二代测序技术在非小细胞肺癌中临床应用

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,二代测序技术在非小细胞肺癌中临床应用,目 录,1,2,3,DNA,测序技术简介,非小细胞肺癌精准治疗概述,NGS,检测技术贯穿,非小细胞肺癌精准治疗全程,DNA,测序技术简介,PART 01,DNA,测序技术的发展历程,一代测序技术,二代测序技术,(NGS),三代测序技术,化学降解法,双脱氧链终止法（,Sanger,法）,荧光自动测序技术,杂交测序技术,Roche,公司的,454,测序技术,Illumina,公司的,Solexa,技术,ABI,公司的,SOLiD,技术,Life,公司的,Ion Torrent,技术,Helicos,公司的,Heliscope,单分子测序仪,Pacific Biosciences,公司的,SMRT,技术,Oxford Nanopore Technologies,纳米孔单分子测序技术,孙海汐,王秀杰,.DNA,测序技术发展及其展望,J.,科研信息化技术与应用,2009(03):18-29.,20,世纪中叶至,20,世纪末,2005,年至今,2008,年至今,各大,DNA,测序技术的比较,技术,代表技术,通量,时间,优势,劣势,第一代,DNA,测序,Sanger,（双脱氧链终止法）为代表,低,1977,年,1,）准确率高,2,）读长较,NGS,长,1,）通量低、成本高,2,）对样本中肿瘤细胞的含量和比例要求较高,3,）灵敏度低,第二代,DNA,测序（,NGS）,边合成边测序,高,2005,年,1,）大规模平行测序,2,）定量,3,）比,Sanger,技术成本低廉,4,）灵敏度高，适用于起始浓度很低的样本（液态活检）,1,）错误率较,Sanger,测序高,2,）样本建库流程繁琐,3,）多次,PCR,存在系统误差，无法通过后续加深测序纠正,4,）数据量大，对后续数据的拼接、生物信息学分析要求极高,第三代,DNA,测序,单分子测序,中,-,高,2008,年,1,）读长长,2,）单分子测序，无需建库、模板扩增，保留样本最原始的信息。,3,）测序同时可检测碱基修饰的情况，如甲基化、乙酰化等,4,）可以做全转录本的测序，分析可变剪切,1,）由于建库无需,PCR,，因此对于上机样本的浓度要求较高,2,）测序成本较,NGS,高,3,）目前临床应用的实例较少,4,）无法表达定量,DNA,二代测序技术（,Next generation squencing,，,NGS,）的应用,A,B,D,E,C,2009,年，,NGS,用于罕见遗传病分子病因学研究和诊断,遗传病,2008,年首次报道,NGS,应用于急性髓细胞性白血病，此后,NGS,被广泛应用于肿瘤领域；,2014,年，,NGS,技术应用于血浆,ctDNA,检测；,2017,年,11,月，,FDA,批准首个肿瘤多癌肿多基因检测平台,MSK-IMPACT,；,2017,年,12,月，,FDA,式批准了首个,NGS,体外诊 断（,IVD,）上市,肿瘤,2013,年，,NGS,应用于人类胚胎细胞非整倍体筛查的临床前研究,胚胎植入前遗传学诊断与筛查,2008,年，华大基因尝试用,NGS,检测胎儿游离,DNA 2010,年，基于,NGS,的无创产前筛查开始进入临床,无创产前,DNA,检测,DNA,二代测序技术的应用,非小细胞肺癌精准治疗概述,PART 02,在中国，肺癌的发病率及死亡率均居第一位,陈万青，等,.2013,年中国恶性肿瘤发病和死亡分析,J.,中国肿瘤,2017,，,26,（,1,）：,1-7,肺癌从单病种,组织分型,分子分型的演变,肺癌分为非小细胞肺癌,(NSCLC),和小细胞肺癌,(SCLC),两大类，,NSCLC,约占,85%,，主要分为肺腺癌、肺鳞癌和大细胞癌等。