细菌的基因重组

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第五节 细菌的基因转移和重组,凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式，称为,基因重组,（,gene recombination,）,或,遗传重组,（,genetic recombination,），,简称,重组,。,作用：,重组可使生物体在未发生突变的情况下，也能产生新遗传型的个体。,重组与杂交的关系：,重组,是分子水平上的一个概念，可以理解成是遗传物质,分子水平,上的杂交,而一般所说的,杂交,（,hybridization,）则是,细胞水平,上的一个概念。,杂交中必然包含着重组，,而重组则不限于杂交这一形式。,真核微生物中的有性杂交、准性杂交（,parasexual,hybridization,）等及原核生物中的转化、转导、接合和原,生质体融合等都是基因重组在细胞水平上的反映。,微生物中各种形式基因重组的比较,重组范围,供体和受体的关系,整套染色体,局部杂合,高频率,低频率,部分染色体,个别或少数基因,细胞融合或联结,性细胞,真菌的有性生殖,体细胞,真菌的准性生殖,细胞间暂时沟通,细菌的接合,性导,细胞间,不接触,吸收游离,DNA,片段,转化,噬菌体携带,DNA,转导,由噬菌体提供遗传物质,完整,噬菌体,溶源转变,噬菌体,DNA,转染,基因重组的意义,基因重组是杂交育种的理论基础。,杂交育种的优点：,由于杂交育种选用了已知性状的供体菌和受体菌作为亲本，因此，不论在方向性还是自觉性方面，均比诱变育种前进了一大步。,利用杂交育种往往还可以消除某一菌株在经过长期诱变处理后所出现的产量上升缓慢的现象，因此，它是一种重要的育种手段。,基因重组的意义,杂交育种的缺点：,由于杂交育种的方法较复杂，工作进展较慢，还很难像诱变育种技术那样得到普遍的推广和使用，尤其在原核生物的领域中，应用转化、转导或接合等重组技术来培育可应用于生产实践上的高产菌株的例子还不多见。到了,70,年代后期，由于原生质体融合技术获得巨大的成功后，才使重组育种技术获得了飞速的发展。,原核生物的基因重组,原核生物的基因重组形式很多，机制较原始。,特点：, 片段性，仅一小段,DNA,序列参与重组；, 单向性，即从供体菌向受体菌（或从供体基因组向受体基因组）作单方向转移；, 转移机制独特而多样，如接合、转化和转导等。,（一）接合,（,conjugation，mating）,供体菌,（“雄性,”）,通过,性毛,与,受体菌,（“雌性”）直接接触，把,F,质粒,或其携带的不同长度的,核基因组片段,传递给后者，使后者获得若干新遗传性状的现象，称为,接合,。通过接合而获得新遗传性状的受体细胞，就是,接合子,（,conjugant,）。,1946年，,Joshua,Lederberg,和,Edward L.,Taturm,细菌的多重营养缺陷型杂交实验,通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程,中间平板上长出的原养型菌落是两菌株之间发生了遗传交换和重组所致！,A,B,-,-,过滤器,U,型管实验,存在范围：,细菌：,G,较为多见如,E. coli(,大肠杆菌,),、,Salmonella(,沙门氏菌,),、,Shigella,(,志贺氏菌,),、,Serratia(,粘质沙雷菌,),、,Vibrio(,弧菌属,),、,Azotobacter(,固氮菌,),、,Klebsiella(,克雷白氏杆菌属,),和,Pseudomonas(,假单胞菌属,),等最为常见,放线菌：,Streptomyces,(,链霉菌属,),、,Nocardia,(,诺卡氏菌属,),接合还可发生在,不同属,的菌种之间，如,E. coli,与,Salmonella,typhimurium,之间或,S.,typhimurium,与,Shigella,dysenteriae,之间,大肠杆菌的接合机制,接合作用是由一种被称为,F,因子的质粒介导,F,因子的分子量通常为510,7,，上面有编码细菌产生性毛（,sex,pili,）,及控制接合过程进行的20多个基因。