食品生物技术导论2

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,食品生物技术导论,1,目 录,第一章 绪 论,第二章 食品与基因工程,第三章 食品与蛋白质工程,第四章 食品与酶工程,第五章 食品与发酵工程,第六章 食品与细胞工程,第七章 食品生物工程中的下游过程,第八章 食品生物技术与食品安全检测,第九章 生物技术与食品工业“三废”治理,2,第一章 绪 论,第一节 食品生物技术涵义,第二节 食品生物技术研究内容,第三节 食品生物技术特点,第四节 食品生物技术发展简史,第五节 分子生物学的形成和发展,3,第一节 食品生物技术涵义,一、生物技术,所谓生物工程是达到特殊目的生物过程的控制性工程 “操纵生物 （微生物、植物、动物）的细胞、组织或酶，进行生物合成及分解转化”。,二、食品生物技术,食品生物技术（,food biotechnology,）是利用生物体及其细胞、亚细胞和分子组成部分，结合工程学、信息学等手段去研究及加工处理或制造食品产品的新技术。,4,第二节 食品生物技术研究内容,一、食品与基因工程,基因工程又称遗传工程，它是在体外将异源DNA（目的基因）与基因载体（质粒、病毒等）重组成复制子并转移至宿主细胞的过程。,二、食品与酶工程,酶是活细胞产生的具高度催化活性和高度专一性的生物催化剂。,所谓酶工程是把酶或细胞或经过修饰后直接应用于化学反应的生物催化工程，包括固定化酶、固定化细胞和固定化活细胞体系等。,酶工程的应用能有效地改造传统的食品工业。,5,三、食品与发酵工程,发酵工程其涵义是采用现代发酵设备，使经基因重组技术改良的细胞或经其它现代技术改造的菌株进行放大培养和控制发酵，获得工业化生产预定的食品产品或食品的功能成分。,四、食品与细胞工程,应用细胞生物学方法，按照人们预定的设计，有计划地改造遗传物质和细胞培养技术，包括细胞融合技术、细胞拆合技术以及动物、植物大量控制性培养技术，还包括染色体工程和细胞质工程等内容。,细胞工程与微生物细胞培养一样，在人工控制条件下在生物反应器中大规模培养，获得人类所需要的各种食品产品及保健产品,6,五、食品与蛋白质工程,1983年美国Genex 公司KUtrner提出蛋白质工程（protein engineering）概念，其涵义是指从蛋白质分子结构的设计入手，将待改进的蛋白质提纯为结晶，用x射线衍射等手段研究其空间构象，确定其需要改变的氨基酸残基，然后再用基因定位突变和体外定向进化等方法达到修饰蛋白质分子空间结构的目的。,六、食品与后基因组学,2003,年随着人类基因组图谱草图绘制成功，为后基因组学（,post-genomics,）的诞生拉开了序幕。而现代研究认为，一个基因可以编码数个蛋白质，随之形成所谓基因组学（,genomics,）和蛋白质组学（,proteomics,），近年来，在日本、美国和德国等国又启动了营养基因组学（,nutrigenomics,）的研究。,7,七、食品与食品安全,生物技术的发展为食品安全的检测提供高速高效的PCR系统检测技术。为加强食品安全在食品加工过程除必须严格执行CAC、HACCP、GMP和ACP安全体系外。还必须制订切实可行的食品安全监督管理体系。,8,第三节 食品生物技术特点,一、食品生物技术与食品产业化紧密相关,食品生物技术对改造传统食品工业和农副产品深加工，具有革命性意义和较大的经济价值。食品生物技术即食品生物工程包括上游工程（,up stream process,）和下游工程（,down stream process,），整个过程有多个操作工序，一环扣一环，核心技术为生物技术和酶工程，形成较为完整的产业链，如图,1-1,所示。,图1-1 食品生物技术产业链示意图,9,二、食品生物技术属边缘性交叉学科,生物技术是研究生命的科学技术，是生物科学和工程学综合交叉的边缘学科。,三、食品生物技术具有“六高”基本特征,食品生物技术与其他高新技术一样，对国民经济的发展和食品工业的革新具有“六高”的基本特征：即高效益，高智力、高投入、高竞争、高风险和高潜力。,四、食品生物技术属高新技术范畴,根据当今世界科技发展对世界经济发展贡献情况。信息、能源、生物技术、航天、材料、汽车和环境等己被列为世界“七大”高科技领域。,10,五、食品生物技术已成为食品科学发展的重要研究方向,食品生物技术作为生物技术的分支学科，在自然科学中涵盖范围广为其特征。,第四节 食品生物技术发展简史,一、史前时期,从出土文物发现，追溯至距今数千多年前的龙山文化时期。酿酒、制醋和制酱等发酵技艺已经发展到世界一流水平。,11,二、近代时期,从19世纪50年代开始，伴随着欧洲的文艺复兴带来科学和工业的繁荣。由于法国科学家巴斯德（Pasteur）对微生物学创立的贡献，德国科学家柯赫（Koch）发明了微生物的分离和纯种培养技术和法国学者布合乃尔（Buchner）兄弟俩通过实验揭示了发酵本质是细胞中酶的作用。标志着传统食品生物技术向近代食品生物技术的发展。从传统发酵食品的生产靠天然微生物作用 。,三、现代的发展,从,20,世纪,50,年代初开始，伴随着生物化学，遗传学和化学分析技术的发展。特别是,1953,年“,DNA,双螺旋结构”的发现、,1969,年酶固定化技术的应用成果和,1973,年基因工程诞生等重大科技成就为标志的划时代发展,12,第五节 分子生物学的形成和发展,一、细胞学说,在,19,世纪中时施莱登和施旺（,Schwann,）两位学者经过,20,年的研究绘出有关细胞结构明显图象和细胞组成，从而创立了细胞学说。,二、生物进化论,奥地利学者格里哥尔,.,孟德尔（,Gregor,Mendel,）研究认为，遗传性状是由一对遗传因子决定的，,13,四、摩尔根的基因学说,摩尔根提出：“物质必须由某种独立的要素组成，正是这些要素我们叫做遗传因子，或者更简单地叫做基因”。