生物技术制药第2版 疫苗及其制备技术

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第五章 疫苗及其制备技术,疫苗（,Vaccine,）,传统概念：将,病原微生物（细菌、病毒、真菌等）及其代谢产物,，经过,人工减毒,、,灭活,或利用,基因工程,等方法制成的用于,预防传染病,的免疫制剂。,世界卫生组织的扩大免疫措施（,EPI,）,儿童免疫程序表,、成人,现代疫苗：,治疗性疫苗,、,非感染性疾病疫苗,疫苗学（,Vaccinology,）,本章学习要求,掌握,：疫苗、基因工程疫苗、联合疫苗的概念及常见疫苗的制备技术,熟悉,：疫苗的原理、类型、特点及主要用途,了解,：疫苗发展的历程与趋势、疫苗产业的特点与应用,本章内容,概述,疫苗的组成、作用原理、类型与特点,疫苗的制备方法,疫苗生产的质量控制,疫苗产业的特点及应用概况,第一节 概述,一、疫苗的产生,“,12,世纪，中国开始用人痘接种预防天花”,疫苗可预防疾病的流行病学与预防学,第,6,版，美国疾病控制与预防中心（,CDC,）,2000,年出版,一、疫苗的产生,天花（,Smallpox,）,由,天花病毒,引起的一种烈性传染病,天花病毒,：呈砖形，能对抗干燥和低温，在痂皮、尘土和被服上可生存数月至一年半之久,临床表现,：主要为严重毒血症状、皮肤成批依次出现斑疹、丘疹、疱疹、脓疱，最后结痂、脱痂，遗留痘疤。,传播途径,：飞沫吸入或直接接触。,特点,：发展迅速，未免疫人群感染后,15-20,天内致死率高达,30,。,一、疫苗的产生,天花的防治,中国,宋真宗时期（,998- 1023,年） ：人痘法，吸入天花病人痂粉预防天花。,明朝隆庆年间（,1567-1572,年）：痘衣法、痘浆法、旱痘法和水苗法等多种接种方法出现。,清朝顺治死于天花，得过天花的康熙继位,人痘法的,缺点,：有时也会引起严重的天花,一、疫苗的产生,天花的防治,欧洲,1721,年，人痘接种法传入英国,1796,年，英国医生,E. Jenner,利用牛痘防治天花,1798,年，医学界正式承认“疫苗接种确实是一种行之有效的免疫方法”。,细胞培养法获得天花病毒,牛痘苗,一、疫苗的产生,疫苗之父,-,法国免疫学家,Louis Pasteur,鸡霍乱弧菌减毒株,（第一个细菌减毒活疫苗）,一、疫苗的产生,巴斯德与狂犬病疫苗,异体传代法：将狂犬病毒在兔体内经连续传代，获得了,减毒株,一、疫苗的产生,巴斯德在疫苗领域的卓越贡献,细菌的分离培养技术,减毒菌株的获得,连续传代培养法,高温培养法,异体传代法,巴氏减毒菌苗,的发明：为实验免疫学建立了基础,二、疫苗及其技术的发展简史,（一）减毒活疫苗技术,第一次疫苗革命,（二）基因重组疫苗技术,第二次疫苗革命,（三）反向疫苗学技术,第三次疫苗革命,二、疫苗及其技术的发展简史,（一）减毒活疫苗技术,细胞水平,人为处理使病原微生物失去毒力或降低毒力,例：卡介苗（,Bacillus Calmette-Gurin, BCG,，使用活的无毒牛型结核杆菌制成,）、,炭疽疫苗、狂犬疫苗,二、疫苗及其技术的发展简史,药物毒理：,结核菌是细胞内寄生菌,细胞免疫,用无毒卡介菌（结核菌）人工接种进行初次感染，经过巨噬细胞的加工处理，将其抗原信息传递给免疫活性细胞，使,T,细胞分化增殖，形成致敏淋巴细胞，当机体再遇到结核菌感染时，巨噬细胞和致敏淋巴细胞迅速被激活，执行免疫功能，引起,特异性免疫反应,。,二、疫苗及其技术的发展简史,（二）基因重组疫苗技术,分子水平,基因重组技术研究相关基因和蛋白质产物,例：乙肝疫苗（乙型肝炎表面抗原）,二、疫苗及其技术的发展简史,血源乙肝疫苗,：无症状,HBsAg,携带者血浆提取的,HBsAg,，经纯化，灭活及添加佐剂制成。,基因重组（转基因）乙肝疫苗,：利用转基因技术，构建含有乙肝病毒,HBsAg,基因的重组质粒，转入酵母（或重组,CHO,细胞）表达乙型肝炎表面抗原，在繁殖过程中产生未糖基化的,HBsAg,多肽，经破碎酵母菌体，颗粒形未糖基化的,HBsAg,多肽释放，经纯化，灭活，添加佐剂制成。