,含有,F,因子的细胞：“雄性”菌株（,F,+,），,其细胞表面有性毛,不含,F,因子的细胞：“雌性”菌株（,F,-,），,细胞表面没有性毛,F,因子为附加体质粒,可脱离染色体在细胞内独立存在，可插入（整合）到染色体上,F,因子的四种细胞形式,a）,F,-,菌株,， 不含,F,因子，没有性毛，但可以通过接合作用接收,F,因子而变成雄性菌株（,F,+,）；,b）,F,+,菌株,，,F,因子独立存在，细胞表面有性毛。,c,）,Hfr,菌株,，,F,因子插入到染色体,DNA,上,，细胞表面有性毛。,d,）,F,菌株,，,Hfr,菌株内的,F,因子因不正常切割而脱离染色体时， 形成游离的但携带一小段染色体基因的,F,因子，特称为,F,因子。 细胞表面同样有性毛。,接合的一般过程,接合时,F,+,细胞与,F,细胞相遇，性菌毛与,F,细胞表面发生吸附而形成接合管；,F,+,细胞内，,F,因子的一条,DNA,单链在特定的位点上发生断裂；,断裂后的单链逐步解开，同时以另一条留存的环状单链做模板，通过模板的滚动，一方面把解开的单链以,5,为先导通过性菌毛推入,F,细胞中，另一方面，在供体细胞内以滚动的环状模板重新合成一条互补的环状单链，以取代传递到,F,细胞中的那条单链。这种,DNA,复制机制称为滚环模型（,rolling circle model,）；,在,F,细胞中，以外来的供体,DNA,线状单链为模板合成一条互补单链，并随之恢复成环状双链,F,因子。,至此，原来的,F,菌株变成了,F,+,菌株。原来的供体仍为,F,+,菌株。,（二）转导,（,transduction）,通过,病毒,（,defective phage,）,的媒介，把供体细胞的小片段,DNA,携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为,转导,。获得新遗传性状的受体细胞，就称,转导子,（,transductant,）。,由噬菌体介导的细菌细胞间进行遗传交换的一种方式：,一个细胞的,DNA,通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中,能将一个细菌宿主的部分染色体或质粒,DNA,带到另一个细菌的噬菌体称为,转导噬菌体,。,细菌转导的二种类型：,普遍性转导,局限性转导,流产普遍转导,完全普遍转导,1.,普遍转导,（,generalized,transduction,）,通过极少数,完全缺陷噬菌体,对,供体菌,任何小片段,DNA,进行“误包”，而将其遗传性状传递给,受体菌,的现象，称为,普遍转导,。,一般用温和噬菌体作为普遍转导的媒介。,（1）,完全普遍转导,简称,普遍转导,或,完全转导,（,complete transduction,）,。经转导噬菌体的媒介而获得了供体菌,DNA,片段的受体菌，外源,DNA,在其内进行,交换、整合和复制,，使其成为一个遗传性状稳定的重组体，称作,普遍转导子,，这种现象就称普遍转导。,Salmonella,typhimurium,（,鼠伤寒沙门氏菌）,的野生菌株,Salmonella,typhimurium,（,鼠伤寒沙门氏菌）,的营养缺陷型突变株,P22,嗜菌体,供体菌,受体菌,转导模型,供体菌,受体菌,转导媒介噬菌体,误包,转导颗粒,普遍转导子,双交换,同源配对,10,-6,10,-8,过程：,（,1,）,P22,在供体菌内增殖时，宿主的核染色体组断裂，待噬菌体成熟与包装之际，极少数（,10, 6,10, 8,）噬菌体的衣壳将与噬菌体头部核心大小相似的一段供体,DNA,片段误包入其中，形成了一个完全不含噬菌体自身,DNA,的缺陷噬菌体。,（,2,）供体菌裂解时，如把少量裂解物与大量受体菌群体相混，这种完全缺陷噬菌体就会将这一外源,DNA,片段导入受体细胞内。,（,3,）在这种情况下，由于一个受体细胞只感染了一个完全缺陷噬菌体，故受体细胞不会发生往常的溶原化，也不显示其免疫性，更不会裂解和产生正常的噬菌体；而由于导入的外源,DNA,片段可与受体细胞核染色体组上的同源区段配对，在通过双交换而整合到受体菌染色体组中，所以使后者成为一个遗传性状稳定的转导子。,S.,typhimurium,的,P22,噬菌体,、,E.,coli,的,P1,噬菌体,、,Bacillus,subtilis,的,PBS1,和,SP10,等噬菌体,都能进行,完全普遍转导,。