,五、基因本质的发现,摩尔根提出：“物质必须由某种独立的要素组成，正是这些要素我们叫做遗传因子，或者更简单地叫做基因”。多年来研究证实这种转化物质就是,DNA,，这是基因本质的重大发现。,14,六、分子生物学的诞生,1953年美国遗传学家詹姆斯.沃森（James D .Watson）和英国生物物理学家弗朗西斯.克里克（Francis crick）根据莫.休.弗.威尔金斯（M.H.F.wilkins）的x-射线衍射等系列图谱结构分析基础上，用标度分子模型在英国Max Perutz教授分子生物学实验室进行研究。其研究成果，在英国自然杂志上发表的DNA结构一文，提出了“DNA双螺旋结构模型”。首次阐明了D结构与功能，为遗传信息的贮存、传递和利用提供了科学依据，创立了现代分子生物学。这是20世纪科学史上划时代的里程碑。Watson和crick均为诺贝尔奖获得者。DNA双螺旋结构分子模型如图1-1、1-2所示其结构要点说明如下：,图1-1 DNA分子双螺旋结构模型,图,1-2 DNA,双螺旋结构分子模型,15,（1）DNA是由两条极性相反并互补的多聚核苷酸链，围绕中心轴的双螺旋结构。此螺旋为右螺旋，并存在大沟和小沟。,（2）两条链中碱基之间按照A配对T、G配对C的互补原则，DNA两链间的维系主要靠氢键，其中A与T之间形成二个氢键，G与C之间形成三个氢键。,（3）双螺旋的直径为2nm，两个相邻碱基的间距为0.34nm，每10个碱基的间距为3.4nm，构成一段完整的螺旋结构，其相邻碱基的夹角为36。,（4）两条多聚核苷酸链间碱基配对的互补规律为：A配对T或T配对A、G配对C或C配对G，而且其分子比率为1。,16,（1）DNA分子能自我复制根据DNA双螺结构模型，在两条多聚核苷酸链中，任何一条都可以作为另一条生物合成的模板，这一点明显地不同于其它生物大分子。经过自我复制出来的每一个DNA分子中的一条链被保留下来。这种复制，称为半保留复制（Semi conservative replication）（如图1-3）。,（,2,）,DNA,是遗传基因的载体,可以从分子水平上阐明其生物学功能：,图,1-3,半保留复制示意图,17,（,3,）,DNA,双螺旋结构模型为遗传信息的保存、传递和利用提供了基础。同时，根据,1970,年,Crick,等人提出的分子生物学中心法则，如图,1-4,所示。,（,4,）,DNA,的调节功能1961年，法国分子生物学家F.Jacob和J.Monod首次证实在大肠杆菌（）基因调节事实，提出了乳糖操纵子（Lac Operon）假说。,图,1-4,分子生物学中心法则,5,应用乳糖操纵子假说，从分子水平上阐明基因控制蛋白质的诱导合成另一种酶合成调节与酶的诱导合成机制不同，称为酶的反馈阻遏。,18,第一节 概 述,第二节 工具酶,第三节 目的基因制备,第四节 基因载体,第五节 基因重组,第六节 转化、增殖和表达,第七节 基因工程在食品工业中应用,第八节 后基因组学及其应用研究,第二章 食品与基因工程,19,第一节 概 述,一、基因工程的诞生,1973,年,S.N.Cohen,等在美国科学院学报（,PNAS,）上发表了题为“,Construction of Biological Functional Bacterial Plasmid in Vitro”,，阐明了体外构建的细菌质粒能够在细胞中进行表达，标志着基因工程的诞生,20,二、基因工程涵义、特点及其操作步骤,基因工程（gene engineering）又称为分子克隆（molecular cloning）或重组DNA技术（recombinant DNA Technology），其涵义为：用酶学方法，将异源基因与载体DNA在体外进行重组，将形成的重组子DNA导入宿体细胞，使异源基因在宿体细胞中复制表达，从而达到改造生物品种或性状，大量生产出人类所需要生物品种和产物。,基因工程操作过程如图2-1所示。,图2-1基因工程操作过程示意图,2,21,三、基因工程的发展,1977年英国分子生物学家F.Sanger发明了快速DNA测序技术并首先完成的全长5387bp的174噬菌体基因组全序列的测定 。,1982年第一个由基因工程菌生产的药物胰岛素已在美国和英国获准使用。,1983年第一个转基因植物培育成功，1992年第一个转基因玉米及转基因小麦植株诞生，1994年转基因番茄上市。1996年完成了酵母基因组DNA（125105bp）的全序列测定。2003年人类基因组计划经过20多年努力已宣布草图描绘成功。为后基因组时代的诞生拉开了序幕 。,22,第二节 工具酶,在基因工程中应用的酶统称为工具酶（enzyme of tools）。,一、限制性内切酶种类,限制性内切酶有三种类型：,I,型酶、,II,型酶和,III,型酶。,II,型酶分子量较小，大约,20-100kD,，是一种简单的单功能酶，作用时无需辅助因子或只需,Mg2+,，能识别双链,DNA,上特异的核苷酸序列，同时专一性强，而且其识别序列与切割序列相一致。这类酶特别适合于基因工程操作。,二、限制性内切酶命名,1973,年，,H.O.Smith,和,Nathaus,提出限制性内切酶的命名原则,一、限制性内切酶,限制性内切酶（,restriction,endonuclease,简称,RE,）是一类专一性很强的核酸内切酶,23,三、限制性内切酶的作用机制和作用方式,如图2-2所示,图2-2限制性核酸内切酶作用机制,其作用方式及识别位点有如下几种：,1.,识别不同的特异核苷酸序列,EcoR,I,识别,Hae,I,识别,24,Asu I识别,EcoR II识别,Mbo I识别,注：表示切割5-磷酸二酯键位置。