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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2015-10-07,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2015-10-07,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2015-10-07,#,张彦婷,郑州大学生命科学学院,蛋白质芯片,蛋白质组学,基因是遗传信息的源头，但功能性蛋白才是基因功能的执行体。但基因表达与蛋白质水平两者之间并不完全一致。, 100,000 proteins,3,billion,bases,30,000,genes,转录水平调节,如：,mRNA,剪接,翻译水平调节,如：翻译起始与终止位点的变化,翻译后水平调节,如：蛋白加工修饰,2,蛋白质组学,(proteomics),以,蛋白质组为研究对象，分析细胞内,动态变化,的蛋白质组成成分、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，在,整体水平,上研究蛋白质的组成与调控的活动规律,。,蛋白质,组学需要采用的高能量和大规模的研究手段，蛋白质芯片技术就是顺应这一需要而发展起来的。,3,蛋白质组学,基因芯片的局限性,蛋白质受多水平调控,蛋白质的生物学活性并非都是基因表达发生变化的结果,以基因组为基础的方法具有明显的局限性,生,物,芯,片,基因芯片,蛋白质芯片,芯片实验室,蛋,白质芯片,又称,蛋白质阵列,或,蛋白质微阵列,，,是在固体表面上固定千万种纯化的蛋白质、多肽作为,捕捉分子,，如抗体、受体,或酶和其他小分子蛋白质，用带标记（或不带标记）的抗原、配体、酶底物或其他蛋白质,与阵列的捕捉分子进行结合检测,，以测定相应蛋白质的性质、特,征及,蛋白质与生物大分子之间的相互作用的方法,。,蛋白质,芯片,Example,High-content (,高密度,),每张芯片同一样品可同时检测多达数百种指标。,Omics Tool (,蛋白质组学的工具,),可用于分析反应的模式。,High Throughput (,高,通,量,),每天完成多至上千样品的测试。,Miniaturization,微型化,节省,样品和试剂,实验空间,仪器设备,High sensitivity, specificity and reproducibility,高灵敏，高特异性，重复性,蛋白芯片是通过芯片矩阵平台同时检测多种蛋白质表达及功能的技术,蛋白质芯片的优点,蛋白质芯片的意义,蛋白质是基因表达的最终产物,接近生命活动的物质层面；,探针蛋白特异性高、亲和力强,可简化样品前处理，甚至可直接利用生物材料,(,血样、尿样、细胞及组织等,),进行检测；,适合高通量筛选与靶蛋白作用的化合物；,有助于了解药物或毒物与其效应相关蛋白质的相互作用。,蛋白质芯片面临的挑战,蛋白质的脆弱性,尚无有效的蛋白质扩增系统,蛋白质的配体制备相当繁琐,蛋白质的结构复杂,蛋白质存在多种变异体,蛋白质的表达存在着时空性,根据制作方法和用,途,蛋白质,功能芯片,蛋白质,检测芯片,蛋白质芯片的分类,又称蛋白质分析芯片或蛋白质表达芯片。,主要包括,抗体芯片、抗原芯片、配体芯片、碳水化合物芯片,等。,它是将具有,高度亲和特异性的探针分子,(,如单克隆抗体,),固定在基片上,用以识别复杂生物样品溶液,(,如细胞提取物,),中的,目标多,肽,当放射性同位素或荧光标记的靶分子与芯片上的探针分子结合后,通过激光共聚焦扫描或电荷,耦,合检测装置,(CCD),对信号的强度进行检测,从而,判断样品中靶分子的数量,。,蛋白质检测芯片,蛋白质芯片的分类,是研究蛋白质间、蛋白质修饰、,DNA-,蛋白质间、,RNA-,蛋白质间、蛋白质与脂质、蛋白质与药物、酶与底物、小分子蛋白质等,相互作用的芯片,。,它是将所研究体系中的,每种天然蛋白质点加在基片上制成芯片,用于天然蛋白质活性及分子亲和性的高通量平行研究。,要了解体系中有哪些蛋白质能与蛋白质结合,则将制成的蛋白质功能芯片与荧光标记的蛋白质温育,经荧光显微镜扫描检测可知,芯片上的亮点即为蛋白质的潜在结合物。蛋白质功能芯片主要用来检测蛋白质的生物学活性。