,二、疫苗及其技术的发展简史,基因工程技术在疫苗领域应用,构建无毒或减毒疫苗：毒素基因突变,构建载体活疫苗：目的基因克隆至临床常规使用的活疫苗中,二、疫苗及其技术的发展简史,（三）反向疫苗学技术,蛋白质水平,全基因水平筛选具有保护性免疫反应的候选抗原,具体步骤：,1.,基因组信息分析结合基因芯片筛选候选疫苗成分,2.,高通量基因重组表达候选疫苗蛋白成分,3.,免疫保护性测试,二、疫苗及其技术的发展简史,例：,B,型脑膜炎球菌（,meningococcus B,）,先用计算机分析,B,型脑膜炎球菌的基因组，找到,600,个潜在的疫苗候补，将其中,350,个在大肠杆菌中进行表达，然后将蛋白提纯用于免疫小鼠，其中找到,29,个蛋白能诱导小鼠产生抗体，从而达到预防免疫的作用,。,第二节 疫苗的组成、作用原理、类型与特点,一、疫苗组成,抗原,佐剂,防腐剂,稳定剂,灭活剂,缓冲液、盐类等非活性成分,一、疫苗组成,1.,抗原（,antigen,，,Ag,）,疫苗最主要的有效活性成分,免疫原性（,immunogenicity,）,：刺激机体特异性免疫细胞活化、增殖、分化并产生免疫效应物。,免疫反应性（,immunoreactivity,）,：与免疫效应物发生特异性结合而产生免疫反应。,一、疫苗组成,常用抗原包括：,灭活病毒或细菌,活病毒或细菌（减毒株）,病毒或菌体提纯物,有效蛋白成分,类毒素,细菌多糖,合成多肽,核酸,2.,佐剂（,adjuvant,）,非特异性增强抗原免疫应答或改变免疫应答类型的物质。,要求：安全无毒、 在非冷藏条件下稳定,作用机制：改变抗原的物理形状，延长抗原在机体内保留时间,刺激单核巨噬细胞对抗原的递呈能力,刺激淋巴细胞分化，增加扩大免疫应答能力,一、疫苗组成,一、疫苗组成,常用佐剂：,用于人体：铝佐剂,/ MF59,（水包油的乳剂）,动物试验：弗氏完全佐剂（,FCA,）,/,弗氏不完全佐剂（,FIA,）,3.,防腐剂,大多数的,灭活疫苗,都使用防腐剂,目的,：防止外来微生物的污染,常用： 硫柳汞,2-,苯氧乙醇,氯仿,副作用,： 接触性皮炎、变应性结膜炎、耳毒性,一、疫苗组成,4.,稳定剂,目的,：保证作为抗原的病毒或其他微生物存活，并保持免疫原性,冻干疫苗,中常用：乳糖、明胶、山梨醇等。,一、疫苗组成,5.,灭活剂,灭活病毒或细菌抗原的方法：,物理方法,（如加热、紫外线照射等）,化学方法,（丙酮、酚、甲醛等）,对人体有一定毒害作用，因此在灭活抗原后必须及时从疫苗中,除去,，并经严格检定以保证疫苗的安全性。,一、疫苗组成,6.,缓冲液、盐类,缓冲液的,种类,、盐类的,含量,都可影响疫苗的效力、纯度和安全性，因此都有严格的质量标准,一、疫苗组成,二、疫苗作用原理,当机体经过口服或注射等途径接种疫苗后，其中的抗原分子刺激机体免疫系统产生高效价特异性的免疫保护物质,当机体再次接触到相同病原菌抗原时，免疫系统依循免疫记忆，迅速制造出保护物质来阻断病原菌的入侵，从而使机体获得针对病原体特异性的免疫力，使其免受侵害而获得保护。,三、疫苗的类型与特点,（一）减毒活疫苗,（二）灭活疫苗,（三）亚单位疫苗,（四）联合疫苗,（五）核酸疫苗,（六）治疗性疫苗,三、疫苗的类型与特点,（一）减毒活疫苗,（,live attenuated vaccine,）,通过一定方法使病原体的,致病性减弱或丧失,后获得的由,完整微生物,组成的疫苗制品,特点：能引发机体感染但不发生临床症状，但其免疫原性可引发机体免疫反应，刺激机体产生特异性的记忆,B,细胞和记忆,T,细胞，起到获得长期或终生保护的作用。,三、疫苗的类型与特点,优点：,接种次数少，反应小，免疫效果好（体液免疫、细胞免疫、黏膜免疫），成本低,缺点：,稳定性差，有毒力返祖现象，污染环境，免疫缺陷者不能接种,三、疫苗的类型与特点,三、疫苗的类型与特点,（二）灭活疫苗,（,inactivated vaccine,）,将病原体经培养增殖、,灭活,、纯化处理后获得的保留,病原体几乎全部组分,的疫苗制品。