,2.识别序列皆具有回文结构,3.切割后形成各种粘性末端或平整末端，按其切割双链的方式可分两种：粘性末端和平整末端。,限制性内切酶错位切割,DNA,双链而形成彼此互补的单链末端，称为粘性末端（,Cohesion ends,）。,25,另一种是在同一位点平齐切割DNA两条链而形成的双链末端，称为平整末端（Flush ends）。如Alu I的识别序列为：,4.,切割后形成异源二聚体,四、限制性内切酶识别序列及反应系统,限制性核酸内切酶在双链,DNA,上能够识别的特殊核苷酸序列称为识别序列。,稀切酶（,rare,cuting,enzymes,），如表,2-1,所示 ，同裂酶（,isoschizomer,）如表,2-2,所示。同尾酶（,isocaudamer,），如表,2-3,所示。,26,表2-1 部分限制性内切稀切酶,2,稀切酶,切 割 位 点 数,识别序列,Ad2,SV40,X174,M13mp7,PBr322,T7,TPA,A.D,Fse,I,GGCCGGCC,O,3,0,0,0,0,0,0,1,Not,I,GCGGCCGC,0,7,0,0,0,0,0,0,0,Rsr,II,CGGWCCG,5,2,0,0,0,0,1,1,0,Sfi,I,GGCCN,5,CCGG,0,3,1,0,0,0,1,1,2,Sgr,I,CrCCGGyG,7,6,0,0,0,1,0,0,0,Swa,I,ATTT/AAAT,0,1,1,0,1,0,1,0,1,表2-2 具有相同切割位点的同裂酶,27,表2-3 部分限制性核酸内切同尾酶,2,黏性末端,限 制 性 核 酸 内 切 酶,5CATG,Afl,III，,Dsa,I，,Nco,I，,Sty,I，,Bsp,HI,5GATC,Sau,3A，,Nde,II，,Bgl,II，,Xho,II，,Bam,HI，,Mle,I，,Bel,I,5GGCC,EclX,I，,Eae,I,5CGCG,Mlu,I，,Afl,III，,Bss,HII，,Dsa,I,5CCGG,Cfr,10，,Age,I，,Xma,I，,Ava,I，,Mor,I,5TCGA,Sae,I，,Xho,I，,Ava,I,5GTAC,Sap,718，,Ban,I，,Sph,I,5CTAG,Spe,I，,Nhe,I，,Avr,II，,Sty,I，,Xba,I,5CG,Mae,I，,Acy,I，,Hin,PI，,Nar,I，,Hpa,II，,Msp,I，,Taq,I，,Cla,I，,Acc,I，,Sfu,I,5TA,Nde,I，,Mae,I，,Mse,I，,Asn,I,CATG3,Nla,III，,Nsp,I，,Sph,I,AGCT3,Sac,I，,Ban,II，,Bmy,I,GGCC3,Apa,I，,Ban,II，,Bmy,I，,Asp,HI,TGCA3,Nsi,I，,Asp,HI，,Bmy,I，,Pst,I,GCGC3,Hae,II，,Bbe,I,28,二、基因工程操作中的其他酶,（一）、DNA连接酶,（二）、DNA聚合酶I,（三）、碱性磷酸酯酶,（四）、T4多聚核核苷酸激酶,（五）、S1核酸酶,（六）、反向转录酶,29,第三节 目的基因制备,原核生物基因的分离多采用前法，而真核细胞基因的分离则采用后两种方法。,一、生物学方法,原核生物中常用鸟枪射击法或滔弹散射法（,shotgun cloning,）来克隆分离基因。此法优点是：快速简便、产物纯度高，是真正的天然基因，兼有外显子和内含子。,另一种生物学方法是采用分子杂交手段。,1973,年,，,Shin,和,Martin,用分子杂交技术分离目的基因获得成功。,30,二、化学合成法,化学合成一个循环有如下4个步骤：,整个合成反应历程如图,2-3,表示。,图2-3 固定化亚磷酸三酯法合成寡聚核苷酸,31,三、基因文库法,基因文库（gene library）或称为DNA文库，它是指用克隆方法将一种生物全部基因组以重组体的方式长期保持在适当的宿主中。当需要重组体DNA某一片段时，便可以在此文库中查找。基因文库又称为cDNA文库,34,。,cDNA文库构建的步骤：,1.,酶促合成法制取,cDNA,2.,从组织或细胞中制备总,RNA,和,mRNA,3.,合成,cDNA,第一条链,32,其反应过程为图,2-5,的所示。,图2-5 合成cDNA第一链反应过程,33,4.,cDNA,第二条链的合成，其反应历程如图,2-6,所示。,图2-6 置换法合成cDNA反应过程,34,四、PCR扩增法,1985年，美国Cetus公司的Mullis等人开发成功的聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR ）技术，这一快速地扩增特异DNA片段系统在分子生物学领域中是一项重大的革新。,其反应历程如图2-7所示。,图2-7 PCR扩增技术基本原理,35,第四节 基因载体,目前，在基因工程中应用的基因载体主要是质粒、病毒和噬菌体，它们都能担当无性繁殖载体。因为它们均符合作为载体应具备的下列条件：,（1）本身是一个复制子，能自我复制；,（2）相对分子质量较小，,（3）能给宿主细胞（受体细胞）提供可选择标记,（4）只有单一限制性内切酶切点,一、质 粒,质粒（,plasmid,）存在于细菌、放线菌及酵母细胞内细胞质中双螺旋共价闭环的,DNA,（,covalently,closed,and circular DNA,缩写为,cccDNA,）。它能进行独立复制并保持恒定遗传的复制子。,36,（一）质粒载体pBR322,pBR322是目前应用最广泛的人工构建的载体之一。如图2-8所示5。用小写英文字母P代表质粒，BR表示该质粒 研究者Bolivar 和Rogigerus，而322是具体研究编号。