医学家,W,F,安德森等人对腺甘脱氨酶缺乏症（,ADA,缺乏症）的基因治疗，是世界上第一个基因治疗成功的范例,1990,年,9,月,14,日，安德森对一例患,ADA,缺乏症的,4,岁女孩谢德尔进行基因治疗。这个,4,岁女孩由于遗传基因有缺陷，自身不能生产,ADA,，先天性免疫功能不全，只能生活在无菌的隔离帐里。他们将含有这个女孩自己的白血球的溶液输入她左臂的一条静脉血管中，这种白血球都已经过改造，有缺陷的基因已经被健康的基因所替代。在以后的,10,个月内她又接受了,7,次这样的治疗，同时也接受酶治疗。经治疗后，免疫功能日趋健全，能够走出隔离帐，过上了正常人的生活。,谢德尔，,1999,分子诊断,利用,PCR,技术或,PCR,与分子杂交标记相结合，可以快速准确地检测出病原性物质。,分子诊断,遗传性疾病的诊断,羊水和胎盘绒毛膜检测,第一节酶联免疫吸附测定,抗体高度特异地与抗原分子结合,通过抗原,-,抗体的特异识别反应进行检测,酶联免疫吸附测定,(enzyme-linked immunosorbant assay,ELISA),一、酶联免疫吸附测定的原理,工作原理：,主要是利用了一抗与目标分子的特异性结合,假定目标分子是一种蛋白质，那么要得到可用于检测的抗体，则首先需要纯化出这种蛋白质，然后用纯化的蛋白质免疫动物（一般是兔子），在免疫过程中兔子的血清就会产生多克隆抗体,二、检测过程：,将待测样品结合在固相支持物（如,96,孔的微量滴定板）上,加入可以与目标分子特异反应的抗体，即一抗（,primary antibody,）,反应后冲洗，将未结合上的一抗洗去,加入二抗（,secondary antibody,），二抗通常只特异地识别一抗，而不识别目标分子（二抗上还连着一种酶，如碱性磷酸酶、过氧化物酶或脲酶等，这些酶都能够催化一种化学反应将无色底物转变成有色物质），一抗与二抗反应完成后，再次冲洗将未与一抗结合的二抗洗去,加入无色底物,双抗体夹心法,检测大分子抗原,间接法,检测抗体,竞争法,测定小分子抗原或半抗原，也可测定抗体,双夹心法,测定大分子抗原,特异性相同，来源不同,3,、使用多克隆抗体的缺点,同一抗体混合物中不同抗体的含量会有差异，而且每次制备的抗体的量之间也会有差异,无法区别相类似的目标分子：如果病原分子与非病原分子之间只相差一个抗原决定簇，这时多克隆抗体就无法区分，因为在,ELISA,检测中都会发生颜色变化,单克隆抗体特异性强,只结合抗原上某一单一位置,4,、酶联免疫吸附测定的局限性,仅凭,ELISA,结果容易造成误诊，,ELISA,检测只能作为一种初步的检测手段，要进一步确诊还必须进行,western,检测,要提高,ELISA,检测的准确度,就必须提高一抗的特异性,在使用抗体时，要求其抗原的编码其目标识别位点的,基因要表达，,而且目标位点,不能够以任何方式被覆盖或阻断,，,否则都将影响抗体与抗原的结合,第二节,DNA,诊断系统,DNA,诊断的理论基础：,任何一个决定生物学特性的,DNA,序列都应该是独特的，都可以作为专一性的诊断标记,一、核酸杂交,1,、工作原理：,两条,DNA,链之间可以通过碱基配对而形成氢键,2,、,3,个关键要素：,探针,DNA,目的,DNA,信号检测,主要依据： 碱基互补、变性和复性,DNA,与,DNA,杂交：,A=T,、,GC ;,DNA,与,RNA,杂交,:,A=U,、,GC ;,变性：,在一定温度下，使核酸双链解开为两条单链；,复性：,随温度逐渐恢复，变性的两条单链重新形成互补双链,碱基互补,核酸分子杂交（固相杂交）操作程序,制备待测核酸样品,分离、变性、转移、固化,DNA,片段,杂交,加入标记核酸探针,检测杂交信号,标记核酸探针,预杂交,制备核酸探针,漂洗去除未参与杂交的标记探针,3,、杂交探针,必须是高度特异性的,DNA,片段,种级探针：区分两个或多个物种,亚种级探针：区分物种内特定的株系,DNA,RNA,化学合成或克隆的完整基因,基因的一个片段,利用核酸双链的,碱基互补、变性和复性的,原理，可以,用已知碱基序列的单链核酸片段,作为,探针,，与待测样本中的单链核酸互补配对，以判断有无互补的同源核酸序列的存在,核酸探针,是指带有标记的某一特定,DNA,或,RNA,片断，能与待测样本中单链核酸分子互补配对结合，进而检测同源序列,探针标记物,有,放射性核素,或,非放射性核素,（生物素、地高辛、荧光素等）两大类,分离杂交探针的方法：,提取某一病原微生物株系的染色体,DNA,限制性内切酶进行酶解,得到的酶解片段克隆进一质粒载体，构建质粒文库,文库中重组质粒的插入片段即可用来分别同病原性微生物和非病原性微生物的核,DNA,进行杂交、筛选,核酸杂交的灵敏度和可靠性极高,用探针直接同粪便样品、尿样、血样、喉洗液和组织样品中的目标,DNA,进行杂交，且无需预先纯化,DNA,若样品中的目标分子非常少，则需通过,PCR,将目的序列扩增，再进行杂交检测,从理论上讲，用,DNA,杂交来诊断疾病可用于对所有的致病微生物的检测,4,、非同位素标记探针,32,P,的缺点：,半衰期短，仅,13,天,操作起来比较危险,必须要有特殊的实验室设备进行操作,放射性垃圾的处理繁琐,非放射性杂交检测系统：,通过酶促反应将某种底物转变成生色物质或化学发光物质而达到放大信号的目的,采用将生物素（,biotin,）标记的核苷酸掺入,DNA,的方法制备探针,生物素标记的,DNA,在室温下至少可保存一年,检测发光和颜色变化可在几小时内完成,B,B,B,B,AP,B,B,AP,生物素,加入链霉素抗生物蛋白,加入生物素标记的碱性磷酸酶,探针,目的,DNA,加入不同的生色或化学发光底物,荧光标记的引物直接进行,PCR,检测,DNA,引物,1,引物,2,荧光染料,PCR,层析,荧光检测,游离引物,分子夹心探针检测,发出荧光,分子夹心探针,(,没有荧光,),荧光团,猝灭剂,目的,DNA,与目的,DNA,杂交,TaqMan,探针技术,原理：,利用,Taq,酶的,3 5,外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号，由于探针与模板特异性结合，荧光的强弱就代表了模板的数量,3,5,5,3,Q,R,上游引物,下游引物,5,3,3,5,Q,R,TaqMan,探针的荧光信号产生机制,疟疾的分子诊断：,检测是否存在疟原虫,抽取血样进行镜检,免疫诊断,:ELISA,检测疟原虫蛋白或抗体,无法区分是以前感染还是现在感染,DNA,杂交诊断,例一：,DNA,的杂交探针是一段疟原虫的高度重复的,DNA,序列,具体的分离过程：,构建一个疟原虫的核基因文库,用标记的疟原虫核,DNA,作探针去筛选核基因文库,选出那些杂交信号最强的克隆,用这些选出来的片段作探针，与疟原虫及其同属中不导致疟疾的种的核基因作杂交，以检查该片段作为,DNA,探针的可靠性,锥虫的检测,锥虫在人体中可侵入肝、脾、淋巴结、中枢神经系统，在其中大量繁殖并杀死寄主细胞,显微镜检新鲜血液,取新鲜血液感染未携带锥虫的寄生虫,30-40,天后杀死昆虫,镜检昆虫的肠道,免疫检测,:,假阳性高,例二：,PCR,检测,针对,锥虫特有的一段,188bp,的,DNA,序列设计引物，特异地从锥虫基因组中扩增得到,188bp,的条带,二、细菌性传染病及病毒性疾病的分子诊断技术,抗生素的不合理使用,DNA,杂交,PCR,检测,噬菌体介导,DNA,杂交,设计,16SrRNA,为探针,16SrRNA,在细菌中拷贝数极高，高度的保守性,特异性不是很好,必须结合,PCR,技术,PCR,检测,nested PCR,针对目的病原菌的不同保守区段设计多对引物 