,供体菌,转导媒介噬菌体,受体菌,（2）,流产普遍转导,简称,流产转导,（,abortive,transduction,）,。,经转导噬菌体的媒介而获得了供体菌,DNA,片段的受体菌，外源,DNA,在其内既,不进行交换、整合和复制,，也不迅速消失，而仅进行转录、转译和性状表达，这种现象就称流产转导。,受体菌,外源,DNA,细胞分裂,外源基因经转录、转译而形成的少量酶,获得外源,DNA,获得少量酶,不断稀释,特点：在选择培养基平板上形成微小菌落,DNA,不能复制，因此群体中仅一个细胞含有,DNA，,而其它细胞只能得到其基因产物，形成微小菌落。,普遍性转导的三种后果：,进入受体的外源,DNA,通过与细胞染色体的重组交换而形成稳定的,转导子,。,流产转导,（,abortive,transduction,）,转导,DNA,不能进行重组和复制，但其,携带的基因可经过转录而得到表达。,特点：在选择培养基平板上形成微小菌落,外源,DNA,被降解，转导失败。,DNA,不能复制，因此群体中仅一个细胞含有,DNA，,而其它细胞只能得到其基因产物，形成微小菌落。,2.,局限转导,（,specialized,transduction,， restricted,transduction,）,指通过,部分缺陷的温和噬菌体,把,供体菌,的少数,特定基因,携带到,受体菌,中，并与后者的基因组整合、重组，形成转导子的现象。,最初于1954年在,E. coli,K12,中发现。,特点：,只,局限于传递供体菌核染色体上的,个别特定基因,，,一般为噬菌体整合位点两侧的基因；,该特定基因由,部分缺陷的温和噬菌体,携带；,缺陷噬菌体的形成方式是由于它在脱离宿主染色体过程中，发生低频率（10,-5,）,“误切”,（不正常切离，,abnormal,excesion,）,或由于双重溶源菌的,裂解,而形成；,局限转导噬菌体的产生要通过,UV,等因素对溶源菌的,诱导,并引起裂解后才产生。,局限转导,低频转导,高频转导,根据转导子出现频率的高低分类,温和噬菌体感染,整合到细菌染色体的特定位点上,宿主细胞发生溶源化,溶源菌因诱导而发生裂解时，在前噬菌体二侧的少数宿主基因因偶尔发生的不正常切割而连在噬菌体,DNA,上,部分缺陷的温和噬菌体,把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中,缺陷噬菌体在宿主细胞内能够象正常的,DNA,分子一样进行复制、包装，提供所需要的裂解功能，形成,转导颗粒,。,但没有正常噬菌体的,溶源性和增殖能力,，感染受体细胞后，通过,DNA,整合进宿主染色体而形成稳定的,转导子,。,E.,coli,的,嗜菌体,和,80,嗜菌体,具有局限转导的能力。,比较项目,普遍性转导,局限性转导,转导的基因,供体染色体或染色体外的任何基因,供体染色体上与原噬菌体紧密连锁的少数几个个别基因,噬菌体寄生的位置,不结合在寄主染色体特定位置上,结合在寄主染色体特定位置上,获得转导噬菌体的方法,通过敏感菌的裂解或容源菌的诱导,紫外线诱导容源菌,转导子的区别,一般稳定，非溶原性（不表现出任何噬菌体的性状，包括免疫性）,一般不稳定，呈缺陷溶原性（对同源噬菌体具有免疫性，但不表现出其它噬菌体的性状）,普遍性转导和局限性转导的比较,受体菌,（,recipient cell，receptor,）,直接吸收,供体菌,（,donor cell,）,的,DNA,片段而获得后者部分遗传性状的现象，称为转化或转化作用。,通过转化方式而形成的杂种后代，称,转化子,（,transformant,）,。,（三）转化,（,transformation）,1.,定义,原核生物,Streptococcus,pneumoniae,（,肺炎链球菌）、,Haemophilus,（,嗜血杆菌属）、,Bacillus,（,芽孢杆菌属）、,Neisseria,（,奈瑟氏球菌属）、,Rhizobium,（,根瘤菌属）、,Staphylococcus,（,葡萄球菌属）、,Pseudomonas,（,假单胞菌属）、,Xanthomonas,（,黄单胞菌属）等。,2.,转化微生物的种类,真核微生物,Saccharomy cescerevisiae,（,酿酒酵母）、,Neu,-,rosporacrassa,（,粗糙脉孢菌）、,Aspergillusniger,（,黑曲霉）等。