,特点：失去了病原体的感染性，但保留了较强的免疫原性和较好的安全性,三、疫苗的类型与特点,优点：,稳定性好，反应小，免疫缺陷者也可接种,缺点：,需多次接种，免疫效果较差（体液免疫），需要量大,三、疫苗的类型与特点,三、疫苗的类型与特点,（三）亚单位疫苗,（,subunit vaccine,）,利用微生物的,某种表面结构成分,制成的能诱发机体产生抗体的疫苗制品。,分类：,纯化亚单位疫苗：单个蛋白或寡糖组成、佐剂,合成肽亚单位疫苗：抗病毒,/,肿瘤,/,细菌、寄生虫感染,基因工程亚单位疫苗,三、疫苗的类型与特点,基因工程亚单位疫苗（,genetic engineering subunit vaccine,）,在分离出病原体特异抗原编码基因的基础上，将外源基因转入非致病性微生物内表达产物，然后通过分离纯化获得的特异蛋白质。,原核细胞（大肠杆菌）、真核细胞（酵母）,活载体疫苗（细菌、病毒）、转基因植物疫苗,三、疫苗的类型与特点,三、疫苗的类型与特点,（四）联合疫苗,（,combined vaccine,）,两种或两种以上抗原物理混合后制成的疫苗制剂。,多联疫苗（,multi-combined vaccine,）,：预防不同病原微生物引起的传染病（例：百白破）,多价疫苗（,multivalent vaccine,）,：预防由同一病原微生物不同亚型引起的传染病（例：,23,价肺炎多糖疫苗）,三、疫苗的类型与特点,三、疫苗的类型与特点,（五）核酸疫苗,（,nucleic acid vaccine,）,也称基因疫苗（,genetic vaccine,），包括,DNA,疫苗和,RNA,疫苗。,由,抗原的编码基因,和,载体,组成，,导入机体细胞后可通过宿主细,胞的转录系统表达蛋白抗原，,诱导宿主产生细胞和体液免疫应答的疫苗制剂。,三、疫苗的类型与特点,DNA,疫苗（,DNA vaccine,）,将编码外源性抗原的基因插入到含真核表达系统的质粒上，导入宿主细胞内表达抗原蛋白，诱导机体产生免疫应答。,特点：免疫效果好，制备方便，可重复使用，可用于免疫治疗和联合免疫,三、疫苗的类型与特点,三、疫苗的类型与特点,（六）治疗性疫苗,（,therapeutic vaccine,）,在已感染病原微生物或已患有某些疾病的机体中，通过诱导特异性的免疫应答，达到治疗或防止疾病恶化的疫苗制品。,最早的治疗性疫苗：狂犬病疫苗,三、疫苗的类型与特点,1.,基于组成成分及性质的分类,（,1,）蛋白质复合重构的治疗性疫苗,改造,靶抗原的结构或组合,，使其相似而又有异于传统疫苗的靶抗原，重新唤起患者的,功能性免疫应答,，进而打破和逆转患者的免疫耐受状态。,改造方法：蛋白修饰，结构,/,构型改造，蛋白复合,/,多肽偶联,三、疫苗的类型与特点,（,2,）基因疫苗,DNA,疫苗：埃博拉（,Ebola,）疫苗、乙型肝炎（,HBV,）疫苗、丙型肝炎（,HCV,）疫苗、人免疫缺陷病毒（,HIV,）疫苗等,RNA,疫苗：,RNA,修饰的树突状细胞（,DC,）疫苗等,三、疫苗的类型与特点,（,3,）多水平基因修饰细胞疫苗,肿瘤治疗性疫苗：肿瘤细胞,/DC,细胞疫苗,制备过程：,三、疫苗的类型与特点,2.,基于治疗疾病种类的分类,（,1,）感染性疾病的治疗性疫苗,（,2,）肿瘤治疗性疫苗,（,3,）自身免疫性疾病的治疗性疫苗,（,4,）移植用治疗性疫苗,三、疫苗的类型与特点,三、疫苗的类型与特点,预防性疫苗,治疗,性疫苗,病原体蛋白,不需改造,需经分子设计和重新构建,受用者,健康人体,患者,监测手段,保护性抗体产生情况,疾病改善情况,激发免疫应答类型,体液免疫为主,细胞免疫为主,第三节 疫苗的制备方法,灭活全毒疫苗,流感全病毒灭活疫苗,减毒活疫苗,皮内注射用卡介苗,基因工程重组亚单位疫苗,重组乙型肝炎疫苗,生化提取亚单位组分疫苗,吸附破伤风疫苗,治疗性疫苗,前列腺癌疫苗,Sipuleucel-T,疫苗生产的一般流程,一、,灭活全毒疫苗,流感全病毒灭活疫苗（,inactiated influenza whole virion vaccine,）,本品系用世界卫生组织（,WHO,）推荐的并经国家食品药品监督管理局批准的,流感病毒株,，分别接种,鸡胚,，经,培养、收获病毒液，病毒灭活、浓缩和纯化,后制成。