每对引物都能特异的扩增出一段目的片段，病原菌存在的可能性大大增加,模板,使用外引物，进行第一次,PCR,扩增,使用内引物，进行第二次,PCR,扩增,第一次,PCR,扩增产物,第二次,PCR,扩增产物,巢式,PCR,原理示意图,PCR,技术也会产生假阳性,新扩增的目的,DNA,特异性不强,退火温度过低,模板中杂质的污染,假阴性,存在,Taq,酶的抑制剂,模板量过少,模板,DNA,纯度不够,原位,PCR(,in situ,PCR,ISPCR ),在细胞或细胞切片上对待测的低拷贝数基因进行扩增，并通过原位杂交进行检测,不仅能检测出病原微生物的存在，且能够在组织细胞中定位,原位杂交,（,nucleic acid hybridization in situ,）,将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，进而检测特异的,DNA,或,RNA,序列,细胞原位杂交,组织切片原位杂交,DNA-DNA,RNA-DNA,三类杂交,RNA-RNA,该法优点：,不需提取核酸，,故可完整保持组织或细胞的形态，因而更能准确地反映组织细胞的功能状态,有,噬菌体介导细菌检测,将荧光素酶基因引入到噬菌体的基因组，然后用转基因噬菌体去侵染待测样品,噬菌体侵染该宿主菌，大量合成包括荧光素酶在内的由噬菌体基因编码的蛋白，向体系中加入荧光素和,ATP,，就会有荧光产生,结核菌的检测,抗药性菌株的检测,荧光素酶,荧光素,ATP,荧光,利用宿主细胞转录、翻译,噬菌体基因,荧光素酶基因,宿主细菌,噬菌体介导的细菌检测,第三节,DNA,指纹,每个人体细胞内都含有,23,对染色体，每条染色体中部含有一个,DNA,分子，,DNA,分子中的核苷酸序列包含着遗传信息，在,DNA,分子中存在三种类型：单拷贝序列、中等程度重复序列、高度重复序,每个重复序列在,300,个核苷酸长度之内，由于高度重复，序列经过超离心后以卫星带出现在主要,DNA,带的附近，所以也称卫星,DNA,，其中的重复序列单元则称为“小卫星,DNA”,“小卫星”具有高度的可变性，但在“小卫星,DNA “,中有一小段序列则在所有个体中都一样，称为“核心序列”。如果把核心序列串联起来作为分子探针与不同个体的,DNA,进行分子杂交，就会出现各自特有的杂交图谱。它们与人的指纹一样具有专一性和特异性，因此称作“,DNA,指纹”,通过对人类基因组的解析，发现人与人之间,99,99,的碱基序列都相同，而剩下的,0.01%,的碱基特征序列则来自于双亲，据此可用于“亲子鉴定”,所罗门的审判：,大家都听说过所罗门的审判这样一件故事：,两位妇人都声称自己是孩子的母亲，于是,所罗门就命令一名侍卫把那个孩子带来，要用剑将其,辟成两半分给他们两，,结果假母亲同意所罗,门的判决，而孩子真,正的母亲却恳求侍卫,饶了孩子的性命，她,解释说：“把孩子给了,假母亲，总比让孩子,惨死好。”当然，真假母亲也就水落石出了,。,滴骨验亲法：,以生者的血滴在尸骨上，观察血能否浸入骨内，浸入的则被认为两者有血缘关系，在各种古籍中有多种记录。,三国时代（公园,220280,年）谢承著,会稽先贤传,中的,以弟血滴兄骨,可能是记录此法的最早的史料：陈业的哥哥因海难不幸殒命，当时一同遇难的有五六十人，并且尸体都已严重腐败而无法辨认死者的身份。陈业就用刀刺破自己的手臂将血分别滴在尸骨上，发现其血液只能浸入一具尸骨，其余皆不能。陈业就这样确认其兄的尸骨。,合血法：,等到了明代，更是采用了“合血法”来识别亲权。明末清初的检验书籍中都有相同的记载：“亲子兄弟或自幼分离，欲相认识。难辨真伪。命各刺出血，滴一器内，真则共凝为一，否则不凝也。”,方法：,DNA,指纹是指对待测样品中的,DNA,进行分析所得到的具有特征性的,DNA,分子杂交图谱,DNA,酶解 电泳 转膜 杂交,最常用的,DNA,探针是微卫星序列,受害者血样,犯罪嫌疑人衣物上血样,犯罪嫌疑人血样,第四节 遗传性疾病的分子诊断技术,直接诊断,点突变,间接诊断,多态性连锁分析,美国前副总统汉弗莱,Humphrey),在,1967,年发现膀胱内有一肿物，病理切片未发现癌细胞,良性“,慢性增生性囊肿,”，未进行手术治疗。