,受体细胞要处于感受态,.,感受态,：,competence,，,受体细胞能从环境吸取外源,DNA,片段并实现其转化的一种生理状态,供体,DNA,片段,（,转化因子,）,大小适宜，分子量一般为1, 10,7,D,左右,菌株间的亲缘关系密切,3,、转化发生的条件,感受态,（,competence,）,感受态,是指受体细胞最易接受外源,DNA,片段并能实现转化的一种生理状态。,研究发现，能发生转化的受体细胞都处于感受态。,感受态细胞,（,competent cell）,具有摄取外源,DNA,能力的细胞。,自然感受态,是细胞一定生长阶段的生理特性，受细菌自身的基因控制；,人工感受态,则是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取,DNA,的能力，或人为地将,DNA,导入细胞内。,（该过程与细菌自身的遗传控制无关！）,感受态,感受态受遗传控制，但也存在个体差异。,感受态出现的时间不同；,出现时间：只在细菌生长的某一时期出现；不同菌种的感受态出现在不同生长时期,Streptococcus,pneumoniae,（肺炎链球菌）的感受态出现在生长曲线中的指数期的中期，,Bacillus,（,芽胞杆菌属,）的一些种则往往出现在指数期末及稳定期的初期。,感受态,感受态细胞的比例：当处于感受态高峰时，群体中呈感受态的细胞因菌种而不同,.,Bacillus subtilis,不超过,1015%,Streptococcus pneumonia,和,Haemophilus influenzae,（,流感嗜血杆菌）达到,100%,感受态由细胞的遗传性决定，但同时也受环境因子的影响：,cAMP,、,Ca,2+,等最明显。如用,CaCl,2,处理,E. coli,可以诱发其产生感受态。,转化,DNA,的最低浓度：在群体中含有,15%,感受态细胞时，,0.1,gDNA/ml,细胞悬液即可有效发生转化,调节感受态的一类特异蛋白称,感受态因子,。,膜相关,DNA,结合蛋白,（,membrane-associated DNA binding protein,）,细胞壁,自溶素,（,autolysin,）,几个核酸酶,转化因子,（,transforming principle,）,转化因子,的本质是离体的,DNA,片段。一般只有15,kb,左右。,在不同的微生物中，转化因子的形式不同。,良好的转化因子有,dsDNA,（,最宜于细胞表面结合）、,ssDNA,和,质粒,DNA,，,通常不能与核染色体组发生重组。,转化的频率通常为,0.11.0,，最高为20。能发生转化的最低,DNA,浓度极低，为化学方法无法测出的110,5,m,g,mL,（,即,110,11,g,mL,）。,自然遗传转化,（,natural genetic transformation）,人工转化,（,artificial transformation）,4,、转化的类型,根据感受态建立的方式，可以分为：,5.,转化过程,（1）自然遗传转化（简称自然转化）,1928年，,Griffith,发现肺炎链球菌（,Streptococcus,pneumoniae,）,的转化现象，,转化过程研究得较深入的就是这种,G,细菌。,目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力,进行自然转化，需要二方面必要的条件：,建立了感受态的受体细胞,外源游离,DNA,分子,转化的过程,以,S. Pneumonia,strr,（肺炎链球菌抗链霉素菌株）为例，大致可分为六阶段：,吸附：,双链,DNA,片段与细胞表面的特定位点（主要在新形成细胞壁的赤道区）结合，此时，细胞膜上的胆碱可促进这一过程。在吸附过程的前阶段，如外界加入,DNA,酶，就会减少转化子的产生。稍后，,DNA,酶即无影响，说明此时该转化因子已进入细胞；,切割：,在吸附位点上的,DNA,被核酸内切酶分解，形成平均分子量为,4510,6,的,DNA,片段；,入胞,：,DNA,双链中的一条单链被膜上的另一种核酸酶切除，另一条单链逐步进入细胞，这是一个耗能的过程。分子量小于,510,5,的,DNA,片段不能进入细胞。