pBR322大小为4363bp，（1bp=1碱基对）含有2个抗生素抗性基因 。,pBR322质粒具有抗菌素抗性基因 ，构建的pBR325、pBR327如图2-9、图2-10所示。,图2-9 pBR325衍生质粒 图2-10 pBR327衍生质粒,37,（二）质粒载体PUC,pUC质粒是在pBR322的基础上，在未端加入一段多克隆位点（multiple cloning sites,MCS）的LacZ基因。,二、噬菌体,噬菌体（,Phage,）是病毒的一种，形态微小，只能在电子显微镜下才能观察到。,三、M,13,噬菌体,四、病毒,38,第五节 基因重组,基因重组即将目的基因（或外源基因）与载体在体外结合构建形成重组子。,图2-11 DNA体外重组方式,39,第六节 转化、增殖和表达,一、转化,1、宿主细胞,2、感受态,3、扩增检筛,R.K.Saiki和K.B.Mullis分别于1985年和1987年发展了一种“多聚酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）” 。,PCR技术操作步骤为：反复将目的基因片段进行热变性处理，令其双股链解开；进行反链杂交、退火、形成单链；用Taq DNA多聚酶沿DNA链全程全成出两股双链DNA分子；然后开始第二个反应周期 。,40,二、基因表达,克隆DNA的最终目的是表达最终目的产物。因此，通过DNA重组技术使特定基因片段在受体细胞内大量增殖，拷贝数目大大增加，就必须使特点基因进一步转录、翻译为相应的蛋白质（或酶），进而获得它们的代谢产物，这一过程,称为基因表达。,第七节 基因工程在食品工业中应用,一、转基因微生物食品,转基因微生物菌株则称为工程菌（engineering strain）。,41,（一）应用于提高食品产品的品质,第一个采用基因工程改造的食品微生物为面包酵母（saccharomyces cerevisiae）。 1991年，英国政府批准通过了DNA重组面包酵母工程菌的商业化应用7。在啤酒酿造中一乙酰乳酸通过自发氧化作用形成双乙酰，双乙酰形成机理及其基因重组控制双乙酰如图2-12、图2-13所示。,图2-12 啤酒酿造中双乙酰形成机理,图2-13 啤酒酵母导入-乙酰乳酸脱羧酶基因后双乙酰酶促转化,42,（二）应用于简化工艺，缩短生产周期,近年来，在一个啤酒酵母菌株中表达了一个内源性的PGUI基因，结果发现这个重组菌株能够分泌有活性的内聚半乳糖酸酶，可以大大缩短葡萄酒的过滤时间。,（三）应用于食品的抗菌和防腐保鲜,现将工程菌在食品工业应用较多的菌株如列表2-4所示。,表2-4 基因工程改良的微生物工程菌,43,（四）应用于食品级酶制剂生产菌的改良,凝乳酶（chymosin）是第一个应用基因工程技术把小牛胃中的凝乳酶基因转移至细菌或真核微生物生产的一种酶。,现将NovoNordisk、Gist-Brocades等公司采用基因工程改良霉菌种列于表2-5、表2-6、表2-7。,44,表2-5 丹麦Novo Nordisk公司利用基因工程改良产酶微生物菌种,12,45,46,（5）应用于生产保健食品的有效成分,现在，可以采用转基因手段，在动、植物或其细胞中，得到基因表达而制造有益于人类健康的保健成分或有效因子。采用基因重组构建军一株高表达的单链蛋白,2.5-DKG,还原酶，以加速催化生成维生素,C,的前体,2-KLG,，便可有效地缩短生产维生素,C,的生产周期。,超氧化物歧化酶（,SOD,）能有效消除氧自由基，,Brehm,等人将,BStearothermophilus,的,Mn-SOD,基因克隆入大肠杆菌中，其重组体,Mn-SOD,在大肠杆菌高效达，产生的,SOD,占可溶性蛋白,49%,。采用基因重组技术克隆破囊壶菌（,Thraustochy triumroseum,）,DHA,合成关键酶基因，进而在酵母真核细胞中表达。,Anammartet14,克隆了毕氏酵母,9,脂肪酸脱饱和酶基因及其调节机制。,47,（6）应用于食品微生物快速检测,随着,DNA,分子检测技术和,PCR,等技术的应用，可使沙门氏菌、李斯特氏菌、致泻性,E.coli,等食源性微生物的检测已发展到一个新水平。,二、转基因动物食品,转基因动物食品是由转基因动物产生的食物或利用转基因动物为原料生产的食品或食品添加剂。,1985,年，第一例转基因家畜研制成功由于转基因家禽及其生产的食品是人类较直接的食物，基因重组技术改进牛奶成分如表,2-8,所示。,48,表2-8 基因重组技术改进牛奶成分,18,49,三、转基因植物食品,所谓转基因植物食品是指由转基因植物产生的食物或利用转基因植物为原料生产的食品或食品添加剂。1983年，世界上第一例转基因植物即转抗虫基因的烟草问世。1994年美国FDA批准延熟保鲜的转基因番茄上市。,Ti质粒是诱导植物肿瘤的质粒。依据T区携带基因功能，可决定植物冠瘿瘤的形成和控制冠瘿碱的合成。Ti质粒结构中的可转移DNA（T-DNA）复促进Ti质粒转移至植物细胞Ch-DNA中。其基因重组和转移过程如图2-15所示。,图2-15 利用Ti质粒将外源基因转导入植物组织示意图,2,50,至目前为上，在欧洲根据相关法规（90/220EEC）已有10多种转基因植物（作物）被批准上市，如表2-9所示。在世界上有23个作物品系已准许进行种植和饲料使用，延迟成熟番茄（表2-10）以及改变脂肪含量的转基因作物（如表2-11）也已在某些国家准予种植。