,九年后，他被诊断为患有“,膀胧癌,”,，两年后死于该病。,1994,年，研究者用灵敏的,PCR,技术对上述汉弗莱,1967,年的病理切片进行了,P53,抑癌基因检查，发现那时的组织细胞虽然在形态上还没有表现出恶性变化，但其,P53,基因的第,227,个密码,子,已经发生了一个核苷酸的突变。就是这个基因的微小变化，使其抑癌功能受损，导致九年后细胞癌变的发生。这说明，在典型症状出现之前的很长时间，细胞癌变的信息已经在基因上表现出来了,P53,抑癌基因,遗传性疾病的分子诊断技术,PCR,酶解鉴定,PCR,OLA,鉴定,PCR-ELISA,检测,PCR-DGGE,鉴定,扩增阻滞突变系统（,amplification refractory mutation system,ARMS,）,连接酶链反应（,LCR,）,镰刀形细胞贫血症,(sickle-cell anemia),典型的单基因遗传性疾病,血红蛋白的,链（,珠蛋白）的第六个氨基酸,Glu,发生突变成,Val,血红蛋白,-,链上,谷氨酸,变成,缬氨酸,英国女王维多利亚。她带有,血友病基因,，并将其传给了她的儿女。血友病是一种遗传性凝血障碍疾病，患者可能因很小的伤口而出血不止导致死亡。血友病在女性一般表现为隐性遗传，较少发病，但会传给后代；在男性则表现为显性遗传，显示出病症。维多利亚女王在科堡主持的一次欧洲王室成员集会，与会者有,17,人是她的后裔，其中有她的孙女亚历山德拉（,21,），她同俄国沙皇尼古拉二世结婚，导致他们的儿子患有血友病。,血友病,基 因,一、,PCR,酶解鉴定,正常基因为,CCTGAGG,镰刀形贫血病患者的基因为,CCTGTGG,限制性内切酶,Cvn,I,的识别序列为,CC TNAGG,方法,:,在,Cvn,I,位点的两点设计两个引物,;,包含,Cvn,I,位点区域的,DNA,片段通过,PCR,扩增出来,;,扩增的,DNA,用,Cvn,I,酶处理，酶解产物用凝胶电泳分开，经溴化乙锭染色后就可在紫外灯下检查,DNA,带型。,382,256,201,181,88,条带大小,(bp),正常纯合子,杂合子,突变纯合子,CvuI,处理,CvuI,CvuI,CvuI,256bp,201bp,181bp,88bp,CvuI,CvuI,256bp,382bp,88bp,正常情况,镰刀形细胞贫血症,PCR,扩增,引物,1,引物,2,PCR,产物（长,726bp,）,二、,PCR/OLA,鉴定,OLA(oligo-nucleotide ligation assay),寡聚核苷酸连接分析,假定一个正常的基因在一个特定的位置发生了突变，比如说,150,位的,T,突变为,G,根据,150,位两边的序列，人工合成两段短的核苷酸链，使这两段寡聚核苷酸链与基因的一条链互补,探针,X,：寡聚核苷酸链的,3,端最后一个核苷酸正好与正常基因的,150,位的的核苷酸配对,探针,Y,：另一段寡聚核苷酸链的,5,端第一个核苷酸与,151,位的核苷酸配对,正常基因,探针,X3,端最后一个核苷酸就不会与目的基因,150,位的核苷酸配对,由于,3,最后一个核苷酸不配对而使两个探针无法实现连接,目的基因突变,两探针与目的基因的完美配对,两个探针就可连接起来,加入,DNA,连接酶,B,150,151,D,B,D,150,151,B,X,Y,150,151,D,B,D,双链目的,DNA,或,PCR,产物,热变性,单链目的,DNA,或,PCR,产物,加探针退火,完全配对,模板有突变,不完全配对,连接酶,连接酶,加入链霉抗生物素蛋白,加入链霉抗生物素蛋白,B,D,B,加入碱性磷酸酶,加入无色底物,加入碱性磷酸酶,加入无色底物,B,D,AP,变色,无色底物,有色底物,B,保持无色,无色底物,PCR/OLA,分析程序示意图,例：特异性互补寡核苷酸法检测镰状红细胞贫血症,（,1,）提取,DNA,，热处理成为单链,DNA,；,（,2,）以单链,DNA,为模板，仅对可能发生突变的核苷酸区域设计引物进行,PCR,扩增后转移到滤膜上，热变性成单链；,（,3,）分别用两种特异性互补寡核苷酸分子探针（,ASO,）杂交。