实验四 肝脏DNA的提取

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验四 肝脏,DNA,的提取,指导教师：龚熹,1,核酸,是具有重要生物化学功能的生物大子，最初从细胞核分离出来，又具有酸性，故称为核酸。,脱氧核糖核酸,(deoxyribonucleic acid, DNA),细胞核,遗传信息的携带者,2,核糖核酸,(ribonucleic acid, RNA),细胞,质,蛋白质的生物合成，表达调控,3,DNA,的一般提取步骤：,生物材料的选择,从各种材料中提取,DNA,方法不同，分离提取的难易程度也不同。 对于低等生物。由于,DNA,分子量较小，提取时易保持其结构完整性。 细菌及高等动植物中，,DNA,分子量较大，易被机械张力剪断。,4,细胞的破碎,机械法,物理法,化学破碎方法,酶学破碎方法,5,细胞器的分离,在提取细胞线粒体和叶绿体,DNA,时，必须首先把线粒体和叶绿体与其它细胞器分离出来，一般采取在适当介质中的差速离心法分离。,6,DNA,的提取,去除蛋白质：酚、氯仿,去除多糖、脂类：高盐,抑制,DNase,活性：去污剂，如,SDS,、,CTAB,DNA,的沉淀：乙醇或异丙醇,7,DNA,的纯化,有机溶剂抽提,柱层析法,梯度离心法,酶温和消化杂质等,8,DNA,提取的几种方法,：,浓盐法,利用,RNP,和,DNP,在电解溶液中溶解度不同，将二者分离。,阴离子去污剂法,由于细胞中,DNA,与蛋白质之间常借静电引力或配位键相结合，,SDS,或二甲苯酸钠等阴离子,去污剂能使蛋白质发生变性,从而破坏这种价键，因此可以采用阴离子去污剂提取,DNA,。,此法可以,直接,从生物材料中提取,DNA,。,9,苯酚抽提法,苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了,DNase,的降解作用,.,用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与,DNA,联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。,蛋白分子溶于酚相,，而,DNA,溶于水相,。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含,DNA,的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀,DNA,。,此法的特点是使提取的,DNA,保持天然状态,。,10,实验目的：,掌握从动物组织中提取、分离、纯化,DNA,的基本原理及操作方法。,学习,DNA,提取的一般知识；,11,实验原理：,在细胞核内，核酸通常是与某些组织蛋白质结合成复合物，即以脱氧核糖核蛋白（,DNP,）和核糖核蛋白（,RNP,）的形式存在。,12,在提取时，通常采用,0.14 mol/L,的盐溶液来除去,RNP,，使,DNP,仍保持在,沉淀,中，然后使用浓盐溶液来提取,DNP,。,在不同浓度的盐溶液中，,RNP,与,DNP,的溶解度有很大的差别。,核蛋白,0.14mol/LNaCl,1.0mol/LNaCl,RNP,溶解度大,溶解度小,DNP,溶解度小,（仅为水中,1%,）,溶解度大,(,比在水中大,2,倍,),13,利用去污剂使与,DNA,结合的蛋白质,变性,，而与,DNA,分离，本实验使用的去污剂是,SDS,；,利用蛋白质,不溶,于氯仿,-,异丙醇 ，而,DNA,却溶解于其中的性质，将蛋白质除去；,DNA,不溶,于酒精溶液，但细胞中的某些物质则可以溶于酒精。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的,DNA,。,14,实验材料、试剂与器材：,实验材料：新鲜猪肝,试剂,1,）溶液,A 0.14 mol/L NaCl-0.15 mol/L EDTA-Na2,。,2,）溶液,B 0.015 mol/L NaCl-0.0015 mol/L,柠檬酸三钠。,3,）溶液,C 1.5 mol/L NaCl-0. 15 mol/L,柠檬酸三钠。,4,）溶液,D 3 mol/L,乙酸钠,-0.001 mol/L EDTA-Na2,。,5,）,5mol/L NaCl,。,6,）,250g/L SDS,。,7,）氯仿：异丙醇,=24,：,1,（,V/V,）。,8,）乙醇（,70%,、,80%,、,95%,、无水）。,15,2.,器材,匀浆器或研钵研杆,移液枪,离心机,天平,恒温水浴箱,玻璃棒,解剖剪及镊子,50ml,离心管等,16,离心前请两两离心管配平，对称放置。,17,旋转拇指按钮设置吸取溶液的体积值，数字要完整地出现在显示窗中；, 套上枪头，旋紧；, 垂直持握可调式移液器用大拇指按至第一档；, 将枪头插入溶液，徐徐松开大拇指，使其复原；, 将可调式移液器移出液面，必要时可用纱布或滤纸拭去附于枪头表面的液体,(,注意,:,不要接触枪头孔口,),；, 排放时，重新将大拇指按下，至第,档后，继续按至第二档以排空液体。,注意： 移取另一样品时，按卸尖按钮弃掉吸头并更换新吸头。,旋转按钮设置体积时，绝对不能超过每个移液器的最大值，扭过头。,18,1.,将肝脏置于研钵中，捣碎，并加入,5ml,的溶液,A,。制成匀浆后，置于,50ml,离心管中，,5000rpm,离心,8min,。,2.,弃上清，加入溶液,A 4ml,，然后滴加,250g/L SDS,溶液,0.3ml,，边加边用玻棒搅拌。,3.,加完后，置于,60,水浴保温,5min,（不停搅拌），取出冷至室温。,4.,加入,5mol/L NaCl,溶液,1.0ml,，搅拌,5min,，加入约一倍体积氯仿：异丙醇,=24,：,1,混合液，即,5.3ml,，振摇,5min,，离心,8min,（,5000r/min,）。小心吸取上清液至一干净的,50ml,离心管中，记下体积，然后加入,1.5,倍体积,95%,乙醇，边加边用玻璃棒缓慢缠绕，,DNA,丝状物即缠在玻璃棒上。,操作步骤：,19,5.,将,DNA,粗制品置于溶液,B 2.7ml,中，再加入溶液,C 0.3ml,，搅匀，加入,1,倍体积氯仿：异丙醇,=24,：,1,混合液即,3ml,，振摇,5min,，离心,8min,（,5000r/min,），取上清，加入,1.5,倍体积,95%,乙醇，,DNA,即沉淀析出。离心,8min,（,5000r/min,），弃上清，沉淀为粗,DNA,。,6.,将上步所得沉淀物溶于溶液,B,中，加入溶液,D 0.3ml,，搅匀。再加入氯仿：异丙醇,=24,：,1,混合液,1.6ml,，振摇，再加入,1,倍体积的,95%,乙醇，边加边搅，取出丝状物,DNA,。,20,注意事项：,尽量简化操作步骤，缩短提取过程；,减少化学因素对核酸的降解 ；,减少物理因素对核酸的降解；,防止核酸的生物降解。,21,思考与作业：,依次说明提取过程中所用的各种试剂在试验中的作用。,本实验中哪些因素不利于,DNA,分子的完整获得？,22,