,表2-9 欧洲获准上市的转基因作物及其产品,18,51,表2-10 世界各地种植的延迟成熟番茄及其产品,18,注：,MFA,改变脂肪酸含量（,GmFad2-1,为,-12-,去饱和酶基因；,BayTE,为硫脂酶基因，源自海湾月桂树,Umbellaria,californica,）；,ABR,抗抗生素（,bla,为氨苄青霉素耐药性基因，,npt,卡那霉素耐药性基因）；,RP,报告基因（,gus,为,-,葡糖醛酸酶基因）。,52,目前，我国获得安全证书的转基因作物（如表,2-12,）和已发放安全证书的进口转基因产品见表,2-13,。,表2-12 我国获得安全证书的转基因作物,19,53,54,55,表2-13我国已发放安全证书的进口转基因产品,19,56,四、食品与基因工程产业化,工程菌皱胃酶应用于干酪生产产业化,干酪是用皱胃酶或胃蛋白酶将原料乳凝聚，然后将凝块进行加工、成型或发酵成熟而制成的富有营养价值的乳制品干酪（cheese）。,（一）干酪制造工艺流程,57,第八节 后基因组学及其应用研究,一、后基因组学涵义,所谓后基因组学（,post-genomics,）是指包括基因组学（,genomis,）、蛋白质组学（,proteomics,）、代谢组学（,metabotomics,）和生物信息学（,bio-informatics,）等主要内容。,二、后基因组学的应用研究,1.,肿瘤及癌症的发生均与细胞中染色体,DNA,结构的变化密切相关。,2.,全面探索食品营养功能,2122,3.,利用哺乳动物及禽畜作为“生物工厂”提供人类优质食品,58,课程论文：,基因工程与食品,1、概念清晰,2、基因工程研究内容和作用,3、基因工程在食品中应用的优势方面。,4、你对基因工程的认识,59,第三章 食品与蛋白质工程,第一节 概述,第二节 理性分子设计和定位突变技术,第三节 体外定向进化,第四节 融合蛋白技术,第五节 食物蛋白质改性技术,60,第一节 概述,一、蛋白质工程的涵义,蛋白质工程是指以蛋白质的结构及其功能关系为基础，通过基因修饰、蛋白质修饰等分子设计，对现存蛋白质加以改造，组建新型蛋白质的现代生物技术。,理性设计是在蛋白质天然结构的基础上进行修饰改造，但是，产生一个结构确定、具有新功能特性蛋白质并不容易，无法满足对现有蛋白质进行分子改良的要求。,61,二、理性分子设计和非理性分子设计,所谓非理性设计或定向进化就是在不清楚蛋白质三维结构信息和作用机制的情况下，在实验室条件下模拟自然进化的过程（随机突变、重组和选择），在一定条件下使基因发生大量变异，然后通过多轮高通量的筛选方法定向选择出所需要的特性突变物，在较短时间内完成漫长的自然进化过程，得到具有特性预期的新蛋白质的一种蛋白质工程技术。非理性设计的主要技术包括定向进化(directed evolution) 、DNA 改组 (gene shuffling)及融合蛋白 (fusions of proteins)技术等。,62,三、蛋白质工程在食品工业中的应用,蛋白质工程在食品工业中应用主要集中在食品工业专用酶制剂的改造方面。通过酶结构或局部构象的调整和改造， 可大大提高食品专用酶制剂的耐高温、抗氧化能力，增加酶的稳定性和适用pH 范围，从而获得性质更稳定、作用效率更高的酶。,第二节 理性分子设计和定位突变技术,一、蛋白质理性分子设计的基本步骤,基于天然蛋白质结构的理性分子设计过程基本分为以下步骤，如图,3-1,所示。,表,3-1,列出了蛋白质设计的目标及解决办法,63,蛋白质几何优化,结构比对分析,天然蛋白质,蛋白质晶体学,蛋白质结构预测,蛋白质三维结构,结构与功能关系,突变体设计预测,合成定位突变,从数据库输入,分离纯化与表征,新蛋白质,图3-1 蛋白质理性分子设计流程图,64,表3-1 蛋白质设计的目标及解决办法,65,表,3-2,列出了目前蛋白质设计所涉及的计算工具及软件。,表3-2 蛋白质分子设计的技术工具及网址,66,二、定位突变,定位突变是在已知蛋白质结构与功能的基础上，在已知DNA序列中取代、插入或删除特定的核苷酸，从而产生具有新性状的的突变蛋白质（酶）分子的一种蛋白质工程技术，表3-3列出了部分应用定位突变技术取得成效的工业酶制剂。,表3-3 部分应用定位突变技术取得成效的工业酶制剂,67,（一）寡核苷酸引物介导的定位突变,寡核苷酸引物介导的定位突变的原理是用含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物，在聚合酶的作用下启动DNA 分子进行复制。主要的过程见图3-2)：详细步骤：,图3-2 寡核苷酸介导的定位突变方法,68,（二）聚合酶链式反应（PCR ）介导的定位突变法，聚合酶链式反应（PCR ）介导的定位突变法是重组PCR (recombinment PCR)的一种，见图3-3 。,PCR 介导的定位突变法优点是操作较简单，突变的成功率可达100%。,（三）盒式突变，盒式突变（cassette mutagenesis）也称片段取代法（DNA fragment replacement），是一种区域性定位突变方法。,图3-3 PCR介导的定位突变方法,69,三、定位突变技术在酶结构改造中的应用,（一） 淀粉酶，通过定位突变技术得到了一种-淀粉酶的双突变体A209V/H133T，该突变酶在90时的半衰期比正常酶增加了9 倍。,（二） 蛋白酶，在枯草杆菌蛋白酶的活性位点内有一个Met 残基，利用定位诱变用Cys 代替Met 可以增加枯草杆菌蛋白酶的活性。,（三） 脂肪酶，Yamaguchi 等采用定位突变将Cys 二硫键引入Humicola lanuginsa 脂肪酶，使突变体的热稳定性提高了12，酶的最适温度提高了10。Kampen 等研究了Staphylococcus hyicus 脂肪酶的突变体对底物专一性的影响，发现将356 位的Ser用Val替换，其脂酶活性降低了12倍。