感染性疾病的实验诊断

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2015/7/29,#,感染性疾病的实验诊断,浙江大学医学院附属第一医院,传染病诊治国家重点实验室,杨 青,不适当初始抗菌治疗将导致病死率显著提高,不充分初始治疗,充分初始治疗,A post-antibiotic era,is instead,a very real possibility,for the 21st century-WHO,提高抗感染水平的关键,-,正确的诊断,感染的诊断,感染类型，感染部位,病原体的诊断,获得确切的病原体,耐药性的诊断,耐药菌的种类,耐药机制明确,感染性疾病的实验室诊断,血清学方法,分子生物学方法,培养,直接镜检法,体外药敏试验,病例,1,患者男性，,33,岁，,有,18,年乙肝病史,6.27,患者无明显诱因地出现头痛伴发热，体温最高达,38.7,度，伴全身肌肉酸痛，乏力，胃纳差，恶心,6.30,在杭州某医院就诊，,血常规,：,白细胞,7.410E9/L,，淋巴细胞,3.610E9/L,，超敏,CRP10mg/l,，,拟诊为,“,脑炎,”,，建议患者住院行腰穿，患者拒绝,7.1,来我院就诊，头颅,CT,未见异常,血培养结果成为诊断的关键,7.1,血培养：,马耳他布鲁菌,采血指徵,发热（,38,C,）或低温（,36,C,）、寒战、呼吸快,白细胞增多（计数大于,10,，,000,10,9,/L,，特别有,“,核左移,”,未成熟的或杆状核）、,CRP,升高,皮肤粘膜出血,血压降低、昏迷、多器官衰竭,血液病：粒细胞减少（成熟的多核白细胞,10,5,CFU/ml,，阳性菌,10,4,CFU/ml,1,、有无症状,2,、是否使用抗菌药物,3,、尿是否在膀胱存留3,h,以上,4,、是否为清洁中段尿,5,、是否2,h,之内送检,6,、导尿袋,脓液或创面分泌物,标本应区分浅表、深部或手术切口,皮肤消毒非常关键,开放性损伤，,无菌生理盐水擦洗病灶表面,未溃破的脓肿宜用碘酒、酒精消毒皮肤,取材部位最好为损伤基底部或病变有进展的边缘，不可仅为脓液,涂片评价标本的质量，快速报告,清洁后金葡菌为主,清洁前取样数种凝固酶阴性葡萄球菌,病例,3,患者女，,55,岁，因“肾移植术后半年，反复发热一月余，加剧伴关节痛,6,天”入院。,2,月余前，患者因扭伤右脚踝关节，并出现发热，来我院住院治疗，体温基本正常后出院。,1,月余再次出现发热，入院后予泰能,0.5,克,BID,抗感染治疗,5,天，体温正常出院。患者,1,月前再次出现发热，体温最高达,40,度，再次住院治疗，予以可乐必妥,500mg,静滴抗感染治疗，好转出院。,6,天前，患者无明显诱因下，右侧踝关节疼痛再发，伴有高热，体温最高达,39,，偶有胸闷，,3.26,再次于本院就诊入院,革兰染色：可见有折光性菌体,抗酸染色（,4+,）,血清学诊断方法优点,快速报告结果,敏感性提高,取材简便,多以真菌在致病状态产生的物质为检测标,志物，结果阳性提示有致病性,定量检测可判断感染严重程度及疗效评估,乳胶凝集试验：,以乳胶颗粒作为载体的一种间接凝集试验。即吸附,新型隐球菌荚膜多糖抗原,于其表面，特异性抗体与之结合后，产生凝集反应,胶体金法：,新型隐球菌荚膜多糖抗原检测,阴性,阳性,隐球菌脑膜炎中的应用,李娟等报道墨汁染色涂片诊断隐球菌脑膜炎灵敏度,61.1,（,11/18),脑脊液真菌培养灵敏度,38.9,(7/18),隐球菌抗原检测灵敏度,100,(18/18),，特异度,99.4%(149/150),刘正印等报道墨汁涂片染色阳性,23,例,(23/26,88%),，乳胶凝集试验抗原阳性,20,例,(20/20,，,100%),，培养阳性,8,例,(8/13,62%),大多数研究报道灵敏度,93100%,，特异性,9398%,李娟,吕晓菊,等,.,四川大学学报（医学版）, 2010, 41(6): 1074-1075, 1079,刘正印,王爱霞,等,.,中华内科杂志, 2002, 41(8): 541-543,肺部隐球菌病中 的应用,GM,试验,检测底物：曲霉细胞壁成分半乳甘露聚糖,(,菌丝在组织生长过程中释放,),标本：血清、肺泡灌洗液,方法：,ELISA,双抗体夹心法,cut-off,值：,ODI 0.5,两次,ODI 0.5,或一次,ODI 0.7,提高阳性预测值,GM,试验的临床价值,血清,GM,推荐用于恶性血液肿瘤患者和造血干细胞移植患者（未进行抗真菌治疗）早期诊断,非粒缺、实体器官移植（,SOT,）、,ICU,患者、已开始抗真菌治疗，建议同时测定,BALF GM,半乳甘露聚糖水平的动态变化反应抗真菌药物疗效，指导抗真菌药物使用,47,假阳性,哌拉西林,/,他唑巴坦、阿莫西林、阿莫西林,/,克拉维酸,与真菌成分有交叉反应 （组织胞浆菌、皮炎芽生菌、青霉、镰刀霉、头状地霉等）,谷类食物中的,GM,抗原经肠道入血，化疗并且出现严重黏膜炎的患者更容易发生这种吸收,G,试验,检测底物,：,(1-3)-D-,葡聚糖,(,真菌细胞壁成分,50%),标本：血清（无热源采血管），,3h,内送检,方法：比浊法或比色法,cut-off,值：不同试剂盒不同,G,试验可检测念珠菌、毛孢子菌、曲霉、镰刀霉、支顶孢霉、卡氏肺孢子菌，不能检测隐球菌、接合菌,G,试验的临床价值,目前主要用于侵袭性念珠菌和曲霉感染的诊断、高危人群的监测以及对疗效、预后的评价,对于区分确诊或拟诊侵袭性真菌感染与非侵袭性真菌感染患者，有良好的准确性,连续检测可动态反应真菌感染程度和抗真菌治疗疗效,50,假阳性,污染（试管、枪头、蒸馏水）,血液透析、腹膜透析（纤维素膜透析）,外科手术使用纱布,抗肿瘤多糖,静脉制剂（白蛋白、免疫球蛋白、凝血因子）,51,动态监测,临床应用,WBC,白细胞计数,Endotoxin,内毒素,IL-6,白介素,-6,IL-10,白介素,-10,TNF,肿瘤坏死因子,Procalcitonin,降钙素原,CRP C,反应蛋白,Protein C,HMG-1,sTREM-1,.,选择合适血清学指标，帮助临床判断感染的类型、严重程度及疗效,依据生理生化特征进行鉴定的传统方法面临很多的困难,费时，对于分枝杆菌、厌氧菌等需要更长时间,广谱抗菌药物的使用极大降低了培养的阳性率,苛养和少见细菌感染增加,常规的自动化鉴定仪鉴定菌种范围有限，有时无法准确鉴定到种,分子生物学技术在临床的应用,基于基因扩增及测序技术的快速鉴定,蛋白质谱对可培养病原菌的快速鉴定,16S rRNA,序列测定,已成为,疑难病原菌检测和鉴定,的常用方法,Xpert,MTB/RIF,Xpert MTB/RIF,核酸检测采用,Cepheid,公司,GeneXpert,检测系统，是一种半巢式实时荧光定量,PCR,体外诊断技术，针对,rpoB,基因,81bp,利福平耐药核心区间（,RRDR,）设计引物、探针，检测其是否发生突变，进而用于诊断患者是否结核以及是否对利福平耐药（,rpoB,序列存在突变）。,可同时检测患者是否结核以及是否对利福平耐药,对涂阴培阳病人具有非常高的敏感性和特异性,两小时内即可得到检测结果，所用仪器设备简单,HIV,患者,Tspot,结果阴性,GeneXpert,检测系统,分枝杆菌菌种鉴定及耐药性检测（芯片法）,病例,4,患者男性，,72,岁，,3,月前无明显诱因出现咳嗽咳痰，检查,“,痰找抗酸杆菌,+,”，“,CT,两中肺结核,右下肺、左下肺炎”，当地医院诊断,“,肺结核,”,，给予,“,异烟肼,乙胺丁醇,利福平,”,抗结核治疗,20,天后，出现药物性肝损，护肝降酶治疗效果不佳，,TBIL,进行性升高，,2011.4.14,“TBIL275.4umol/l”,5.16,痰找抗酸杆菌,抗酸杆菌？,结核杆菌？,非结核分支杆菌？,奴卡菌？,痰培养：,16sRNA PCR,证实,为鼻疽奴卡菌,痰结核菌培养,基因芯片杂交,结核分支杆菌阴性,鸟分支杆菌阳性,鸟分支杆菌的治疗,对异烟肼（,INH,）及吡嗪酰胺（,PZA,）耐药,每周三次给药：克拉霉素或阿奇霉素，利福平、,乙胺丁醇，加或不加阿米卡星，治疗,6,个月,Agns Ferroni,et al,JCM,2010,A. Bizzini,et al,JCM,2010,基质辅助激光解析电离,-,飞行,时间质谱法,MALDI-TOF MS,原理,：,用,特异性的多肽、蛋白,质,谱进行,菌种,鉴定,优势,：,快速,：,20min,之内即可得到结果，是现有方法中,最快的阳性血培养鉴定,法、纯菌株大约,10,分钟,高特异性和敏感性,：接近,100%,对部分混合感染,样本的,准确,鉴定,不足,：,多报道用于鉴定细菌,，酵母菌及分枝杆菌,需要建立严格的标准数据库体系进行比对分析,应用,范围,：,纯培养菌株、或报警,阳性的血培养瓶,检测,病例,5,男,性,，,50,岁，,因,“,咳嗽咳痰伴左颊部溃疡,3,月,”,入院,病例特点,：,3,月前患者无明显诱因下出现阵发性咳嗽咳痰,，继而,出现恶心呕吐，伴有乏力,当地,CT,：,两肺多发感染，两肺多发性弥漫粟粒及小结节影，纵膈、肺门淋巴结多发钙化,。,当地,血培养提示杰氏棒状杆菌，痰培养提示,洛,非不动杆菌,。,左下肺穿刺病理提示化脓性肉芽肿性炎（,PAS+,，六胺银,+,，形态首先考虑真菌感染）,两肺多发团块、结节、粟粒样病灶，以炎性病变（真菌感染）伴左侧胸腔积液首先考虑,血,培养,痰培养,常规方法鉴定为杰克棒状杆菌或洛非不动杆菌,质谱仪鉴定为,马红球菌,谢谢聆听，请批评 指正！,