肺腺癌约占,NSCLC 40%-50%,，肺鳞癌约,20%-30%,，大细胞癌约,1.5%,NSCLC,不再是一个疾病，而是一组疾病，需要分类治疗，分子分型是关键,Xu Y et al.,Ther Clin Risk Manag.2016 May 24;12:807-16,Shames et al., J Pathol. 2014 Jan;232(2):121,33,Li T, et al. J Clin Oncol. 2013 Mar 10;31(8):1039-49,.,Herbst RS et al.,Nature. 2018 Jan 24;553(7689):446-454,欧美人群与中国人群,NSCLC,的分子特征有所不同,Herbst RS,等,2018,年,1,月发表于Nature的综述中指出,欧美人群,中：,肺腺癌中常见,激活突变,位于,PI3K/AKT/mTOR,和,RAS/RAF,两大信号通路，包括癌基因EGFR、KRAS、 ERBB2/3、MET、ALK、RET、ROS、BRAF等。,失活突变,包括,抑癌基因 TP53、KEAP1和NF1,等,肺鳞癌中常见,激活突变,包括癌基因,FGFR1-3、PIK3CA、KRAS、AKT、BRAF,等，较少见EGFR扩增。,失活突变,包括,抑癌基因TP53、CDKN2A,欧美人群与中国人群,NSCLC,的分子特征有所不同,Oncotarget. 2016 Jul 5;7(27):41691-41702.,A.,1770例中国NSCLC 患者测序结果显示常见激活突变包括癌基因EGFR、KRAS、ALK、 ERBB2(HER2)、MET、RET、BRAF、ROS1等。其中EGFR突变比例为 50.3%，占据NSCLC突变半壁江山，远高于欧美人群27%,B.,904例非吸烟肺腺癌患者测序结果显示常见激活突变包括癌基因EGFR、 ALK、KRAS、ERBB2(HER2)、MET、RET、BRAF、ROS1等。其中 EGFR突变比例高达74.5%，表明EGFR基因在中国肺腺癌患者中至关重要,肺癌进入精准治疗时代：根据分子分型决定治疗方案,Deborah B,et al.,JAMA Oncol 2018 Apr 01;4(4),.,NGS,二代测序,ddPCR,数字,PCR,ARMS-PCR,FISH,荧光原位杂交,IHC,免疫组化,01.,02.,03.,04.,05.,临床常用的分子检测诊断技术,用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究,扩增阻碍突变系统,(ARMS),，利用,PCR,引物的,3,端末位碱基必须与其模板,DNA,互补才能有效扩增的原理，设计等位基因特异性,PCR,扩增引物；只有在引物,3,碱基与模板配对时才能出现,PCR,扩增带，野生型的不扩增,通过荧光标记的,DNA,探针与细胞核内的,DNA,靶序列杂交，并在荧光显微镜下观察分析其结果的一种分子细胞遗传学技术,通过荧光标记的,DNA,探针与细胞核内的,DNA,靶序列杂交，并在荧光显微镜下观察分析其结果的一种分子细胞遗传学技术,在,Sanger,测序方法的基础上，用不同颜色的荧光标记四种不同的,dNTP,，当,DNA,聚合酶合成互补链时，每添加一种,dNTP,就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测,DNA,的序列信息,检测方法,优势,劣势,可检测的变异形式,AMRS-PCR,1,、灵敏度,3%-10%,2,、扩增和检测同时进行，封闭的体系，减少污染的可能性,1,、只能检测已知突变,2,、如果检测突变点或者类型较多，出现特异产物概率也增加,3,、当检测位点较多时，对,DNA,样本需求增加,4,、无法测融合、大片段插入,/,缺失,点突变、小片段插入,/,缺失,荧光原位杂交,FISH,1,、灵敏度高、特异度高,2,、空间定位准确，可同时分析分裂期和间期多个细胞，并进行定量,1,、通量低、成本高,2,、对操作和判读技术要求高，不同读片者判读差异较大,拷贝数变化、大片段插入,/,缺失、融合,/,重排。