利用定位突变的方法将Trichoderma reesei碱性纤维素酶的Glu137、Asn179和Asp194 突变为Lys，其热稳定性得到了提高。,70,第三节 体外定向进化,一、蛋白质的体外定向进化,定向进化与定位突变的不同点是它不需要已知蛋白质的结构信息，所以该技术又称为非理性设计。,DNA,体外进化的模式见图,3-4,。,靶基因,随机DNA片段,创造基因多样性,（随机诱变和体外重组）,基因产物分析,选择,高通量筛选,体外,体内,数据分析（收集并确认阳性克隆）,目标产物,进一步定向进化,随机片段化,重组,PCR,图3-4 DNA体外进化模式图,71,二、DNA改组,DNA 改组( DNA Shuffling)又称DNA“洗牌”，是DNA体外同源重组的一种重组PCR 技术。见图3-5。,DNA改组技术已广泛用于改进和创制新酶一些特性，在提高酶的活性、热稳定性、底物特异性、对映体的选择性及可溶性表达和表达水平等方面都已取得了不少成功结果。,三、容错PCR,容错,PCR,是指在利用,Taq,聚合酶进行目的基因的,PCR,扩增的同时引入碱基错配，导致目的基因随机突变的一种,DNA,体外进化技术。,四、定向进化技术在酶制剂改造中的应用,运用定向进化技术对现有酶制剂进行改良，已获得了许多满意的结果。表,3-4,列出了通过定向进化技术研究获得成功的一些酶制剂。,72,表3-4 应用定向进化技术研究的生物酶制剂,73,第四节 融合蛋白技术,一、融合蛋白概念和用途,融合蛋白,(fusion of proteins),技术是另一项蛋白质工程技术。该技术是有目的地把两段或多段编码功能蛋白的基因编码区首尾连接在一起，由同一调控序列控制所构成的基因表达产物，进而表达所需蛋白。利用基因融合表达外源蛋白主要有以下用途 ：,其一，融合蛋白技术的出现为解决在大肠杆菌等原核生物中表达出具有生物活性、折叠正确的重组蛋白提供了可能。,其二，外源基因与宿主本身的蛋白的部分序列构成融合基因 。,其三，融合蛋白技术的出现为研究出更多、更好的基因工程靶向药物提供了方便。,74,二、融合蛋白技术的方法,（一）PCR 介导的蛋白质分子嵌合体形成，融合蛋白技术是利用DNA连接酶，将把两段或多段编码功能蛋白的基因编码区首尾连接在一起，由同一调控序列控制构成的基因表达产物，进而表达所需蛋白，利用重组PCR方法（见图3-3） 。,（二）内含子介导的蛋白质分子嵌合体形成，内含子介导的蛋白质分子嵌合体形成已经发展成蛋白质工程研究的通用方法。方法见图3-6。,该方法的原理是：将目标蛋白质用pCYB(bioLabs)作为表达载体进行表达，产生目标蛋白，即蛋白内含子/甲壳素结合蛋白，,图3-6 内含子介导蛋白质分子嵌合体形成,75,三、融合蛋白技术的应用,（一） 双功能酶(多功能酶),对于催化连续反应的两种或几种酶，可以利用基因融合的方法构成的融合蛋白，以催化连续的反应，将产生相互增效的协同效应。例如将-半乳糖苷酶和半乳糖脱氢酶组成融合蛋白，在一定条件下，融合蛋白偶联反应产生NADH 的速度是同时加入这两种单酶的反应速度的两倍以上，同时反应时间缩短了近四倍。,（二）靶向药物,靶向药物的“生物弹头”常以绿脓杆菌外毒素和白喉毒素最多。国内外已成功构建了许多这类的融合蛋白，并在研究中显示了较好的疗效。,（三）抗菌肽,以融合的形式将抗菌肽B (Cecropin B) 和人溶菌酶(hLyso)连接至高效的大肠杆菌表达载体上可以得到具有更高活性的抗菌和抗病毒的重组蛋白。,76,第五节 食物蛋白质改性技术,一、蛋白质的功能特性,蛋白质的功能特性（functionality）是指蛋白质赋予食品体系的系列物理化学性质。不同的食品体系对食物蛋白的功能特性要求不同。,(1)水合特性，也称水动力学特性（hydrodynamic properties)，包括溶解性、分散性、持水性、溶胀性、增稠性、润湿性及脱水收缩作用等；,(2)乳化特性，也称表面相关特性（surface-related properties），包括乳化性、发泡性、持水及持油性；,(3) 流变和质构性能，包括胶凝性、粘附性、弹性、内聚性、咀嚼性等。见表3-5。,77,表3-5 食品体系的蛋白质所具有的功能特性,二、食物蛋白的改性,（一） 化学改性，见表,3-6,78,表3-6 蛋白质化学改性与功能效果,（二）酶法水解改性 食物蛋白的深度酶解，可产生具有一定生理活性的生物活性肽（bioactive peptides）。蛋白肽具有许多优良的加工特性和生理活性功能 。（三） 酶法聚合改性,79,MTGase是一种能催化多肽或蛋白质的谷氨酰胺残基的-羟胺基团与伯胺化合物酰基受体之间的酰基转移反应的酶，通过该反应可共价导入蛋白质、氨基酸、多肽至同种或异种蛋白，或将氨基糖类、磷脂导入蛋白质形成多相共轭蛋白质(conjugated proteins)，如图3-7所示。,图3-7 转谷氨酰胺酶(TGase)催化的反应,a)酰基的转移反应；(b) 蛋白或多肽的Gln和Lys之间的交联反应；(c)脱胺反应,80,更重要的是MTGase可在同种或异种蛋白质分子内或分子间形成,-(-Glu)-Lys键桥，形成同质(homologous)和异质(heterologous)的蛋白生物高聚物(biopolymer)，此反应能显著改变蛋白质的功能性质。,（四）物理改性,高静压处理技术是通过,500,1,000,MPa,高压处理食品基料和产品，用于食品杀菌和修饰改性的一种现代食品加工技术。,81,第四章 食品与酶工程,第一节 酶工程的发展概况,第二节 酶的制备与发酵生产,第三节 酶的分子修饰,第四节 酶的非水相催化,第五节 酶的固定化,第六节 酶工程在食品工业中应用,82,酶的生产及其在生物反应器中进行催化应用技术过程称为酶工程（enzyme engineering）,第一节 酶工程的发展概况,直到,20,世纪,60,年代，固定化技术迅速发展，标志着酶工程产业化新的开端。