,用于预防,本株病毒,引起的流行性感冒,一、,流感全病毒灭活疫苗（,inactiated influenza whole virion vaccine,）,Theinfluenza vaccine is an,annual vaccination,using a vaccine that is specific for a given year to protect against the highly variable,influenza virus,.,Each seasonal influenza vaccine contains antigens representing three (,trivalent vaccine,) or four (,quadrivalent vaccine,) influenzavirus strains: two influenza type A virus strains, and either one or two influenza type B virus strains.,流感病毒,甲型流感病毒,（Influenza A virus）,最,容易,发生变异（抗原转变、抗原漂移）,世界性流感大流行：甲型流感病毒出现,新亚型,或,旧亚型重现,引起,甲型流感病毒根据,H,(hemagglutinin,，血凝素,),和,N,(neuraminidase,，神经氨酸酶,),抗原不同分为许多亚型，,H,有,17,个亚型（,H1,H17,），,N,有,10,个亚型（,N1,N10,）。,H1,、,H5,、,H7,亚型为高致病性,流感病毒,乙型流感病毒,（Influenza B virus）,抗原变异,很慢,局限性流行,，对人类致病性较低,丙型流感病毒,（Influenza C virus）,抗原,稳定,致病力较弱，主要侵犯,幼儿和免疫力低下的人群,，只引起人类不明显的或轻微的上呼吸道感染,一、,流感全病毒灭活疫苗（,inactiated influenza whole virion vaccine,）,Influenza vaccines may beadministeredas an,injection,or as a,nasal spray,.,The U.S.Centers for Disease Control and Prevention recommend that everyone,over the ages of 6 months,should receive the seasonal influenza vaccine.,Vaccination campaignsusually focus on people who are at,high risk ofserious complicationsif they catch the flu, such as the elderly and people living with chronic illnessor those withweakened immune systems, as well as health care workers.,一、流感全病毒灭活疫苗（,inactiated influenza whole virion vaccine,）,（一）制备方法,1.,生产用原材料,鸡胚是,分离各类病毒,的较为理想的材料,尿囊腔,一、流感全病毒灭活疫苗（,inactiated influenza whole virion vaccine,）,（,1,）鸡胚,毒种传代和制备：来源于,SPF,（,Specific pathogen Free,）鸡群,疫苗生产：来源于封闭式房舍内饲养的健康鸡群、,9-11,日龄无畸形、血管清晰、活动,（,2,）毒种,WHO,推荐并提供的甲型和乙型流感病毒株,一、流感全病毒灭活疫苗（,inactiated influenza whole virion