这时如用低浓度溶菌酶处理，因它提高了细胞壁的通透性，故可提高转化频率；,转化的过程,重组：,来自供体菌的单链,DNA,片段在细胞内与受体细胞核染色体组上的同源区配对，接着受体染色体组上的相应单链片段被切除，并被外来的单链,DNA,交换、整合和取代，于是形成了一个杂合,DNA,区段（,heterozygous region,）。在这一过程中，有核酸酶、,DNA,聚合酶和,DNA,连接酶的参与；,复制：,受体菌的染色体组进行复制，杂合区段分离成两个，其中之一获得了供体菌的转化基因，另一个未获供体基因；,转化子形成：,当细胞发生分裂后，一个子细胞含供体基因，这就是转化子；另一个细胞与原始受体菌一样。,枯草芽孢杆菌的自然转化过程（革兰氏阳性菌的转化模型）,str,R,，,存在抗链霉素的基因标记,str,S,，,有链霉素敏感型基因标记,自然转化过程的特点：,a）,对核酸酶敏感；,c）,转化是否成功及转化效率的高低主要取决于转化（,DNA）,供体菌和受体菌之间的亲源关系；,d）,通常情况下质粒的自然转化效率要低得多；,b）,不需要活的,DNA,给体细胞；,提高质粒的自然转化效率的二种方法：,1）使质粒形成多聚体，这样进入细胞后重新组合成有,活性的质粒的几率大大提高；,2）在质粒上插入受体菌染色体的部分片段，或将质粒转化进含有与该质粒具有同源区段的质粒的受体菌,重组获救,。,（2）人工转化,用,CaCl,2,处理细胞，电穿孔等是常用的人工转化手段。,在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段，是基因工程的奠基石和基础技术。,不是由细菌自身的基因所控制；,用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一种可以摄取外源,DNA,的“人工感受态”。,质粒的转化效率高；,可转化的形状,荚膜多糖的合成,专一性酶的合成,专一性蛋白质的合成,抗药性,（四,）,原生质体融合,（,protoplast fusion）,通过人为的方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定的重组子的过程，称为,原生质体融合,。,由此法获得的重组子，成为,融合子,（,fusant,）。,适用范围：,各种生物细胞都能进行原生质体融合，包括各种原核生物、真核微生物以及高等动植物和人体的不同细胞。,意义：,70,年代后发展的一种育种新技术，继转化、转导和接合之后一种更有效的转移遗传物质的手段。原生质体融合不仅能在不同菌株或种间进行，还能做到属间、科间甚至更远缘的微生物或高等生物细胞间的融合。,发展点：,有关原生质体融合的遗传机制，尚未研究清楚，目前还在探索中。,选择两个有特殊价值的并带有选择性遗传标记的细胞作为亲本,脱壁酶,细菌或放线菌可用,溶菌酶,或,青霉素,处理，,真菌可用,蜗牛酶,或其他相应的,脱壁酶,等,离心聚集,在高渗溶液中稀释,加入促融合剂或电脉冲,各种选择性培养基,原生质体融合的主要步骤是：,选择亲株, ,制备原生质体,原生质体融合, ,原生质体 再生, ,筛选优良性状的融合重组子,原生质体融合的重组频率已大于,10,-1,（而诱变育种一般仅为10,-6,）；,同种的不同,菌株间,或,种间,进行融合，,属间、科间,甚至更远缘的微生物或高等生物细胞间的融合，以期达到生产性状更为优良的新物种,。,原生质体融合的优点：,可以提高重组率,双亲可以少带标记或不带标记,可进行多亲本融合,有利于不同种间、属间微生物的杂交,通过原生质体融合提高产量,二、真核微生物的基因重组,有性杂交,准性杂交,原生质体融合,遗传转化,（一）有性杂交,（,sexual hybridization）,杂交,是在细胞水平上发生的一种遗传重组方式。,有性杂交,，一般指不同遗传型的两性细胞间发生的接合和随之进行的染色体重组，并产生新遗传型后代的一种育种技术。,（二）准性杂交,（,parasexual,hybridization）,准性生殖是一种类似于有性生殖，但比它更为,原始,的一种两性生殖方式，这是一种在同种而不同菌株的体细胞间发生融合，它可不借减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子。,