,1969,年，日本千烟一郎首次在工业上应用固定化氨基酰化酶从,DL-,氨基酸生产,L-,氨基酸。,70,年代后期，出现了固定化细胞（固定化活细胞或固定化增殖细胞）技术。,20,世纪,80,年代以来，酶分子修饰技术发展很快，修饰方法主要有：酶分子主链修饰、酶分子侧链修饰、酶分子组成单位置换修饰、酶分子中金属离子置换和物理修饰等。,83,第二节 酶的制备与发酵生产,一、动植物细胞培养产酶,（一）植物细胞培养产酶,目前通过植物细胞培养生产的酶如表,4-1,。,1.,植物细胞的特性,在动植物细胞培养中，存在与微生物发酵显著不同的地方，应予以重视。这是由于动植物细胞和微生物细胞特性不同造成的。它们的不同特性如表,4-2,所示。,2.,植物细胞培养产酶的工艺流程,外植体细胞获取细胞培养分离纯化产物,3.,植物细胞培养产酶的工艺条件控制,84,表4-1 植物细胞培养产酶,表4-2 微生物、植物和动植细胞的特性比较,85,（1）培养基,植物细胞常用培养基有MS、B5、White和KM-8P培养基。,（2）温度和pH值,温度一般控制在室温范围（25左右）。植物细胞pH值一般控制在微酸性范围，即pH56，培养基配置时，pH值控制在5.5左右。,（3）溶氧量,溶解氧的供给一般要通过通风和搅拌。,（4）光照,（5）前体和刺激剂的添加,86,（二）动物细胞产酶,动物细胞培养是以,20,世纪,50,年代开始的病毒疫苗细胞培养为基础，,20,世纪,60,年代迅速发展起来的技术。,1,动物细胞的特性,（,1,）动物细胞与微生物细胞和植物细胞的最大区别在于没有细胞壁，适应环境的能力差。,（,2,）动物细胞的体积比微生物细胞大几十倍，比植物细胞稍小。,（,3,）动物细胞的营养要求比微生物细胞和植物细胞都复杂得多。,（,4,）大部分动物细胞在肌体内相互粘连以集群形式存在，在细胞培养中大部分细胞具有群体效应、锚地依赖性接触抑制性以及功能全能性。,（,5,）动物细胞的生长较慢，细胞倍增时间为,15,100h,，而且原代细胞继代培养,50,代后，即会退化死亡，需要重新分离细胞。,87,2、动物细胞培养的方式,动物细胞培养方法可分成两大类，一类是来自血液、淋巴组织的细胞、肿瘤细胞和杂交瘤细胞等，可以采用悬浮培养；另一类细胞来自于动物复杂的器官，具有锚地依赖性，即与其周围的细胞互相依存，有所谓“定位依存”关系。,3、动物细胞培养产酶的工艺条件的控制,（1）培养基,动物培养基的组分比较复杂，包括氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖、激素、生长因子等。,（2）温度,不同种类的动物细胞对温度要求不同，,（3）pH值,动物细胞培养的pH值一般控制在微碱性范围内,（4）渗透压,动物细胞培养液中渗透压应当与细胞内的渗透压处于等渗状态,（5）溶氧量,溶氧量对动物细胞培养至关重要。供氧不足时，细胞生长受到抑制；氧气过量时，又会对细胞产生毒害。,88,二、微生物发酵产酶,微生物发酵产酶是工业生产酶中最主要的方法。,（一）常用的产酶微生物,产酶微生物包括细菌、放线菌、霉菌和酵母菌等。下面将常用的产酶微生物的特点和应用以表,4-3,表示。,表4-3 常用产酶微生物特点及应用1,89,90,91,图4-1枯草杆菌生产中性蛋白酶的工艺流程图12,92,（二）微生物产酶的典型生产工艺流程,图4-2微生物胞内酶生产工艺流程,12,93,（三）发酵产酶工艺条件以及控制,1、培养基,（1）碳源,不同微生物对碳源的利用有所不同，因而根据细胞的营养需求而选择碳源。,（2）氮源,在微生物细胞中，一般异养型细胞要求有机氮源，自养型细胞则要求无机氮源。,（3）无机盐,无机盐的主要作用是提供细胞生命活动不可缺少的无机元素，并对培养基的pH值、氧化还原电位和渗透压起调节作用。,（4）生长因子,生长因素是指细胞生长繁殖所必须的微量有机化合物。,2、pH值,pH值调节方法可以采取改变培养基的组分或其比例，必要时可使用缓冲溶液，或添加适宜的酸、碱溶液，以调节控制培养基中pH值的变化。,、温度,必须经常及时地对温度进行调节控制，使培养基的温度维持在适宜的范围内。,94,4、溶氧量,溶氧量对于提高产酶量有重要作用。一般是无菌空气通入发酵容器。调节溶氧量的主要方法是调节通气量、调节氧分压、搅拌转速、调节气液接触时间、调节气液接触面积和改变培养液的性质等。,（四）提高酶产量的措施,1、添加诱导物,2、控制阻遏物浓度,3、添加表面活性剂,4、添加产酶促进剂,第三节 酶的分子修饰,通过各种方法改变酶分子的结构，从而使酶的某些特性和功能发生改变的技术称为酶分子修饰（,molecular modification of enzyme,）。,95,一、酶的化学修饰,（一）大分子结合修饰,如超氧化物歧化酶（SOD） ,经过大分子结合修饰后，其稳定性显著提高，半衰期延长70350倍（见表4-4）,表4-4 天然及经修饰的SOD在人血浆中的半衰期,（二）肽链有限水解修饰,肽链有限水解既可保持酶活力，又可降低其抗原性，对酶蛋白的应用极为有用。,（三）侧链基团修饰,96,（四）分子内或分子间交联,（五）氨基酸置换修饰,（六）金属离子置换修饰,二、酶的物理修饰,在物理因素作用下，次级键发生某些改变和重排，使酶分子的空间构象发生某些改变。,第四节 酶的非水相催化,一、非水相介质中酶催化反应特性,20,世纪,80,年代中期美国科学家,Klibanov,等人开创性的研究表明，许多酶在非水相中不仅不失活，而且在某些情况下其催化活力与水相中相当，从而奠基了非水相酶学的基础。