vaccine,）,2.,毒种种子批的建立及检定,符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”规定,一、流感全病毒灭活疫苗（,inactiated influenza whole virion vaccine,）,2.,毒种种子批的建立及检定,建立,：以毒种为基础传代（,5,代以内,得成品疫苗）,血凝素型别鉴定试验,血凝抑制试验,单向免疫扩散试验,病毒滴度：鸡胚半数感染剂量法,血凝滴度：血凝法,无菌检查、支原体检查,外源性禽白血病病毒、禽腺病毒检测：,ELISA,保存,：冻干毒种,-20,以下，液体毒种,-60 ,以下,检定,一、流感全病毒灭活疫苗（,inactiated influenza whole virion vaccine,）,3.,单价原液的制备,各流感病毒工作种子批,分别,接种,（,尿囊腔,），,33-35,培养,48-72h,病毒收获（,尿囊液,）,收获液检定,微生物限度：菌数,10,5,CFU/ml,，沙门氏菌为阴性,血凝滴度,收获液合并,一、流感全病毒灭活疫苗（,inactiated influenza whole virion vaccine,）,3.,单价原液的制备,病毒灭活（,甲醛,200,g/ml,）、验证及内毒素含量测定,浓缩（,超滤,）、纯化（,柱色谱法、蔗糖密度区带离心,）及过滤除菌（,硫柳汞,）,单价原液保存（,2-8,）,一、流感全病毒灭活疫苗（,inactiated influenza whole virion vaccine,）,4.,半成品的制备,对单价原液根据,相同血凝素含量,进行配制：,15-18,g/,剂,补加硫柳汞,5.,成品的制备,半成品,分批、分装及冻干后包装,：剂，含各型流感病毒株血凝素为,15,g/,剂,一、流感全病毒灭活疫苗（,inactiated influenza whole virion vaccine,）,（二）检定要求,1.,单价原液的检定,鉴别试验：血凝抑制试验、单向免疫扩散试验,病毒灭活验证试验：鸡胚存活率、血凝试验,血凝素含量检测：单向免疫扩散试验,一、流感全病毒灭活疫苗（,inactiated influenza whole virion vaccine,）,2.,半成品的检定,游离甲醛含量,50,g/,剂,硫柳汞含量,50,g/,剂,血凝素含量：配制量的,80%-120%,无菌检查,一、流感全病毒灭活疫苗（,inactiated influenza whole virion vaccine,）,3.,成品的检定,鉴别：单向免疫扩散试验,外观：乳白色液体，无异物,pH,值：,硫柳汞含量,50,g/,剂,蛋白质含量,200,g/,剂,血凝素含量：配制量的,80%-120%,卵清蛋白含量,250 ng/,剂,抗生素残留量,50 ng/,剂,一、流感全病毒灭活疫苗,（,inactiated influenza whole virion vaccine,）,二、减毒活疫苗,皮内注射用卡介苗（,BCG vaccine for intradermal injection,）,本品系用,卡介菌,经培养后，,收集菌体，加入稳定剂冻干,制成,二、皮内注射用卡介苗（,BCG vaccine for intradermal injection,）,（一）基本要求,生产车间、设备及器具专用,制造、包装过程避光,工作人员：身体健康、无结核病,二、皮内注射用卡介苗（,BCG vaccine for intradermal injection,）,（二）制备方法,1.,生产用菌种：,符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”规定,卡介菌,D,2,PB 302,菌株,二、皮内注射用卡介苗（,BCG vaccine for intradermal injection,）,2.,种子批的建立及检定,(12,代,),培养特性：菌落特征（多皱、微黄菌膜）,毒力试验（豚鼠腹腔注射）：体重不减轻，解剖观察,无有毒分枝杆菌试验（豚鼠皮下注射）：体重不减轻，解剖观察,免疫力试验（豚鼠皮下注射）：解剖分析,保存：冻干，,8 ,以下,二、皮内注射用卡介苗（,BCG vaccine for intradermal injection,）,3.,原液的制备,生产用种子：工作种子批,生产用培养基：液体苏通培养基等,接种与培养：,37-39,静止培养,收获和合并：收集,菌膜,，压干，研磨，加入,稳定剂,稀释,二、皮内注射用卡介苗（,BCG vaccine for intradermal injection,）,4.,半成品的制备,稳定剂稀释：,5.,成品的制备,分装、冻干、封口保存,二、皮内注射用卡介苗（,BCG vaccine for intradermal injection,）,（三）检定要求,1.,原液检定,纯菌检查：涂片镜检,浓度测定：参照标准品，分光光度法检测,2.,半成品的检定,沉降率测定：静置，分光光度法检测,活菌数测定,1.010,7,CFU/mg,活力测定：,XTT,法,二、皮内注射用卡介苗（,BCG vaccine for intradermal injection,）,3.,成品的检定,鉴别试验：,抗酸染色涂片,外观：白色疏松体或粉末状，加水成均匀悬液,水分,3.0%,效力测定（豚鼠皮下注射）：局部硬结反应,活菌数测定,1.010,6,CFU/mg,无有毒分支杆菌试验（豚鼠皮下注射）：体重不减轻，解剖观察,热稳定性试验：,37 ,放置,28,天，计算活菌率,三、基因工程亚单位疫苗,重组乙型肝炎疫苗（,recombinant Hepatitis B vaccine,）,由,重组酵母细胞,表达的,乙型肝炎表面抗原,，经,纯化、灭活及加入佐剂吸附,制成。,三、重组乙型肝炎疫苗（,recombinant Hepatitis B vaccine,）,（一）制备方法,1.,生产用菌种：,基因重组构建的表达,HBsAg,的重组酿酒酵母原始菌种,三、重组乙型肝炎疫苗（,recombinant Hepatitis B vaccine,）,2.,种子批的建立及检定,符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”规定,建立：原始菌种传代,培养物纯度：无,细菌,和,其他真菌,检出,HBsAg,基因序列测定,检定 质粒保有率：平板复制法,活菌率：血细胞计数板,抗原表达率：蛋白质含量、,HBsAg,含量,保存：工作种子批,-70,保存，其余液氮保存,三、重组乙型肝炎疫苗（,recombinant Hepatitis B vaccine,）,3,.,原液的制备,发酵：锥形瓶、种子罐、生产罐三级发酵,纯化：细胞破碎（,Triton X-100,） 、硅胶吸附、疏水色谱纯化、硫氰酸盐处理、稀释、过滤除菌,保存：,2-8 ,，不超过,3,个月,三、重组乙型肝炎疫苗（,recombinant Hepatitis B vaccine,）,4.,半成品的制备,甲醛处理：,100,g/ml,铝吸附,配制：与铝佐剂等量混合,5.,成品的制备,分批、分装及冻干后包装,三、重组乙型肝炎疫苗（,recombinant Hepatitis B vaccine,）,（二）检定要求,1.,原液检定,特异蛋白带：,SDS-PAGE,，,20-25kD,蛋白带,N-,端氨基酸序列测定：氨基酸序列分析仪,纯度：,免疫印迹法,、,高效液相色谱法,2.,半成品的检定,吸附完全性,95%,硫氰酸盐含量,g/ml,Triton X-100,含量,g/ml,三、重组乙型肝炎疫苗（,recombinant Hepatitis B vaccine,）,3.,成品的检定,鉴别试验：,ELISA,外观：乳白色混悬液,pH,值：,铝含量,:0.35-0.62 mg/ml,四、生化提取亚单位组分疫苗,吸附破伤风疫苗（,adsorbed tetanus vaccine,）,本品系采用,破伤风梭状芽孢杆菌,，在适宜的培养基中培养后,提取破伤风毒素蛋白,经,甲醛脱毒、精制，加入氢氧化铝佐剂,制成。