,蛋白质功能芯片,蛋白质芯片的分类,提出生物学问题,（实验目的）,样品预处理,（重组蛋白，制备一、二级抗体,，荧光标记,，配蛋白印记缓冲液）,生化反应,（化学,偶合，加底物，,反应温度和时间，,冲洗,条件）,检测,（荧光和比色扫描或拍照，,参数设置）,数据分析和建模,（图象量化，标准化，,采集,蛋白信息，建立模型）,1,2,3,4,5,蛋白质芯片制备,6,蛋白质芯片的关键技术,蛋白质,芯片操作流程,蛋白质,芯片操作流程,蛋白质芯片的制备,蛋白质芯片的检测,Liquichip,液相蛋白芯片系统,蛋白质芯片的应用,蛋白质,芯片,载体的选择,捕获,分子（探针）,固定,方法,蛋白质芯片的制备,载体的选择,载体：,用于连接、吸附或包埋各种生物分子使其以水不溶状态行使功能的固相材料,制备蛋白质芯片的载体必须符合：,载体表面必须有可以进行化学反应的活性基团,使结合的蛋白质分子达到最佳容量,应当是惰性的,具有良好的生物兼容性,1.,玻片,优点,常用的,玻片表面修饰方法,包括氨基、醛基、环氧基、聚赖氨酸、链霉亲合素修饰等。,这类载体大部分是通过共价键或特殊分子间的高亲合力来固定蛋白质结合牢固且构象变化较少,载体的选择,2.,薄膜,聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶,等,将聚丙烯酰胺或琼脂糖等凝胶包被于玻片或滤膜表面，再引入可与蛋白质结合的活性基团，从而形成一种,三维立体结构的载体,优点：,对探针的固定能力强，能更好地保持蛋白质的活性,载体的选择,3.,金膜,采用金膜作为蛋白质芯片的载体主要是通过表面分子自组装技术进行抗体固定,载体的选择,含硫化合物,在金表,面通过,极性共价键形成,自组装,成,膜，,Au-S,键,极易自发,形成,随后利用,尾端的功能基团直接或,在活化剂,(,或偶联剂,),的作用下连接上生物功能分子，从而实现生物功能分子与基底的稳定结合,4,.,液相,载体,由许多不同的小球体为主要基质构成，每种小球体上固定有不同的探针分子，将这些小球体悬浮于一个液相体系中,载体的选择,理想的捕获分子,对靶分子具有高度特异性和亲和力,容易进行生产和操作,具有可利用的大分子文库用来建立高度密集的微阵列,捕获分子,抗体,适配体：即寡聚核苷酸,多肽,小分子配体,重组蛋白,捕获分子,抗体,传统方法：,杂交瘤技术（细胞融合）,新方法：,噬菌体展示技术,捕获分子,适配体：即寡聚核苷酸,核酸适配体是一小段经体外筛选得到的寡核苷酸序列,能与相应的配体进行高亲和力和强特异性的结合,捕获分子,物理吸附：,通过分子间作用力将蛋白质固定到载体表面,共价结合：,指用功能基团修饰原本惰性的载体通过与氨基酸的支链基团共价连接形成不可逆的探针表面,间接偶联：,先在载体表面引入桥接分子，如生物素亲和素体系,DNA,引导的固定：,是一种新颖的探针固定方式，其原理是通过将蛋白探针预先与寡核苷酸交联，然后通过与载体表面上的互补链杂交的方式固定到载体表面,无细胞原位蛋白质合成技术,固定方法,蛋白质芯片的点样方式均是采用合成后转移到载体上的方式,人工制备,自动化制备仪：接触式、非接触式（点喷印法、压电机器分配法）,固定方式,无细胞原位蛋白质合成技术,无细胞蛋白质合成系统是一种,以,mRNA,或,DNA,为模板,，在,细胞抽提物的酶系,中补充底物和能量来合成蛋白质的体外系统。,固定方法,以质粒为底物合成无细胞蛋白质芯片,原理,是将亲和素,、,抗,GST,多克隆抗体作为捕获抗体和生物素标记的质粒混合，将其点特定的载玻片上。,之后在玻片表面铺上一层兔网织红细胞裂解物系统,表达的目的蛋白通过,C,端融合的,GST,标签与芯片上的抗多克隆抗体结合而原位,固定于玻片表面,固定方法,2.,以,PCR,为底物合成无细胞蛋白质芯片,多重点样技术,(MIST),首先，将,PCR,产物作为模板采用芯片点样仪非接触式点样于氨丙基三乙氧基硅烷与,Ni,处理过的玻片表面随后，通过二次原位点样方式点上大肠杆菌抽提物系统，进行,His,标签蛋白以及,GFP,的表达,。,表达的,His,标签蛋白通过与芯片表面的,Ni,特异性结合而得以固定，经洗涤后可制备纯化的蛋白质阵列,固定方法,3.,核酸到蛋白芯片技术,(DAPA),芯片上固定含有,His,标签的,PCR,扩增产物形成的,DNA,阵列，并与固定有,Ni-NTA,的芯片面对面放置,。,两芯片基底之间加入,1,张含有无细胞转录,-,翻译偶联的大肠杆菌抽提物系统的渗透性膜。