,扩增的金标准,免疫组化,IHC,1,、可对组织和细胞中相应的抗原进行定性、定位及定量研究,2,、经济快捷,1,、抗体的选择,2,、检测者组织的固定,3,、观察者解释方面的差异,仅检测蛋白表达水平,ddPCR,1,、单位点精准度非常高,2,、可以进行动态监测,1,、多位点血检匹配度不高，,2,、已知位点测序,点突变、小片段插入,/,缺失,二代测序,NGS,1,、大规模、高通量,2,、能检测各种变异形式,3,、灵敏度,1%-3%,1,、成本较高,2,、引入,PCR,过程会在一定程度上增加测序的错误率，并且具有系统的偏向性，同时读长也比较短,3,、对数据注释和报告解读要求高,点突变,扩增,融合,/,重排,插入,/,缺失,临床常用的分子检测诊断技术优劣势比较,CAP,、,IASLC,及,AMP,三大权威机构推荐由单基因检测发展为多基因检测,J Mol Diagn. 2013 Jul;15(4):415-53.,J Mol Diagn. 2018 Mar;20(2):129-159.,2013,2018,近年,NCCN,指南均建议进行广泛基因检测,检测方法,样本来源,变异类型,点突变,新位点,融合,扩增,突变负荷,MSI,EGFR/BRAF,MET-14 exon skip,ALK/ROS1/RET,MET/HER2,TMB,-,IHC,组织,有限（BRAF）,否,是,是,否,是,血液,否,否,否,否,否,否,FISH,组织,否,否,是,是,否,否,血液,否,否,否,否,否,否,PCR,（ARMS/,ddPCR）,组织,是,否,是（已知类型）,是,否,否,血液,是,否,是（已知类型）,是,否,否,NGS,组织,是,是,是（已知,+,未知）,是,是,是,血液,是,是,是（已知,+,未知）,是,是,是,传统分子检测方法存在局限性，,NGS,平台能够全面满足,NSCLC,现有分子检测诊断需求,NGS,检测技术贯穿,非小细胞肺癌精准治疗全程,PART 03,NGS检测贯穿非小细胞肺癌精准治疗全程,NGS+ctDNA,有助于肿瘤的早期发现,Jillian Phallen et al.,Sci Transl Med . 2017 Aug 16;9(403),Jillian,运用基于,NGS,平台的目标错误校正测序,(TEC-Seq),方法，对,ctDNA,的序列变化进行超灵敏的直接评估发现：,健康人群中未检出肿瘤特异性基因突变；,以健康人作为对照， 乳腺癌、肺癌、卵巢癌、结直肠癌患者都检测到了肿瘤特异性突变；,早期肿瘤就能够检出肿瘤特异性基因突变；,检测肿瘤特异性基因突变与癌症的临床分期呈正比,Jillian,认为基于,NGS,平台的,TEC-Seq,分析方法为早期肿瘤的无创检测提供了广泛适用的方法，可能对癌症患者的筛查和管理有用，提示,ctDNA,用于常见癌种早期诊断的可能性。,CSCO,指南认可,NGS,在非小细胞肺癌分子分型的作用,中国临床肿瘤学会指南工作委员会，中国临床肿瘤学会原发性肺癌诊疗指南,2018,版,NGS,有助于分析非小细胞肺癌分子分型演讲，指导后续治疗,英国TRACERx肺癌研究计划的首个成果,2017,年发表于,新英格兰医学杂志,，其中提到：,NSCLC,腺癌 “进化”的早期：,诸如,EGFR,、,MET,、,BRAF,和,TP53,之类基因的突变,/,扩增往往发生在克隆水平；这些基因往往与,NSCLC,的 形成有关，属于驱动基因,NSCLC“,进化”的晚期：,75%,的肿瘤出现了亚克隆水平的各种变异，而且这些变异还位于肿瘤的不同区域；是造成肿瘤内部异质性的原因,M. Jamal-Hanjani et al.,N Engl J Med . 