,四、吸附破伤风疫苗（,adsorbed tetanus vaccine,）,（一）制备方法,1.,生产用菌种：产毒效价高、免疫力强的破伤风梭状芽孢杆菌,四、吸附破伤风疫苗（,adsorbed tetanus vaccine,）,2.,种子批的建立及检定,符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”规定,建立：原始菌种传代,培养特性：,专性厌氧菌,、培养观察,染色镜检：,革兰氏染色,检定 生化反应：不发酵糖类、不还原硝酸盐等,产毒试验,(,小鼠皮下注射,),：观察症状,特异性中和试验,(,小鼠皮下注射,),：观察症状,保存：,2-8,四、吸附破伤风疫苗（,adsorbed tetanus vaccine,）,3.,类毒素原液的制备,毒素的获得：微生物培养，离心上清，除菌过滤,脱毒（甲醛）及检定（豚鼠皮下注射）：体重、症状,精制：等电点沉淀、盐析、超滤等，加,硫柳汞,保存：,2-8 ,四、吸附破伤风疫苗（,adsorbed tetanus vaccine,）,4.,半成品的制备,佐剂配制：氢氧化铝,吸附类毒素的配制：,7-10 Lf/ml,5.,成品的制备,分批、分装、冻干后包装,四、吸附破伤风疫苗（,adsorbed tetanus vaccine,）,（二）检定要求,1.,类毒素原液检定,pH,值：,纯度：,1500Lf/mg,蛋白氮,特异性毒性检查（豚鼠皮下注射）：体重、症状,毒性逆转实验（豚鼠皮下注射）：体重、症状,2.,半成品的检定,无菌检查,四、吸附破伤风疫苗（,adsorbed tetanus vaccine,）,3.,成品的检定,鉴别试验：动物实验、絮状试验、凝胶免疫沉淀,外观：乳白色悬液,化学检定：,pH,、氢氧化铝、硫柳汞、甲醛等含量,效价测定,40IU/,剂,特异性毒性检查（豚鼠皮下注射）：体重、症状,五、治疗性疫苗,前列腺癌疫苗,Sipuleucel-T,DENDREON,公司的自体细胞免疫疗法,2010,年批准上市，首个被,FDA,批准的治疗性癌症疫苗,五、治疗性疫苗,前列腺癌疫苗,Sipuleucel-T,基本步骤,:,采集患者的,外周血单个核细胞,，培养生成,抗原提呈细胞,（树枝状细胞,),树枝状细胞在培养条件下用基因工程制备的,融合蛋白,（,PA2024,）孵育,这种融合蛋白由两部分组成,:,抗原,-,前列腺酸性磷酸酶,（,PAP,），,PAP,能在,95%,的前列腺癌细胞中表达,;,粒细胞,-,巨噬细胞集落刺激因子,（,GM-CSF),一种能帮助树枝状细胞成熟和激活的免疫信号因子,收集经融合蛋白孵育刺激的树枝状细胞等,免疫活性细胞重新注入患者体内,激发体内产生针对携带,PAP,抗原的前列腺癌细胞的抗肿瘤免疫反应,第四节 疫苗生产的质量控制,一、原材料的质量控制,（一）生产用水,（二）器材、溶液等原材料,（三）动物源的原材料：,SPF,级,（四）菌种和毒种,（五）细胞,（四）菌种和毒种,二、生产过程质量控制,中国生物制品规程,G,MP,人员素质、卫生及无菌的要求,三、疫苗产品的质量控制,（一）理化检定,检测疫苗中的有效成分和无效有害成分,物理性状检查,蛋白质含量测定：基因工程疫苗,防腐剂含量测定,纯度检查,其他：水分、佐剂等,三、疫苗产品的质量控制,（二）安全性检定,菌、毒种和主要原材料的检查,半成品检查,成品检查,三、疫苗产品的质量控制,（三）效力检定,免疫力试验,活疫苗的效力测定,血清学试验,第五节 疫苗产业特点及应用概况,疫苗行业是生物医药领域中比较高端的细分领域，具有较高的,技术壁垒,、,资金壁垒,和,政策壁垒,。,全球疫苗,85%,的疫苗市场被,葛兰素史克,、,赛诺菲安万特,、,默克,、,惠氏,和,诺华,这五家跨国制药企业所垄断。,我国疫苗市场规模已接近,100,亿元,，全世界排名前,10,位的制药公司已全部进军中国市场。