,三、,PCR-ELISA,检测,在,PCR,反应体系中加入生物素标记的,dUTP,和其他,3,种,dNTP,3,端经,DIG,标记特异性探针,包被有抗生物素抗体的酶标板,抗碱性磷酸酶（,AP,）,DIG,抗体,如果加入的,DIG,标记的探针可与扩增片段结合，则酶标板上有颜色反应发生，否则不会有颜色的变化,四、,PCR-DGGE,法,原理,变性梯度凝胶电泳（,DGGE,）是一种根据,DNA,片段的熔解性质而使之分离的凝胶系统,Tm,值主要取决于,DNA,分子中,GC,含量的多少,DGGE,将凝胶设置在双重变性条件下：温度,5060 ,，变性剂,0100%,当一双链,DNA,片段通过一变性剂浓度呈梯度增加的凝胶时，此片段迁移至某一点变性剂浓度恰好相当于此段,DNA,的低熔点区的,Tm,值，此区便开始熔解，而高熔点区仍为双链,原理,同样长度但序列不同的,DNA,片段会在胶中不同位置处达到各自最低解链区域的解链温度，部分解链的,DNA,片段在胶中的迁移速率急剧降低，形成相互分开的条带图谱,不同,DNA,片段的序列差异发生在最高的解链区域时，这些片段就不能被区分，则人为地加入一个高熔点区,GC,夹，即在一侧引物的,5,端加上一个,3040bp,的,GC,结构，使相应的感兴趣的序列处于低熔点区而便于分析,突变型,野生型,杂合型,五、扩增阻滞突变系统,等位基因特异性扩增,原理,Taq,缺乏,3 5,外切酶活性，如果引物的,3,端不能与模板,DNA,严格互补配对，模板,DNA,就不能有效的扩增,5 TACATTAGGTT 3,3 TAATCCAA 5,PCR,反应继续,5 TAC,C,TTAGGTT 3,AATCCAA 5,PCR,反应终止,3 T,5 TACATTAGGTT 3,AATCCAA 5,PCR,反应终止,3G,5 TAC,C,TTAGGTT 3,3 GAATCCAA 5,PCR,反应继续,野生型序列,突变序列,野生型引物,突变引物,ARMS,原理示意图,野生型,DNA,A,T,T 3,引物,3,发红光,C,G,T 3,引物,3,无法扩增没有荧光,A,ARMS,检测突变体举例,纯合突变体,DNA,C,G,G3,引物,3,发绿光,A,T,G 3,引物,3,无法扩增没有荧光,B,ARMS,检测突变体举例,杂合突变体,DNA,A,G,T 3,引物,3,G,发黄光,C,ARMS,检测突变体举例,T,C,引物,1,引物,2,G,T,六、连接酶链反应,基本原理,利用,DNA,连接酶特异地将双链,DNA,片段连接，经变性,-,退火,-,连接三步骤反复循环，从而使靶基因序列大量扩增,设计两对分别互补的引物，引物与之互补的模板,DNA,结合并留下一缺口，如果与靶序列杂交的相邻的寡核苷酸引物与靶序列完全互补，,DNA,连接酶即可连接封闭这一缺口，则,LCR,反应的三步骤,(,变性,-,退火,-,连接,),就能反复进行，若连接处的靶序列有点突变，引物不能与靶序列精确结合，缺口附近核苷酸的空间结构发生变化，连接反应不能进行，也就不能形成连接产物,第五节 基因工程疫苗,一、疫苗的简介,二、基因工程疫苗,1,、亚单位疫苗,2,、肽基疫苗,3,、,DNA,疫苗,一、疫苗的简介,Dr Edward Jener,（,1796,）：,用一种奶牛痘感染人类，感染后不再被天花感染,Louis Pasteur,（,19,世纪末）：,研制成功狂犬疫苗,Von Behring,Kitasato