,DNA,芯片上的,PCR,产物经无细胞系统表达出带双,His,标签的融合蛋白，通过渗透性膜，迅速固定于芯片对应位置上。,最终形成对应于阵列的,蛋白质芯片,固定方法,蛋白质芯片的制备,蛋白质芯片的检测,Liquichip,液相蛋白芯片系统,蛋白质芯片的应用,蛋白质,芯片,探针标记检测法,无探针标记检测法,表面,增强激光解吸离子化技术,(,Surface enhanced laser desorption/ionization, SELDI),表面,等离子体共振检测技术,（,surface plasmon resonance, SPR,）,原子,力显微镜检测技术,（,atomic force microscope, AFM,）,荧光标记检测,同位素标记,检测,化学发光,检测,酶,免疫标记检测,胶体金,标记检测,蛋白质芯片的检测,荧光检测法,它是目前,最常使用,的检测方法。,特点,：简单；安全；高灵敏度；可以和基因芯片的扫描仪配合使用，这样可以提高分析效率，适用于大量数据的采集和分析。,蛋白质芯片的检测,标记法存在的问题：,标记过程繁琐,试剂价格昂贵,可能影响蛋白质或多肽的结构和功能,不同批次不同样本间的标记差异较大等,蛋白质芯片的检测,滚环扩增检测法,将一段寡核苷酸序列作为引物固定在待检测蛋白质的二抗上,然后用环状,DNA,分子和寡核苷酸进行杂交,杂交后用,DNA,聚合酶扩增信号,引发滚环扩增反应，从而显著放大了发生一系列反应的位点信号，从而达到检测要求,蛋白质芯片的检测,滚环扩增,探针标记检测法,无探针标记检测法,表面,增强激光解吸离子化技术,(,Surface enhanced laser desorption/ionization, SELDI),表面,等离子体共振检测技术,（,surface plasmon resonance, SPR,）,原子,力显微镜检测技术,（,atomic force microscope, AFM,）,荧光标记检测,同位素标记,检测,化学发光,检测,酶,免疫标记检测,胶体金,标记检测,蛋白质芯片的检测,生物质谱技术基本原理,样品分子离子化后，根据,离子间质荷比,（,m/z,）差异来分离并确定样品分子量。,Ionizer,Sample,+,_,Mass Analyzer,Detector,蛋白质芯片的检测,蛋白质芯片技术与质谱技术联用,表面增强激光解析,/,电离子化飞行时间质谱法（,SELDI-TOF-MS,）,利用激光脉冲辐射使芯片池中的分析物解析成荷电离子由于质荷比不同这些离子在磁场中的飞行时间长短不一由此绘出质谱图分析样品中各种蛋白质的含量和分子量信息,表面增强激光解吸离子化技术（,SELDI,）,蛋白质芯片的检测,SELDI-TOF-MS,示意图,蛋白质芯片的检测,对结合蛋白进行初步选择,将样品原位酶解,漂洗除去未结合的片段,用质谱（,SELDI,）技术识别结合蛋白质的性质,SELDI,检测法基本流程,原位酶解,漂洗,质谱检测,蛋白质芯片的检测,表面等离子共振生物传感器（,surface plasmon resonance,，,SPR,）检测,法,原理：利用全反射入射光与金属表面等离子发生共振的原理通过检测受体与配体结合或解离时的共振信号改变来获得,分子间亲和力特异度以及动力学常数,等信息,蛋白质芯片的检测,SPR,光学原理,核心部件：传感器芯片,金属薄膜，液体处理系统，光学系统,蛋白质芯片的检测,表面等离子共振原理,1.,消逝波,2.,等离子波,3.,SPR,的光学原理,蛋白质芯片的检测,1.,消逝波,这表示,沿,X,轴方向传播而振幅衰减,的一个波，这就是消逝波。全反射的光波会透过光疏介质约为光波波长的一个深度，再沿界面流动约半个波长再返回光密介质。光的总能量没有发生改变。透入光疏介质的光波成为消逝波。,界面,疏,密,蛋白质芯片的检测,2.,等离子波,等离子体,等离子体通常是指由密度相当高的自由正、负电荷组成的气体，其中正、负带电粒子数目几乎相等。,金属表面等离子波,把金属的价电子看成是均匀正电荷背景下运动的电子气体，这实际上也是一种等离子体。由于电磁振荡形成了等离子波。