感受态制备、蓝白斑筛选

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,分 子 医 学 实 验,感受态细胞的制备,质粒转化入大肠杆菌及初步筛选,复习：基因克隆示意图,基因克隆,操作过程：,分,分离载体和目的基因,切,限制酶切载体与目的基因,接,拼接重组体,转,转入受体菌,筛,筛选重组体,基因工程,一、感受态细胞及重组体转化,重组,体,转,入受体菌,受体细胞,转化（,transformation,）,转染（,transfection,）,转导（,transduction,）,转化,是,将含有目的基因的质粒导入细菌内进行表达。,转染,是将含有真核生物基因的噬菌体感染细胞;,转导,则是指病毒从被感染的细胞(供体)释放出来，再,次感染另一细胞(受体时)，发生供体细胞与受体,细胞之间的,DNA,转移及基因重组。,重组,DNA,分子导入受体细胞的手段,转化方法,CaCl,2,诱导转化,电穿孔,PEG,介导转化,人工体外包装,特殊处理,受体细胞,细胞膜特性改变,CaCl,2,处理,受体细菌,50-100mmol/L,CaCl,2,感受态细菌,重组体转入细菌,感受态(,competent)：,宿主细胞处于容易吸收外源性,DNA,的状态，处于感受态的细胞称为感受态细胞.,正常细胞都有细胞膜（细菌还有细胞壁）作屏障，对外源分子选择性接受。在实验中通过一定的理化条件使细胞通透性增大，处于感受态。,制备感受态细胞和转化的常用方法,CaCl,2,转化程序法,：,传统方法,转化效率能达到5,10,6,2,10,7,转化子/,g,质粒,DNA,，简单、快速、重复性好、菌株适用范围广。,电穿孔转化法、脂质体(,liposome),法、胞核的显微注射法(,microinjection)；,磷酸钙介导的转染、聚乙二醇介导的原生体转化法；,CaCl,2,法制备感受态细胞和转化的原理,一般受体菌对重组,DNA,分子的摄取能力很低，难以转化成功。当细菌处于冰冷（0）0.050.1,M,的,CaCl,2,低渗溶液中，菌体的细胞膨胀成球形，细胞膜的通透性增加，对,DNA,的摄取能力增强，转化效率提高（感受态细菌）。,同时在转化体系中的,DNA,形成的抗,DNase,的羟基,-,钙磷酸复合物能粘附于细菌表面，经过42短时间热休克（,heat shock）,处理，促进感受态细胞吸收,DNA,复合物。在丰富培养基上生长1小时后，球状细胞复原并分裂增殖，重组子中的基因在转化细菌中得到表达，在选择性培养(,selective culture),平板上即可筛选出所需的转化子。,0.1mol/LCaCl,2,0,重组体,感受态细胞,转化(,transformation)：,在分子克隆技术中，转化特指质粒,DNA,或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。,区别转化、转染(,transfection,),与转导(,transduction),转化与感受态细胞,二、感受态细胞制备及重组体转化的实验操作及注意事项,细菌转移到一冰冷的1.5,ml,的,EP,管，4,0,C，4000rpm5min,弃上清，沉淀中加入冰冷的0.1,mol/L CaCl,2,300l,，,重悬菌体，冰浴20,min,4,0,C,，,4000rpm,5min,弃上清，将管倒置于滤纸上1,min，,使液体流干净,沉淀中加入冰冷的0.1,mol/L CaCl,2,100l,，,重悬菌体。,冰浴,10min,冰浴,10min,后,每管加入质粒,5,l,轻轻旋转试管，混匀混合物，在冰浴上放置20,min,试管放入42,0,C,的水浴中，放置,90,s，,不要摇动试管,迅速将试管转移到冰浴，冷却12,min,取出试管后，每管加入,LB,培养基800,l，,置于37,0,C,摇床（100150,r/min），,温和震荡45,min,用无菌弯头玻璃铺菌器将200,l,菌液铺于含,Amp,的琼脂平板表面,室温放置20,min，,使液体被吸收（发汗）,倒置平皿，37,0,C,培养，12小时可见菌落生长,三、重组体的筛选,重组体克隆的,筛,选与鉴定,由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法得到含有重组,DNA,的阳性克隆。,筛选的依据：,基因载体的特点、受体细胞的特性和外源基因的表达。,筛选的方法：,抗药性标志的选择,插入表达筛选,-半乳糖苷酶系统筛选（,-互补）,(,-半乳糖苷酶能将,X-gal,转变为不溶性的深蓝沉淀）,(,插入失活法,),抗药性标记选择,目 录,菌落杂交筛选法,内切酶图谱鉴定,PCR,筛选重组子,Southern,印迹杂交和菌落原位杂交,DNA,序列分析,免疫化学检测法,原理：基因载体上含有,-,半乳糖苷酶（,LacZ,),的基因，当外源,DNA,插入到载体的,LacZ,基因上后将造成,-,半乳糖苷酶失活，就不能分解培养基中的,X-gal(5-,溴-4-氯-3-吲哚-,-D-,半乳糖苷）产生蓝色产物，结果可通过大肠杆菌转化子菌落在含有,X-gal-IPTG（,异丙基-,-D-,硫代半乳糖苷）培养基的颜色变化直接观察出来。,蓝白斑实验,互补的检测,目 录,U6,原位杂交,目 录,Southern,印迹,目 录,鸡的,肌球蛋白的克隆和检出,目 录,预 期 结 果,pUC119,含空载体,pUC119,的蓝色菌落,含,pUC119 -u6,的白色菌落,pUC119 -u6,培养基：,Amp,X-gal,培养基：,Amp,X-gal,Thank you,！,