Shibasaburo,：,开发研制白喉,/,破伤风疫苗,医学上最有潜力的防御物质,灭活的和减毒的致病物质,不能丧失引起免疫反应的能力,麻疹、白喉、百日咳、破伤风、天花、脊髓灰质炎,传统疫苗的局限性,有些致病物无法在培养基上生长；,动物和人类的病毒需要在动物细胞中培养；,培养的动物和人类病毒其生长速度和产量一般都很低；,需要对实验室以及参加实验的操作人员采取特殊的保护措施；,疫苗中的致病物质在疫苗生产过程中又可能没有完全杀死或充分减毒；,减毒菌株有可能发生突变；,有些疾病（如艾滋病）用传统的疫苗防治收效甚微；,绝大多数的现行疫苗的有效期短。,衡量疫苗能否投入使用的标准,安全性,删除致病基因，保留抗原性。,有效性,尽可能调动机体细胞免疫和体液免疫。,免疫系统的工作机制：,体液免疫、细胞免疫,抗原,抗原肽,细胞表面复合物,活化的,B,细胞（浆细胞）,淋巴因子,活化的,T,细胞,抗体,杀灭抗原分子,抗原显示细胞（如树状细胞,）,吞噬，分解,MHC,蛋白质,识别、激活,杀伤,T,细胞,激活释放,激活,分泌,体液免疫,细胞免疫,二、基因工程疫苗,指用基因工程的方法，表达出病原物的一段基因序列，将表达产物（多数是无毒性、无感染能力，但具有较强的免疫原性）用作疫苗,1,、亚单位疫苗,利用病原物的某一部分制得的疫苗,明确编码具有免疫活性的特定抗原的,DNA,，一般选择病原体表面糖蛋白编码基因,对于易变异的病毒,(,如,A,型流感病毒,),则可选择各亚型共有的核心蛋白的主要保护性抗原基因序列,应用重组,DNA,技术研制亚单位疫苗，还必须有合适的表达系统用来生产基因产物,优点：,避免了直接使用病原物而使接受者可能致病的危险,亚单位疫苗利用纯化的蛋白质作为免疫源，可以避免由于外源蛋白、核酸的混杂等造成的种种副作用,有时单独使用特异蛋白能增加疫苗的效果,局限性：,纯化单一的蛋白质十分昂贵,纯化后的蛋白质的构象与在体内可能不同，从而导致抗原性发生变化,亚单位疫苗一般不具有感染性 不能激活,MHCI,分子，也很难激活杀伤性,T,细胞，激活的免疫反应一般较弱,制备亚单位疫苗的基本前提是鉴定出病原物中哪些成分能激活机体产生抗体,2,、肽疫苗,衣壳蛋白组成的外壳,病毒衣壳,病毒核酸,短肽,衔接物,只有位于病毒衣壳外表可以与抗体结合的蛋白质，其结构域才能引起免疫反应,类似于抗原决定簇的小肽充当疫苗,双肽：两个肽段连接形成一个较长的肽,不用载体蛋白保护，比其他任何一个肽段单独使用更加有效,与强免疫原性的载体蛋白乙肝核心蛋白基因连接,限制因素：,充当抗原抗原决定簇的肽段不能太长，而且要连续,要求肽段的构象必须与完整病毒上的抗原决定簇构象一致,要求选定的单一抗原决定簇必须要有足够强的免疫原性,三、,DNA,免疫,基因免疫、核酸免疫,Wolf,（,1993,）将流感病毒核蛋白,P,抗原基因直接注射到小鼠骨骼肌引起免疫反应，产生多种亚型,T,K,细胞。,目前已经进行的研究：,轮状病毒、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、狂犬病毒、结核杆菌亚单位疫苗等,“裸”,DNA,疫苗,不含肽、蛋白质或病毒载体,，只是由来源于病原体的一个抗原编码基因及作为其载体的质粒,DNA,组成,这段抗原编码基因可在活体细胞中控制合成抗原蛋白，从而引起免疫反应,优越性,DNA,比蛋白质更稳定，,DNA,在制成干粉后可以保存的时间较长,大规模生产比蛋白容易，成本低,任何,DNA,片段都可以插入质粒中制成疫苗，而且在同一质粒上可以同时容纳一个以上的抗原基因,DNA,疫苗对于目前难以用常规疫苗防治的疾病的预防和治疗有重要的意义,用于癌症等疑难疾病治疗,局限性,免疫效力低，剂量越大，所引起的免疫反应越强；,接种在体内的,DNA,的最终下落尚不清楚（有可能最终被细胞内的各种酶所降解，也有可能,DNA,整合入宿主基因组）,