,蛋白质芯片的检测,2024/9/14,48,它利用,P,偏振光在玻璃与金属薄膜界面处发生全内反射时渗透到金属薄膜内的消失波,引发金属中的自由电子产生表面,等离子体波,当表面,等离子体波与,消失波的频率相等时,二者将发生共振,界面处的全反射条件将被破坏,呈现衰减全反射现象，入射光被金属表面电子吸收,使反射光能量急剧下降,3. SPR,光学原理,蛋白质芯片的检测,可以从反射光强的响应曲线看到一个,最小的尖峰,，此时对应的入射光波长为共振波长，对应的入射角为,SPR,角。,SPR,角随金表面折射率变化而变化，而折射率的变化又与,金表面结合的分子质量,成正比。这就是,SPR,对物质结合检测的基本原理。,SPR,光学原理,蛋白质芯片的检测,2024/9/14,50,SPR,对附着在金属薄膜表面的介质折射率非常,敏感，当,表面介质的属性改变或者附着量改变时，共振角将不同。因此，,SPR,谱（共振角的变化,vs,时间）能够反映与金属膜表面接触的体系的变化。,SPR,光学原理,蛋白质芯片的检测,51,SPR,典型响应模式,蛋白质芯片的检测,广泛应用于,蛋白质检测和蛋白,-,蛋白相互作用,等蛋白质组学研究，它能在保持蛋白质天然状态的情况下实时提供靶蛋白结合动力学及浓度变化等功能信息,SPR,现在已经成为一个比较成熟的多方面,研究受体,-,配基相互作用动力学,的检测工具。,蛋白质芯片的检测,蛋白质芯片的制备,蛋白质芯片的检测,Liquichip,液相蛋白芯片系统,蛋白质芯片的应用,蛋白质,芯片,Liquichip,液相蛋白芯片系统,液相芯片体系由许多不同的,小球体,为主要基质构成，每种小球体上固定有不同的探针分子，将这些小球体,悬浮于一个液相体系,中，就构成了一个液相蛋白质芯片系统,利用这个系统，我们可以对同一个样品中的多个不同的分子同时进行检测，这种检测技术我们称之为,xMAP(flexible Multi-Analyte Profiling),技术,。,检测反应的原理,球形基质，探针分子，被检测物，报告分子是液相蛋白芯片的,4,个主要构成部分,Liquichip,液相蛋白芯片系统,在液相系统中，为了区分不同的探针，每一种,用于标记探针的球形基质都带有一个,独特的色彩编号,。,在球形基质的制造过程当中，掺入了两种不同的红色分类荧光，根据这,两种红色分类荧光的比例不同,，可以把球形基质分为,100,种。,利用这,100,种球形基质，可以标记上,100,种不同的探针分子，同时对一个样本中的,100,种不同的目的分子进行检测,。,Liquichip,液相蛋白芯片系统,反应主要包括,3,个步骤：,（,1,） 探针分子的,固定,；,（,2,） 将这种标记好探针的球形基质,与样品反应,。探针可以与相应的目的分子特异性的结合，带有绿色报告荧光的报告分子也与目的分子特异性的结合，对反应进行定量；,（,3,） 反应结果的,检测,-,流式细胞仪,。,Liquichip,液相蛋白芯片系统,检测的原理,是使单个的球形基质通过检测通道，并使用,双色激光,进行检测。,红色激光,激发的是球形基质上的红色分类荧光，从而将各个不同的分析反应区分开来。,绿色激光,激发的是绿色报告荧光分子，从而确定球形基质上结合的目的分子的数量。,Liquichip,液相蛋白芯片系统,Liquichip,液相蛋白芯片系统,液相芯片的独特设计使得它拥有常规的蛋白质检测方法所不具备的特点：,1,、通量大,2,、灵活性好,3,、液相环境更有利于保持蛋白质的天然构象，也更有利于探针和被检测物的反应,4,、灵敏度高，信噪比好，只需要微量的样品即可进行检测,5,、操作简便，不需洗涤，耗时短,Liquichip,液相蛋白芯片系统,美国圣祖德儿童研究医院的,Dr.Richard,等人,使用,液相芯片,对,100ul,样本中的,15,种不同的细胞因子同时进行了精确的定量测定。,在测定过程中，,Dr. Richard,将,15,种不同的细胞因子的抗体分别标记在,15,种不同的球形基质,上，混合后加入到一个反应体系中，对同一样本中的,15,种细胞因子进行测定。,同时,用,ELISA,的方法,，分别对,15,种细胞因子进行检测。将两组结果进行对比后发现，趋势基本上一致，但是液相芯片可同时对多个分子进行检测，同时灵敏度和可靠性更好，操作更为简单。这样只需要使用微量的样品，在较短的时间内，就可以得到所需的数据。,Liquichip,液相蛋白芯片系统,蛋白质芯片的制备,蛋白质芯片的检测,Liquichip,液相蛋白芯片系统,蛋白质芯片的应用,蛋白质,芯片,
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