,一、疫苗研发生产特点,需全程监管,研发是疫苗供应体系的核心,周期长、投入高、风险大：,10,年以上,一条生产线只生产一种产品,对大规模产业化生产技术的需求高,投入产出比高,二、我国疫苗分类及需求,政府免费向公民提供、公民依照政府规定接种,公民自愿接种、自费负担,三、我国疫苗行业现状,流通领域的开放和计划免疫范围的扩大，加强计划疫苗需求，激活有价疫苗市场,加大传统疫苗的技术改良与新型疫苗品种的开发力度,展开从产品竞争到企业竞争的双重竞争,四、接种疫苗的效果,1.,人用疫苗,彻底消灭天花,基本消灭脊髓灰质炎,麻疹、百日咳、白喉、流行性乙脑炎、流行性脑脊髓膜炎等发病率大幅下降,2.,兽用疫苗,五、面临的形势和挑战,全球性需求和发展加快,关键技术、装备研发、大规模生产措施及人兽共患病方面较薄弱,管理分散、整体保障水平与实际需求有差距,供应能力大而不强,TED,（,technology, entertainment, design,）,美国的一家私有非营利机构,以每年,3,月的,TED,大会著称，会议宗旨是“用思想的力量来改变世界”。,在美国召集科学、设计、文学、音乐等领域的杰出人物，分享关於技术、社会、人的思考和探索。,TED,演讲的特点是毫无繁杂冗长的专业讲座，观点响亮，开门见山，种类繁多，看法新颖。,血凝抑制实验,一种测定抗原或抗体的技术,血凝现象,：有血凝素的病毒能凝集人或动物红细胞,血凝抑制试验,：血凝现象被相应抗体抑制,单向免疫扩散试验,将一定量,抗体,混于琼脂凝胶中制成,琼脂板,，在适当位置,打孔,后将,抗原,加入孔中，抗原扩散过程中与板中抗体相遇，形成以抗原孔为中心的,沉淀环,沉淀环直径或面积与抗原浓度呈正相关,用标准抗原或国际参考蛋白制成标准曲线，即,定量检测未知标本的抗原浓度,酶联免疫吸附测定（,Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay , ELISA,）,将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的反应,用于检测,特异性抗原和抗体,特点：快速、灵敏、简便、载体易于标准化等,分类：,间接法、夹心法、竞争法,间接法,ELISA,检测,检测抗体,用特异性抗原包被固相载体，加入待测的抗体样品反应后，再加入酶标二抗，经底物显色后测定。,夹心法,ELISA,检测,检测大分子抗原,用抗体包被固相载体，加入待测的抗原反应后，再加入酶标的第二抗原或抗体，经底物显色后测定，即可计算出待测抗原的量。,竞争法,ELISA,检测,检测小分子抗原,用特异性抗体包被固相载体，同时加入酶标抗原和待测抗原的混合物样本，待测抗原将与酶标抗原竞争与固相上抗体结合。经底物显色后测定，计算两组数值之差即可推出待测抗原的量。,抗酸染色涂片,分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质，包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌一般,不易着色,，要经过加热和延长染色时间来促使其着色。但分枝杆菌中的分枝菌酸与染料结合后，就,很难被酸性脱色剂脱色,在加热条件下使分枝菌酸与石炭酸复红牢固结合成复合物，用盐酸酒精处理也不脱色。当再加碱性美兰复染后，分枝杆菌仍然为红色，而其他细菌及背景中的物质为蓝色。,免疫印迹法（,Western blotting,）,根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种,蛋白,的方法,具有,SDS-PAGE,的高分辨力,和,固相免疫测定的高特异性和敏感性,，现已成为蛋白分析的一种常规技术,常用于,鉴定,某种蛋白，并能对蛋白进行,定性,和,半定量分析,。结合化学发光检测，可以同时比较多个样品同种蛋白的,表达量,差异。,高效液相色谱法（,High Performance Liquid Chromatography,，,HPLC,）,以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。,思考题,1.,简述疫苗的概念、组成及作用原理。,2.,简述各类疫苗的主要特点及制备方法。,3.,何为治疗性疫苗？与预防性疫苗的区别？,4.,设计并简述禽流感,H5N1,疫苗的主要制备流程。,