2017 Jun 1;376(22):2109-2121,早期,晚期,NGS,指导非小细胞肺癌个体化用药及疗效预测,Tsao et al., J Thorac Oncology . Vol. 11 No. 5: 613 - 638,Deborah B,et al.,JAMA Oncol 2018 Apr 01;4(4),.,晚期非小细胞肺癌药物治疗靶向、免疫、化疗三分天下，此时基于,NGS,平台的多基因检测优势明显,NGS,指导非小细胞肺癌个体化用药及疗效预测,Rizvi N A, Hellmann M D, et al. Science, 2015, 348(6230): 124 - 128,Rizvi,对非小细胞肺癌,(NSCLC),进行全外显子测序，发现肿瘤中更高的非同义突变负荷(H-TMB)人群有更好的无进展生存期(PFD) ， 并且对PD-1 单抗 (pembrolizumab)有持久的反应(DCB),NGS,能够帮助发现非小细胞肺癌耐药机制及判断预后,Ke EE,等纳入,224,名,EGFR,突变并获得,EGFR-TKI,耐药的晚期,NSCLC,患者，分析,T790M,突变、,MET,扩增、组织学转化、,KRAS,、,PIK3CA,突变、,ALK,融合等耐药机制，其发现：,19-del 缺失组的 T790M 突变（50.4%）显著比L858R突变组（36.5%）高；,T790M 突变的患者中观察到明显的OS益处，中位OS 36.0个月；,在调整,T790M,基因型的多变量分析中，,EGFR,突变亚型不再被认为是显著的；,结果报道：EGFR T790M 高比例突变对于 Exon19 缺失比 L858R突变的患者有更好的存活率，预后更好。,Ke,EE,et,al.,J Thorac Oncol. 2017 Sep;12(9):1368-1375.,NGS+ctDNA,早期提示肿瘤复发,Chaudhuri AA,，,et al.,Cancer Discov. 2017 Dec;7(12):1394-1403.,Chaudhuri AA,等采用深度测序,(CAPP-seq),循环肿瘤,DNA (ctDNA),分析方法，对,40,例,I-III,期肺癌患者和,54,名健康成人的,255,份样本进行了癌症个性化监测，其发现：,94%,的患者在治疗后的血液样本中检测到,ctDNA,定期接受ctDNA监测的患者，在接受根治性治疗后，第一次检测到ctDNA的时间，比CT明确提示肿瘤复发，,ctDNA中相应基因检测，还可以用来区别到底是疾病复发还是正常术后改变,NGS正在以更高的标准，快速进入临床服务患者,FDA自2016年底至今已批准6款 NGS技术产品，以期降低NGS技术 产品潜在的检测错误和解读错误,风险,，保证该类产品检测的安全性、 有效性,2016.12.19 FoundationFocus CDx BRCA,BRCA 1/2,晚期卵巢癌,Rucaparib,2017.6.22 Oncomine Dx EGFR,、,ROS1,、,BRAF,非小细胞肺癌,吉非替尼、克唑替尼、 达拉菲尼、曲美替尼,2017.6.29 Praxis Extended RAS Panel KRAS (exons 2, 3, 4) NRAS (exons 2, 3, 4) 转移性结直肠癌,帕尼单抗,2017.11.15 MSK-IMPACTTM FFPE样本的,468个基因,MSI、MMR,所有实体瘤,补充诊断,2017.12.1 FoundationOne CDx FFPE样本的,324个基因,所有实体瘤,替换、插入、缺失、拷贝数变化、基因重排等突变， MSI、TMB,伴随诊断,2018.1.12 BRACAnalysis CDxTM 生殖系BRAC1/2,晚期卵巢癌、乳腺癌,奥拉帕尼,第一个基于,NGS,平台的多癌种多基因补充诊断,第一个基于,NGS,平台的多癌种多基因伴随诊断,小结,基于NGS平台的基因检测贯穿肺癌精准治疗“全程”，能够做到早期、灵敏、全面、实时、动态监测，测序成本较低,NGS,多基因检测符合临床需求,NGS,技术产品：多癌种多基因,panel,设计是趋势,谢谢,