,97,（三）非水介质中酶催化的特性,（1）热稳定性,许多酶在有机介质中比在水溶液中具有更高的热稳定性。,（2）改变底物的专一性,在有机介质中，由于酶分子活性中心的结合部位与底物之间的结合状态发生某些变化，致使酶的底物特异性发生改变。,（3）产生新的酶促反应,在有机介质中酶可催化一些在水溶液中本不可以进行的反应,（4）pH记忆,在有机介质中，酶所处的pH环境与酶在冻干与吸附到载体上之前所使用的缓冲液pH值相同，这种现象称为pH记忆。,98,二、有机介质中酶催化反应条件及其控制,（一）有机介质反应体系,常见有机介质反应体系包括以下几种：,（1）微水介质体系,微水介质体系是由有机溶剂和微量的水组成的反应体系，,（2）反胶束体系,反胶束是指在大量与水不相混溶的有机溶剂中，含有少量的水溶液，加入表面活性剂后形成的油包水的微小液滴。,（3）与水溶性有机溶剂组成的均一体系,（4）与水不溶性有机溶剂组成的两相或多相体系,（二）有机介质中酶催化反应条件及控制,（1）酶的选择,（2）水含量的控制,（3）有机溶剂的选择,（4）底物的选择和浓度控制,（5）pH值的控制,（6）温度的控制,99,第五节 酶的固定化,一、固定化酶制备方法,（一）吸附法,（,1,）物理吸附法,（,2,）离子吸附法,（二）包埋法,1,、凝胶包埋法,2,、半透膜包埋法,（三）共价键结合法,（四）交联法,上述各种固定化方法各其优缺点（表,4-5,所示）。,100,表4-5各种固定化方法的比较,二、固定化酶的性质与特点,（一）固定化酶的形状,固定化酶的形状依不同用途有颗粒、线条、薄膜和酶管等。颗粒状占绝大多数,101,（二）酶活力,酶经固定化后，其活力往往会下降。,（三）固定化酶的稳定性,固定化酶的稳定性一般都比游离酶提高得多，同时，提高其有效寿命，这对工业生产是有利的。,（1）热稳定性,热稳定性对酶工业应用是很重要的。,（2）对蛋白酶的稳定性,游离酶经过固定化后，它对蛋白酶的抵抗力提高了。,（3）操作稳定性,固定化酶在操作中可以长时间保留活力，半衰期在一个月以上即有工业应用价值。不同固定化酶的操作稳定性比较见表4-6。,102,表4-6 不同固定化酶的操作稳定性比较,固定化酶操作稳定性在应用中是一个关键因素，其操作稳定性通常以半衰期表示，其含义是指固定化酶活力下降为初活力一半所经历的连续工作时间。其半衰期可用下式表示：,103,其中KD为衰减常数， 是在时间t后，酶活力的残留分数,（,4,）储藏稳定性,大部分酶经固定化后，其储藏稳定性增强。,（四）固定化酶的催化特性,（,1,）底物专一性,（,2,）最适温度, 载体性质对最适,pH,值的影响, 产物性质对最适,pH,值的影响,（,4,）米氏常数,Km,（,5,）最大反应速度,Vmax,104,第六节 酶工程在食品工业中应用,一、淀粉水解酶类的特性及其应用,（一）淀粉酶类,淀粉酶类属水解酶中一大类，此类酶包括,-,淀粉酶、,-,淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、异淀粉酶等。,1. -,淀粉酶（,-amylase,）,-,淀粉酶（,1,4-D-glucan glucanohydrolase,，,EC.3.2.1.11,）广泛应用于淀粉质原料制造葡萄糖、高浓度麦芽糖浆及高果糖浆等淀粉糖的工业生产。,（,2,）淀粉酶的来源及性质,不同来源的,-,淀粉酶性质差异较大，如表,4-7,所示。,105,表4-7 各种-淀酚酶的性质,各种耐热性的,-,淀粉酶特性见表,4-8,。,表4-8 各种耐热性-淀粉酶的特性1,106,-淀粉酶(-amylase),-淀粉酶（1,4-D-glucan maltohydro1ase，EC 3.2.1.2）作用于淀粉分子，常见的植物-淀粉酶的性质如表4-9所示。,表4-9 植物-淀粉酶的性质,不同来源的,-,淀粉酶性质比较如表,4-10,。,107,表4-10 不同来源的-淀粉酶性质比较,108,葡萄糖淀粉酶,葡萄糖淀粉酶（,-D-glucoside glucohydrolase,，,EC 3.2.1.3,）对淀粉的水解作用也是从淀粉分子非还原端开始，依次水解一个葡萄糖分子，能将淀粉分子降解生成葡萄糖，又称为糖化酶,(saccharogenic amylase),表4-11 黑曲霉葡萄糖淀粉酶水解双糖的速度,109,脱支酶（debranching enzymes，EC3.2.1.9）,脱支酶对支链淀粉、糖原等分支酶的-1,6糖苷键有专一性。各种微生物脱支酶的性质见表4-12。,表4-12 微生物脱支酶的性质,110,二、酶法生产淀粉糖的产业化,（一）双酶法生产葡萄糖,双酶法一次结晶生产注射葡萄糖工艺是可行的。以玉米淀粉乳为原料，采用-淀粉酶和糖化酶的双酶法生产淀粉葡萄糖浆的生产工艺流程为图4-4所示。,图 4-4双酶法制糖工艺流程图,1.调浆配料槽 2.8过滤器 3.9、14、17泵 4.喷射加热器,5.缓冲器 6.液化层流罐 7.液化液贮槽 11灭酶罐,12板式换热器 13糖化罐 15压滤机 16糖化暂贮槽 18贮糖槽,111,（二）酶法生产啤酒专用糖浆的产业化,根据啤酒专用糖浆研究开发情况，可包括大麦糖浆、营养型麦芽糖浆和功能性糖浆三大类；,（1）大麦糖浆,以大麦和麦芽为原料，经高温淀粉酶液化和复合糖化酶糖化 。其生产工艺流程：,112,（3）功能性糖浆,目前用于啤酒生产的功能性糖浆主要为低聚异麦芽糖浆，其生产工艺流程如下：,（三）酶法生产果葡糖浆产业化,果葡糖浆的生产工艺如图,4-4,，主要有以下几个步骤：,113,（四）酶法生产超高麦芽糖浆的产业化,麦芽糖纯度高达75%85%以上的麦芽糖浆称为超高麦芽糖浆，各种麦芽糖浆的主要组成成分如表4-13所示。,表4-13 各种麦